Đề tài “Khảo sát đột biến FLT3-ITD bằng kỹ thuật Delta-PCR” trên người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy để hoàn thiện quy trình xác định các dòng đột biến gen FLT3-ITD và đánh giá khả năng ứng dụng để chẩn đoán và theo dõi sau điều trị.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN FLT3-ITD BẰNG KỸ THUẬT DELTA-PCR Châu Thúy Hà1, Cao Văn Động1, Phù Chí Dũng1, Phan Thị Xinh2 TĨM TẮT 29 Mục tiêu: Triển khai kỹ thuật Delta-PCR khảo sát đột biến FLT3-ITD Đối tượng: Mẫu người bệnh có đột biến FLT3-ITD chẩn đoán kỹ thuật tạo dịng T-vector phối hợp với kỹ thuật giải trình tự Sanger Phương pháp nghiên cứu: Mô tả triển khai kỹ thuật Kết quả: Chúng thành công ứng dụng Delta-PCR (Polemerase Chain Reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi) để khảo sát đột biến FLT3-ITD (Fms Related Receptor Tyrosine Kinase 3-internal tandem duplication: đột biến lặp đoạn gen FLT3) Kích thước đoạn chèn xác định kỹ thuật Delta PCR người bệnh hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật tạo dịng giải trình tự Sanger Kỹ thuật định danh dòng xác định tỉ lệ dòng đột biến FLT3-ITD với giới hạn phát thấp đến 0,1% Kết luận: Kỹ thuật ưu việc xác định dịng minor, cơng cụ tiềm ứng dụng theo dõi tồn lưu tế bào ác tính mang đột biến FLT3-ITD Từ khóa: FLT3-ITD, Delta-PCR Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Đại Học Y dược TPHCM Chịu trách nhiệm chính: Châu Thúy Hà SĐT: 0939.162.969 Email: drthuyha@gmail.com Ngày nhận bài: 01/8/2022 Ngày phản biện khoa học: 01/8/2022 Ngày duyệt bài: 15/9/2022 SUMMARY DETECTING FLT3-ITD MUTATIONS BY USING DELTA-PCR TECHNIQUE Objectives: To perform Delta-PCR technique in detecting FLT3-ITD mutations Subjects: Patient samples with types of FLT3-ITD mutations were diagnosed by Tvector cloning associated with Sanger sequencing Method: Prospective case series Results: We have successfully applied DeltaPCR technique in detecting FLT3-ITD mutations The size of ITDs identified by Delta PCR in all of patients were similar to the results of cloning and Sanger sequencing techniques This method could identify FLT3ITD mutant clones and determine FLT3 allel ratio with limit of detection as low as 0.1% Conclusion: Delta-PCR could detect FLT3ITD mutant clones at low level, so it will be useful device in monitoring mesurable disease postreatment Keywords: FLT3-ITD, Delta-PCR I ĐẶT VẤN ĐỀ Đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu cho phép đánh giá đáp ứng điều trị, phát sớm đợt tái phát, từ xác định người bệnh cần tái điều trị sớm hay thay đổi phác đồ điều trị Một đột biến gen xuất với tần suất cao bạch cầu cấp dòng tủy FLT3-ITD Do đó, dùng đột biến điểm để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính FLT3-ITD cịn tồn lưu thời điểm dị ghép tế bào gốc dự báo nguy tái phát cao có ý nghĩa thống kê 257 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU so với nhóm FLT3-ITD trước ghép [1] Tuy nhiên, đột biến FLT3-ITD thường không ổn định, thời điểm tái phát, đột biến biến biểu kiểu lặp đoạn khác với ban đầu [2] Mặt khác, đột biến FLT3-ITD biểu nhiều dịng lúc chẩn đốn, dịng minor khơng phát kỹ thuật giải trình tự, kháng với điều trị gây nên tình trạng tái phát [3] Sự đa dịng tính biến thiên dịng đột biến FLT3-ITD địi hỏi cần có kỹ thuật đủ nhạy đặc hiệu để khảo sát đầy đủ dòng đột biến FLT3-ITD thời điểm chẩn đốn, đồng thời, theo dõi động học dòng sau điều trị Do đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Khảo sát đột biến FLT3-ITD kỹ thuật DeltaPCR” người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy để hồn thiện quy trình xác định dịng đột biến gen FLT3-ITD đánh giá khả ứng dụng để chẩn đoán theo dõi sau điều trị II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu: Mẫu người bệnh bạch cầu cấp dòng tủy chẩn đốn có đột biến FLT3-ITD kỹ thuật Sanger kỹ thuật tạo dòng T-vector Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm: Nghiên cứu thực Khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu Huyết học Thời gian: Từ 10/2021 đến 4/2022 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu triển khai kỹ thuật Kỹ thuật Delta-PCR gồm bước sau: - Ly trích DNA từ 200 uL mẫu tủy xương chứa ống EDTA với kit Promega (Mỹ) 258 - Thực phản ứng khuếch đại chuỗi Takara Taq (Mỹ) với mồi xuôi mồi ngược, mồi tự thiết kế điều kiện bắt cặp mồi thử 58oC, 60oC 62oC - Điện di mao quản máy 3500, ghi nhận kích thước diện tích đỉnh đặc hiệu Các bước tiến hành nghiên cứu - Thử điều kiện phối hợp bắt cặp mồi mẫu người bệnh có đột biến FLT3-ITD xác định giải trình tự Sanger - So sánh kết định danh đoạn chèn với kỹ thuật tạo dịng phối hợp giải trình tự Sanger mẫu người bệnh có đột biến FLT3-ITD - Xác định giới hạn phát mẫu có tỉ số alen FLT3-ITD/WT mức 5%, 3%, 1%, 0,1% Thu thập xử lý số liệu Dữ liệu giải trình tự sau phân tích phần mềm GeneMapper tiến hành tổng hợp báo cáo số liệu III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Dựa tham khảo báo Arab cộng [4], thiết kế số mồi dùng phản ứng với trình tự F1: 5’-TGCAGAACTGCCTATTCC-3’, F2: 5’-GCCTATTCCTAACTGACT-3’, R1:5’-6FAM-CCTGGATTGAGACTCCTGTTTTG3’; R2:5’-6FAM-GCTGTCCTTCCACTATACTGT3’;R3:5’-6FAM-AGAGAAGAAGGCATGGGTGGG3’, mồi F1 F2 intron 13, mồi R1, R2 R3 intron 15 Thử điều kiện phản ứng PCR mẫu DNA người bệnh 14354 có kiểu đột biến FLT3-ITD c.1815_1816ins36bp c.1832_1833ins57bp xác định trước giải trình tự Sanger, với phối hợp mồi với kích TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 thước băng FLT3-WT mục tiêu (1) F1/R1 (354 bp), F1/R2 (398 bp); (2) F1/R1 (354 bp), F1/R3 (453 bp); (3) F1/R2 (398 bp), F1/R3 (453 bp); (4) F2/R1 (344 bp), F2/R2 (388 bp); (5) F2/R1 (344 bp), F2/R3 (443 bp); (6) F2/R2 (388 bp), F2/R3 (443 bp) Thực PCR với điều kiện nhiệt độ bắt cặp mồi A: 58oC, B: 62oC, C: 60oC Chúng thu sản phẩm PCR hình Hình Kết điện di thạch sản phẩm thử điều kiện Kết cho thấy với phối hợp mồi F2 R1 + R2 (4); F2 R1 + R3 (5) nhiệt độ bắt cặp mồi 62oC (B) 60oC (C), phản ứng PCR tạo sản phẩm FLT3-WT có hình ảnh điện di cho băng rõ, đậm Tiếp tục đem sản phẩm 4B, 4C, 5B, 5C điện di mao quản, thu kết hình Hình Kết điện di mao quản sản phẩm thử điều kiện Chúng nhận thấy phối hợp 5B, đỉnh sản phẩm FLT3-WT có kích thước tương đối nhau, chúng tơi chọn phối hợp mồi F2 R1 + R3 với nhiệt độ bắt cặp 62oC 259 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Định danh dòng xác định tỉ lệ dòng đột biến FLT3-ITD Thực Delta PCR với điều kiện chuẩn hóa cho mẫu người bệnh có kiểu đột biến FLT3-ITD xác định kỹ thuật tạo dịng T-vector phối hợp giải trình tự Sanger, ghi nhận kết bảng Bảng So sánh kết thu Delta PCR so với phương pháp tạo dịng giải trình tự Sanger Mã NB Delta PCR Tạo dòng + Sanger 10045 FLT3-WT FLT3-ITD1 ins18bp FLT3-WT FLT3-ITD1 c.1800_1801ins18bp FLT3-ITD2 ins60bp FLT3-ITD2 c.1803_1804ins60bp FLT3-WT FLT3-ITD1 ins24bp FLT3-WT FLT3-ITD1 c.1818_1819ins24bp FLT3-ITD2 ins69bp FLT3-ITD2 c.1824_1825ins69bp FLT3-WT FLT3-ITD1 ins21bp FLT3-ITD2 ins24bp FLT3-ITD3 ins27bp FLT3-ITD4 ins60bp FLT3-ITD5 ins63bp FLT3-WT FLT3-ITD1 c.1770_1771ins21bp FLT3-ITD2 c.1842_1843ins63bp FLT3-WT FLT3-WT FLT3-ITD1 ins21bp FLT3-ITD2 ins81bp FLT3-ITD1 c.1794_1795ins21bp FLT3-ITD2 c.1827_1828ins81bp 10877 12196 12295 Như vậy, so với phương pháp tạo dịng giải trình tự Sanger, kỹ thuật Delta PCR cho kết định dòng đột biến tương đồng, nhiên hạn chế kỹ thuật khơng cho biết vị trí chèn đoạn Trong trường hợp người bệnh 12196, Delta PCR ghi nhận thêm dòng minor khác chèn đoạn 24, 27 60 bp với khoảng delta đặc hiệu, điều không phát Sanger Mặt khác, với Delta PCR, chúng tơi xác định tỉ số FLT3-ITD/ FLT3-WT dựa tỉ số diện tích đỉnh hình 260 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Hình Kết Delta PCR người bệnh nghiên cứu Xác định giới hạn phát kỹ thuật Delta-PCR khảo sát đột biến FLT3-ITD Mẫu người bệnh có kiểu đột biến FLT3-ITD dị hợp tử dùng phương pháp tạo dòng T-vector để tạo dòng tế bào mang kiểu gen FLT3-ITD FLT3-WT Ly trích DNA FLT3-ITD FLT3-WT từ plasmid dịng Tính số FLT3-ITD FLT3-WT thu nhận Sau chúng tơi pha lỗng FLT3-ITD FLT3-WT theo mức tỉ số alen 5%, 3%, 1%, 0,1% Phản ứng Delta-PCR thực lặp lại 20 lần mức nồng độ này, để khảo sát giới hạn phát Delta-PCR Nếu có từ 95% số lần khảo sát trở lên cho kết dương tính giới hạn phát xác nhận Kết ghi nhận Delta-PCR theo dõi tồn lưu đến mức tỉ số alen 0,1% IV BÀN LUẬN Với phối hợp mồi F2 R1 + R3 điều kiện phản ứng PCR có nhiệt độ bắt cặp 62oC, thu đỉnh FLT3-WT, đỉnh FLT3-ITD1 đỉnh FLT3-ITD2 với diện tích cặp đỉnh tương 261 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU đồng nhau, khơng có xuất đỉnh sản phẩm không đặc hiệu, kiểu FLT3ITD đồng với kiểu chèn đoạn xác định phương pháp tạo dịng T vector phối hợp giải trình tự Sanger Điều cho thấy phối hợp mồi điều kiện bắt cặp phù hợp để đạt hiệu suất PCR mong muốn Nhiệt độ bắt cặp nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu Arab cộng [4] Điều đáng lưu ý quy trình thực kỹ thuật đơn giản nhanh nhiều so với quy trình tạo dịng giải trình tự Do triển khai dễ dàng phòng xét nghiệm, đồng thời đạt lợi ích hiệu chi phí cho người bệnh Tuy nhiên, mặt hạn chế kỹ thuật khơng xác định vị trí chèn đoạn Điều tương đồng với nghiên cứu Arab cộng [4] Dù vậy, kỹ thuật cho biết diện tích đỉnh, nhờ xác định tỉ số alen đồng thời Điểm ưu vượt trội kỹ thuật Delta xác định dòng minor người bệnh, tương tự trường hợp 12196, Delta khảo sát thêm dòng đột biến FLT3-ITD minor kỹ thuật Sanger khơng thể khảo sát Chính dịng trở nên trội tái phát [5] Chúng tơi nhận thấy Delta-PCR khảo sát đột biến FLT3-ITD với tỉ số alen khoảng 0,1% Các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật nhạy đặc hiệu kỹ thuật fragment tiêu chuẩn, ưu việc xác định dòng minor thời điểm chẩn đoán theo dõi sau điều trị [4] Fragment khảo sát đến tỉ số alen từ 3-5% Sanger xác định tỉ số alen đột biến cao hơn, từ 10-20% [6] V KẾT LUẬN Kỹ thuật Delta-PCR định danh dịng xác định tỉ lệ dòng đột biến 262 FLT3-ITD, đặc biệt ưu việc xác định dịng minor, cơng cụ tiềm giúp theo dõi tồn lưu tế bào ác tính mang đột biến FLT3-ITD TÀI LIỆU THAM KHẢO Helbig, G., et al., Pre-transplant FLT3/ITD status predicts outcome in FLT3-mutated acute myeloid leukemia following allogeneic stem cell transplantation Annals of hematology, 2020 99(8): p 1845-1853 Warren, M., et al., Clinical impact of change of FLT3 mutation status in acute myeloid leukemia patients Modern Pathology, 2012 25(10): p 1405-1412 Ding, L., et al., Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by wholegenome sequencing Nature, 2012 481(7382): p 506-510 Arab, M., et al., Comparison of Delta-PCR and Conventional Fragment Analysis for the Detection of FLT3-ITD Mutations in Paired Diagnosis-Relapse Samples of Patients with Acute Myeloid Leukemia JOURNAL OF ADVANCES IN MEDICAL AND BIOMEDICAL RESEARCH, 2019 27(123): p 38-44 Beierl, K., et al., Detection of minor clones with internal tandem duplication mutations of FLT3 gene in acute myeloid leukemia using delta-PCR Diagn Mol Pathol, 2013 22(1): p 1-9 Lee, G., et al., Fragment Analysis for Detection of the FLT3 -Internal Tandem Duplication: Comparison with Conventional PCR and Sanger Sequencing Laboratory Medicine Online, 2017 7: p 13 ... biến FLT3-ITD minor kỹ thuật Sanger khảo sát Chính dịng trở nên trội tái phát [5] Chúng nhận thấy Delta-PCR khảo sát đột biến FLT3-ITD với tỉ số alen khoảng 0,1% Các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật. .. kỹ thuật giải trình tự, kháng với điều trị gây nên tình trạng tái phát [3] Sự đa dịng tính biến thiên dịng đột biến FLT3-ITD địi hỏi cần có kỹ thuật đủ nhạy đặc hiệu để khảo sát đầy đủ dịng đột. .. Delta-PCR khảo sát đột biến FLT3-ITD Mẫu người bệnh có kiểu đột biến FLT3-ITD dị hợp tử dùng phương pháp tạo dòng T-vector để tạo dòng tế bào mang kiểu gen FLT3-ITD FLT3-WT Ly trích DNA FLT3-ITD