Phát hiện Chlamydia Trachomatis bằng kỹ thuật khuếch đại gen trên bệnh nhân viêm khớp phản ứng docx

TCNCYH 34 (2) - 2005 17 Phát hiện Chlamydia Trachomatis bằng kỹ thuật khuếch đại gen trên bệnh nhân viêm khớp phản ứng Bạch Khánh Hòa (1) , Trần Thị Minh Hoa (2) (1) Trờng Đại học Y Hà Nội (2) Bệnh viện Bạch Mai Viêm khớp phản ứng (VKPƯ) là một bệnh viêm màng hoạt dịch khớp vô khuẩn thờng xẩy ra sau một nhiễm khuẩn nào đó trong cơ thể. Cơ chế bệnh sinh cha rõ, hiện nay có nhiều nghiên cứu đề cập đến vai trò của các kháng nguyên vi khuẩn nh yersinia, Salmonella, Shigella, Chlamydia trachomatis trong khởi phát và duy trì bệnh VKPƯ. Để tìm hiểu mối liên quan của Chlamydia trachomatis với bệnh VKPƯ, chúng tôi tiến hành xét nghiệm PCR trong dịch khớp và nớc tiểu của 52 bệnh nhân VKPƯ đợc khám và điều trị tại khoa khớp bệnh viện Bạch mai từ tháng 8/2001 đến tháng 8/2003. Kết quả nghiên cứu ADN của CT đã đợc xác định trong 53,8% mẫu bệnh phẩm dịch khớp và 42,2% ở nớc tiểu của các bệnh nhân nghiên cứu. So sánh với tỷ lệ kháng nguyên lipopolyarcaride (LPS) dơng tính 38.5 % mẫu nớc tiểu,kháng thể IgG đặc hiệu với Chlamydia trachomatis(CT) dơng tính 44.2% trong huyết thanh và 34.6% trong dịch khớp. Nh vậy xét nghiệm AND của CT ở dịch khớp có độ nhạy cao trong chẩn đoán bệnh VKPƯ. I. Đặt vấn đề Viêm khớp phản ứng (VKPƯ) là tình trạng viêm màng hoạt dịch khớp vô khuẩn thờng xuất hiện sau một nhiễm khuẩn ở một cơ quan nào đó của cơ thể. Viêm khớp phản ứng là bệnh hay gặp nhất trong nhóm bệnh lý cột sống thể huyết thanh âm tính [1,2,6]. Bệnh sinh của bệnh VKPƯ cha rõ nhng có nhiều bằng chứng chứng tỏ một số kháng nguyên vi khuẩn (Chlamydia trachomatis, yersinia, Salmonella ) giữ vai trò quan trọng trong bệnh nguyên và đợc coi là một trong những tác nhân khởi động và duy trì phản ứng viêm khớp mạn tính trong bệnh viêm khớp phản ứng [4,7]. Hiện nay bệnh VKPƯ đợc quan tâm nghiên cứu ở các nớc Tây Âu và Mỹ do tỷ lệ các bệnh lý lây truyền qua đờng tình dục ngày càng tăng [4,9]. ở nớc ta, viêm khớp phản ứng cũng khá thờng gặp trong nhóm bệnh lý cột sống và chiếm tỷ lệ 5.4% bệnh nhân khớp đến khám và điều trị tại khoa Khớp bệnh viện Bạch mai. Tỷ lệ nhiễm chlamydia trachomatis đờng tiết niệu sinh dục ở bệnh nhân VKPƯ là 38.1%, cao hơn hẳn nhóm bệnh nhân viêm cột sống dính khớp là 29%, nhóm các bệnh khớp khác là 5.4% và ở ngời bình thờng là 3.3% [2]. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm mục đích bớc đầu tìm hiểu mối liên quan của CT đối bệnh nhân VKPƯ và đa ra xét nghiệm chẩn đoán có độ nhạy cao giúp cho các bác sỹ lâm sàng có chỉ định sớm và chính xác trong điều trị bệnh VKPƯ. II. Ph ơng pháp nghiên cứu Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu 52 bệnh nhân VKPƯ đợc khám, chẩn đoán và điều trị nội trú hoặc ngoại trú tại khoa Khớp bệnh viện Bạch mai từ tháng 8/2001 đến tháng 8/2003. Các bệnh nhân đợc chẩn đoán theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Amor (4). 2.1. Lâm sàng: theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Amor TCNCYH 34 (2) - 2005 2.2. Xét nghiệm: Bệnh nhân đợc xét nghiệm xác định kháng nguyên LPS của CT theo phơng pháp Hexagon [8] (Immunochromatographic), tìm kháng thể IgG đặc hiệu CT trong huyết thanh và dịch khớp của bệnh nhân VKPƯ. Chúng tôi chọn những bệnh nhân có phản ứng dơng tính với các xét nghiệm trên để tiến hành xét nghiệm ADN trong dịch khớp và nớc tiểu. *Kỹ thuật PCR xác định ADN của CT trong bệnh phẩm dịch khớp và nớc tiểu của bệnh nhân nghiên cứu (10) - Tách ADN bằng kit Quiagen (Đức) cho cả dịch khớp và nớc tiểu. - Phản ứng PCR: Thành phần cho một mẫu 25àl gồm: dNTP 200àM, 10mM Tris-HCL, 50mM KCL, 1,5mM MgCl 2 , 2UI Taq ADN polymerase, 1àl mồi xuôi và 1àl mồi ngợc, 3àl ADN cần xét nghiệm. - Trình tự mồi: 5CTGCAGCCTCCGTAGAGTCTGGGCAGTGTC 3 Kháng thể IgG đặc hiệu CT dơng tính ở 23/52 mẫu bệnh phẩm huyết thanh bệnh nhân chiếm tỷ lệ 44.2%, và tỷ lệ này ở bệnh phẩm dịch khớp là 34.6% (15/52 trờng hợp). Trong đó có 17 bệnh nhân (32.5%) có kháng thể IgG đặc hiệu cho CT dơng tính trong cả 2 loại bệnh phẩm là huyết thanh và dịch khớp (biểu đồ 1) Xét nghiệm PCR cho thấy có 28/52 xác định đợc sự có mặt của trong mẫu bệnh phẩm dịch khớp chiếm tỷ lệ 53,2% trong khi đó chỉ có 22/52 (42,2%) xác định đợc ADN của CT trong nớc tiểu. 5 AAGCTTTTCTTAACAATGCAAATGAGATAG 3 - Chu kỳ khuyếch đại: 3phút ở 95 o C, 35 chu kỳ: 95 o C/ 1phút, 52 o C/ 1phút, 72 o C/ 1phút, cuối cùng là 72 o C/ 10 phút và 4 o C. - Điện di sản phẩm PCR trên gen agarose 2%, kích thớc của sản phẩm là 96bp. III. Kết quả Trong thời gian từ tháng 8/2001 đến tháng 8/2003, chúng tôi đã tiến hành thu thập đợc 52 bệnh nhân đợc chẩn đoán VKPƯ tại khoa khớp, bệnh viện Bạch mai. Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân nghiên cứu là 28.8 10.5 tuổi (bệnh nhân ít tuổi nhất là 12 tuổi và bệnh nhân nhiều tuổi nhất là 57 tuổi), bệnh nhân nam giới chiếm tỷ lệ 57,7%. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu ADN tách từ dịch khớp và nớc tiểu: 1 mẫu gồm a: dịch khớp; b: nớc tiểu Thời gian bị bệnh trung bình là 17.4 +12.5 tháng (bệnh nhân có thời gian mắc bệnh ngắn nhất là 1tháng, và bệnh nhân có thời gian mắc bệnh dài nhất là 4 năm). IV. Bàn luận Tỷ lệ kháng nguyên LPS dơng tính 38.5% ở bệnh phẩm nớc tiểu, kết quả này cũng tơng tự nh các nghiên cứu của Ferris D. G [8,9], và Dougados [5]. Tỷ lệ này cao hơn hẳn trong các bệnh khớp khác là 5.4% và ngời bình thờng là 3.3% (2). Tỷ lệ kháng thể IgG đặc hiệu với CT trong bệnh phẩm huyết thanh và trong dịch khớp của bệnh nhân VKPƯ là 44,.2%, và 34.6%. Bệnh nhân VKPƯ ở nhóm có CT dơng tính chủ yếu xẩy ra ở 18 TCNCYH 34 (2) - 2005 19 bệnh nhân nam giới, có thời gian mắc bệnh kéo dài hơn, có tiền sử nhiễm khuẩn đờng tiết niệu sinh dục cũng nh biểu hiện viêm đờng niệu dục tại thời điểm nghiên cứu nhiều hơn và bệnh ở giai đoạn hoạt động so với nhóm bệnh nhân CT âm tính. Điều này gợi ý CT có vai trò nhất định nào đó trong quá trình khởi phát và duy trì bệnh VKPƯ. Đặc biệt có 53,2% mẫu bệnh phẩm dịch khớp của bệnh nhân nghiên cứu xác định đợc sự có mặt ADN của CTđã góp phần vào việc nghiên cứu vai trò của Chlamdia trachomatis trong qua trình viêm khớp của bệnh VKPƯ. Nh vậy xét nghiệm này cũng giúp cho các nhà lâm sàng học có chẩn đoán sớm và chính xác khi kết hợp với các triệu chứng chính của lâm sàng. V.Kết luận Kết quả nghiên cứu 52 bệnh nhân cho thấy 38.5 % mẫu nớc tiểu có kháng nguyên LPS của CT. Kháng thể IgG đặc hiệu CT dơng tính ở 44.2% mẫu huyết thanh và 34.6% mẫu dịch khớp. Đặc biệt ADN của CT dơng tính 53,2% trong dịch khớp và 42,2% trong nớc tiểu của các bệnh nhân nghiên cứu. Nh vậy xét nghiệm ADN của CT có tỷ lệ dơng tính cao hơn cả trong những xét nghiệm chẩn đoán cho bệnh VKPƯ. Tài liệu tham khảo 1. Trần Ngọc Ân: Bệnh khớp. Nhà xuất bản Y học, 1991: 96-109. 2. Trần Thị Minh Hoa: Tình trạng nhiễm Chlamydia trachomatis đờng tiết niệu sinh dục ở bệnh nhân nhóm bệnh lý cột sống thể huyết thanh âm tính. Luận văn Thạc sỹ y học, Trờng đại học Y Hà nội, 2001. 3. Vũ Thị Nhung: Bớc đầu thăm dò tình hình nhiễm Chlamydia trachomatis. Y dơc học thành phố Hồ Chí Minh,1995 (12):44-47. 4. Amor B: Reiters syndrome and reactive arthritis. Clin Rheumatol, 1983, 2: 315-319. 5. Dougados M: The concept of reactive arthritis. Presse Medicine, 1997 Feb 22; 26(5): 204-206. 6. Bas S, Cungnigham T, et al.,: The value of isotype determination of serum antibodies against Chlamydia for the diagnosis of Chlamydia reactive arthritis. British Journal of Rheumatology 1996, 35: 542-547. 7. Espinoza LR, Aguilar JL, Guitierrez F: Chlamydia-induced reactive arthritis . Cli Exp Rheumatol 1997 Mar- Apr, 15 (2): 169-174. 8. Ferris DG, et al.: Hexagon Chlamydia . Product Manual, Human GmbH 1997 Feb: 3-20. 9. Ferris DG: Sensitivity of rapid antigen detection test for Chlamydia trachomatis screening. JAMA, 1995 Mar 22-29: 273 (12): 917-918. 10. Patrick JB, Herve CG, Alan PH: Comparison of synovial tissue and synovial fluid as the source of nucleic acids for detection of Chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction. Arthritis & Rheumatism 1996, 35 (10): 1740-1746. TCNCYH 34 (2) - 2005 20 Summary Detection of Chlamydia trachomatis by PCR with reactive arthritis Chlamydia trachomatis has been shown to be induce reactive arthritis in man specially after sexually acquired genitourinary infection To determine the connection between Chlamydia trachomatis with reactive arthritis, in this study we examined antigen Chlamydia trachomatis lipopolysarcaride, antibody IgG, and DNA chlamydia trachomatis in samples (urine, sera, and synovial fluid) from 52 patients who were diagnosed and treated in Rheumatology department, Bachmai hospital from August 2001 to August 2003. As results we found that 38.5% urine samples positve with antigen LPS, antibody IgG positive in 44.2% sera samples and 34.6% synovial fluid samples. Specially DNA chlamydia trachomatis was detected in 53.2% synovial fluid samples and 42,2% urine samples positve. This results will contribute to determine the role of DNA-Chlamydia trachomatis in reactive arthritis diagnostic . 2005 17 Phát hiện Chlamydia Trachomatis bằng kỹ thuật khuếch đại gen trên bệnh nhân viêm khớp phản ứng Bạch Khánh Hòa (1) , Trần Thị Minh Hoa (2) (1) Trờng Đại học Y Hà Nội (2) Bệnh viện. khởi động và duy trì phản ứng viêm khớp mạn tính trong bệnh viêm khớp phản ứng [4,7]. Hiện nay bệnh VKPƯ đợc quan tâm nghiên cứu ở các nớc Tây Âu và Mỹ do tỷ lệ các bệnh lý lây truyền qua. ta, viêm khớp phản ứng cũng khá thờng gặp trong nhóm bệnh lý cột sống và chiếm tỷ lệ 5.4% bệnh nhân khớp đến khám và điều trị tại khoa Khớp bệnh viện Bạch mai. Tỷ lệ nhiễm chlamydia trachomatis