Luận văn xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố ciguatoxins trong chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép

3 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ciguatera (CFP) dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) ăn phải lồi cá rạn san hơ vùng biển nhiệt đới cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin (CTX) dẫn xuất độc tố Độc tố CTXs sản sinh loài vi tảo sống đáy Gambierdiscus toxicus tích lũy qua chuỗi thức ăn biển Đến phát 400 lồi cá rạn có nguy ngộ độc CFP Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), CFP mối lo ngại lớn giới mặt an toàn thực phẩm (ATTP), độc tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng năm), gánh nặng dịch vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng CFP gây nên tâm lý hoang mang, bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại kinh tế ngành công nghiệp thuỷ hải sản nội địa xuất nhiều quốc gia Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP xảy Nam Thái bình dương, Caribbe Ấn Độ, đến lan khắp châu Á, châu Âu Bắc Mỹ Ở Mỹ, từ thập niên 1970 đến nay, vụ ngộ độc CFP tăng gấp lần lên 250 vụ năm Trong đó, nhập phần lớn hải sản, Hồng Kông năm xảy hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụ vào năm 1980 Tỷ lệ mắc phân bố CFP giới ngày gia tăng, theo thống kê FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộ độc CFP ghi nhận, phần lớn tập trung vùng biển nhiệt đới cận nhiệt đới Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàng năm ghi nhận rải rác vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy chủ yếu vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,… Năm 2012, hội thảo ATTP EU báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờ CTXs cá Hồng nguồn gốc Việt Nam Đến tháng 5/2017, EU thức cảnh báo ATTP mặt hàng cá Hồng xuất Việt Nam Dù nhiều quan tâm, hướng nghiên cứu độc tố CTXs giới vấp phải trở ngại lớn phương pháp nguồn chất chuẩn quý CTXs hợp chất polyete tan dung môi hữu cơ, bền nhiệt (nhiệt độ cao đóng băng) bền pH (axit hay kiềm), không nhạy với ánh sáng tia cực tím, nên khơng thể phân biệt trực quan Gần đây, nhóm nhà khoa học Nhật Bản cơng bố kết phát triển phương pháp phân tích độc tố CTXs mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS) Tuy nhiên đến chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu độc tố Đơng Nam Á, gây khó khăn việc giám sát cảnh báo vấn đề ATTP Hơn nữa, trình nghiên cứu CFP Việt Nam gặp nhiều khó khăn đặc tính sinh học lồi, nguồn gốc, chế tích lũy lan truyền độc tố chuỗi thức ăn biển phức tạp, đặc biệt chưa có phương pháp phân tích phù hợp thiếu trang thiết bị phân tích đại chuyên sâu chưa tiếp cận, cập nhật phương pháp phân tích giới Hiện nay, Viện Hải dương học xây dựng quy trình phân tích độc tố cá Hồng chưa có quy trình phân tích lồi Chình biển, vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố Ciguatoxins Chình biển phương pháp sắc ký lỏng đầu dị khối phổ kép (LC/MS-MS)” Nội dung phân tích độc tố CTXs đề tài sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật Nhật Bản Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm cần hiệu chỉnh phù hợp với điều kiện hệ thiết bị có Việt Nam thành phần hố sinh Chình biển để đảm bảo độ tin cậy tính xác kết phân tích Mục tiêu nghiên cứu - Dựa quy trình phân tích Ciguatoxins Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh để xây dựng quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trang thiết bị Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh Chình biển để đảm bảo độ tin cậy tính xác kết phân tích Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu - 14 cá thể cá Chình, thuộc lồi Chình biển (cá Lịch vân vịng, cá Lịch vân sóng, cá Lịch chấm tia, cá Lịch mõm trắng) thu mua đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), cá thể tách lấy phần gan 3.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết rút: dung môi Acetone lựa chọn để hịa tan chất phân tích, tách chiết chất phân tích khỏi mẫu - Phương pháp tinh sạch: thử nghiệm điều kiện tinh theo phương pháp chiết lỏng – lỏng phương pháp chiết ly pha rắn SPE - Xác định độc tố CTX: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS) - Xử lý số liệu thực nghiệm, đánh giá hiệu quy trình thực nghiệm phương pháp thống kê F-test, T-test phần mềm Excel Nội dung nghiên cứu - Chiết tách tinh độc tố CTX từ số phận Chình biển (cơ, gan) - Lựa chọn pha tĩnh tối ưu để xác định độc tố CTX mẫu chiết phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS) - Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố CTX phương pháp LC/MS-MS - Đánh giá kết quy trình thực nghiệm sở so sánh, đối chiếu với kết kiểm chứng PTN Nhật Bản Ý nghĩa khoa học đề tài nghiên cứu Trên sở vận dụng tiến khoa học - kỹ thuật công nghệ giới, hướng nghiên cứu mới, tiên phong Việt Nam Mặt khác, kết đề tài dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thực phẩm biển, tiền đề cần thiết để có cơng trình cơng bố quốc tế độc tố CTX sinh vật biển Việt Nam Ý nghĩa thực tiễn đề tài nghiên cứu Trước năm 2010, kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn (single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) áp dụng để phát độc tố Sau đó, với tiến khoa học kỹ thuật, sắc ký lỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrospray ionization – ESI) ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lý chọn lọc phân tử proton hóa [M+NH4]+ [M+H]+ để cắt phân tử nước lọc khối tứ cực thứ (Q2) chế độ ghi phổ nhiều ion chọn lọc (Multi Reaction Monitoring, MRM) Tuy nhiên, ion sau phân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát nồng độ tương đương 0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP US FDA) Khắc phục nhược điểm này, nhóm nghiên cứu Yogi phát triển thành công phương pháp sử dụng LC/MS-MS với chế độ SIM MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắt cặp phân tử CTX với số ion dương âm (H+, Na+, K+, NH4-, SO42-, OH-…) Phương pháp đánh giá có ưu độ nhạy tính ứng dụng phân tích định lượng độc tố CTXs, đầu dị khối phổ độ phân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký chứng minh khả phát đồng phân độc tố CTXs điều kiện thiếu vắng chất chuẩn Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào thông số kỹ thuật hệ thống thiết bị LC/MS-MS, địi hỏi q trình thăm dị, thử nghiệm nhằm tối ưu hố quy trình phân tích bao gồm công đoạn tách chiết, loại tạp chất mẫu, điều kiện phản ứng (nhiệt độ, áp suất…) hệ dung mơi pha động (đẳng dịng hay đổi dịng), cột sắc ký… phù hợp để có LOD LOQ tốt phân tích độc tố CTXs Báo cáo trình bày quy trình thực nghiệm tối ưu hố phương pháp phân tích độc tố CTXs mẫu Chình biển sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ kép Shimadzu LCMS 8040 phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN An tồn thực phẩm mơi trường (khu vực miền Trung) Viện Hải dương học CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGỘ ĐỘC CIGUATERA 1.1.1 Khái niệm Ciguatera Fish Poisoning (CFP) dạng ngộ độc thực phẩm biển người tiêu thụ loài cá rạn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới tích lũy độc tố Ciguatoxin (CTX) Độc tố CTX biết đến có nguồn gốc từ lồi vi tảo giáp sống đáy Gambierdiscus toxicus [2] Theo báo cáo FAO cơng bố năm 2004, 400 lồi cá biết đến nơi di truyền ngộ độc CFP 1.1.2 Đối tượng gây ngộ độc Con người cho nhạy cảm với độc tố CTX [3] Dân cư vùng biển nhiệt đới cận nhiệt đới có khả ảnh hưởng cao tần suất cao tiêu thụ loài cá độc Tuy nhiên, gia tăng mức tiêu thụ sản phẩm thủy sản với gia tăng giao thông liên khu vực sản phẩm thủy sản mở rộng phạm vi địa lý vụ ngộ độc CFP [3] 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng “Ciguatera” hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu dựa tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô biểu lâm sàng xác định triệu chứng tiêu hóa thần kinh [2] Sự khác biệt địa lý gây khác biệt triệu chứng bệnh nhân Khởi phát triệu chứng CFP thường bắt đầu vấn đề đường tiêu hóa buồn nơn, nơn, tiêu chảy đau bụng vòng 12 sau ăn phải cá có độc tố Các triệu chứng thường thuyên giảm vòng 24 [2] Các vấn đề tim mạch xuất suốt giai đoạn cấp tính này, thường nhịp tim chậm hạ huyết áp Từ vài đến hai tuần sau ngộ độc cá ciguatera, vấn đề thần kinh đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê ngứa ran vùng ngoại vi tứ chi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với vật thể lạnh cảm thấy nóng ngược lại),… xuất [2] Các triệu chứng thần kinh chủ quan khác báo cáo vị kim loại, ngứa, đau khớp đau (đau đặc biệt chân) cảm giác lung lay [2] Có thể xuất triệu chứng chấn động não đến 10 ngày sau bị ngộ độc Đau đầu nhiều vị trí, đau dội kéo dài biểu ngộ độc ciguatera Những triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh trung ương (tê liệt, điều hịa, chống váng nhầm lẫn) thường dấu hiệu trường hợp nghiêm trọng Một loạt triệu chứng rối loạn thần kinh báo cáo sau ngộ độc ciguatera bao gồm mệt mỏi, lo lắng, trầm cảm, hysteria, rối loạn trí nhớ, thiếu hiệu tinh thần Vấn đề tiêu hóa cấp tính thường giải vịng ngày rối loạn tim mạch đảo ngược vòng 48 – 72 Sự phục hồi từ triệu chứng thần kinh lâu dự đốn hơn, từ t̀n đến tháng Ngứa, đau khớp mệt mỏi kéo dài nhiều tháng nhiều năm Sự mệt mỏi dẫn đến suy nhược hội chứng mệt mỏi mãn tính Mãn tính phản ánh tồn lâu dài ciguatoxins thể Sự tồn triệu chứng số bệnh nhân vài năm ghi nhận khơng có bất thường Khoảng 65% số bệnh nhân có triệu chứng từ tháng lâu với báo cáo tái phát lên đến năm Ở Thái bình dương, báo cáo ghi nhận tiến triển nhanh chóng triệu chứng thần kinh ngộ độc CFP, dẫn đến suy hô hấp, hôn mê tử vong [2] Trên sở quan sát cho thấy việc tiếp xúc nhiều lần với độc tố ciguatera có liên quan đến bệnh lâm sàng nặng hơn, người ta đưa giả thuyết CTX tan chất béo có khả tích tụ thể người làm giảm ngưỡng chịu đựng thể Tuổi thọ cân nặng lớn làm tăng khả lưu giữ độc tố, có liên quan đến thời gian mức độ nghiêm trọng triệu chứng nhiễm độc Các hành vi thể chất chế độ ăn uống (ví dụ: tập thể dục, uống rượu uống nhiều caffein) tiếp xúc lại với độc tố CTX gây tái phát lại triệu chứng ngộ độc 1.2 ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS 1.2.1 Bản chất, cấu trúc hoá học Ciguatoxin polyether gồm 13 – 14 vòng liên kết với liên kết ether tạo thành cấu trúc bền vững CTX tan lipid nên vào thể dễ dàng công vào màng tế bào, gây ngộ độc nhanh chóng Phân tử CTX tương đối bền nhiệt, khơng bị phá hủy hay biến tính chế biến thức ăn Độc tố không mùi, không vị thường phát thử nghiệm đơn giản CTX cá có nhiều đồng phân liên quan chặt chẽ với CTX phân lập từ vùng biển Pacific (P-CTX) xác định đặc trưng cấu trúc trước CTX phân lập từ Caribbean (C-CTX) 02 dạng có khác biệt tương đối cấu trúc phân tử độc tính [2] P-CTX Scheuer cs phân lập đầu tiên từ cá Chình năm 1967 Một thập kỉ sau, Yasumoto cs.,1977 phát nguồn gốc CTX quần đảo Gambier đặt tên cho sinh vật sản sinh độc tố Gambierdiscus toxicus [2] Cấu trúc P-CTX phân lập từ cá Chình mơ tả hồn chỉnh năm 1989 [2] gọi Gambiertoxin 4B P-CTX-4B (Hình 1.1) 10 P-CTX 4B P-CTX-3C 51-Hydroxy P-CTX-3C Hình 1.1 Một số cấu trúc Ciguatoxin từ G toxicus [2] 11 P-CTX-1: R1 = CH2OHCHOH; R2 = OH C-CTX-1 Hình 1.2 Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) Caribbean (C-CTX-1) ciguatoxin [2] 1.2.2 Cơ chế hoạt động Do hịa tan chất béo, nên hấp thu vào máu đến tế bào, CTXs công vào màng tế bào, khử cực màng tế bào, mở cực màng tế bào thần kinh cho ion Na+ vào bên tế bào tạo kích động thần kinh, làm hư hại tái tạo tế bào thần kinh 1.2.3 Nguồn gốc tích luỹ sinh học Những quan sát chi tiết Randall (1958) hành vi kiếm ăn lồi cá Thái bình dương đưa ơng đến giả thuyết độc tố CTXs vi 12 sinh vật sống đáy sản xuất, sau tiêu thụ loài cá bé chuyển qua loài cá lớn theo chuỗi thức ăn Bọn vi tảo giáp sống đáy thuộc chi Gambierdiscus xuất khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới giới Loài tảo sản sinh CTX và/hoặc tiền chất CTX (Gambiertoxin) G toxicus trọng tâm nghiên cứu độc tính CTX nhiều năm, nhiên sau đó, có thêm nghiên cứu số loài Gambierdiscus G belizeanus [4], G.yasumotoi [5], G pacificus, G australes, G polynesiensis [6] Ngoài khác biệt mức độ độc tính lồi, độc tính chủng Gambierdiscus khác phụ thuộc vào số yếu tố môi trường [2] Tảo giáp dinoflagellate thuộc chi Gambierdiscus xuất vùng biển nhiệt đới cận nhiệt đới giới Loài tảo sản sinh ciguatoxin và/hoặc tiền chất ciguatoxin (gambiertoxin) [3] Các gambiertoxin chuyển từ sinh vật đáy sang loài ăn thực vật (cá, động vật khơng xương sống…) sau đến cá ăn thịt thông qua chuỗi thức ăn biển Độc tố lớn dần theo chuỗi thức ăn Con người ăn phải cá ăn thực vật cá ăn thịt bị ô nhiễm gây triệu chứng ngộ độc CFP Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ CTX tích lũy cá bao gồm tốc độ ăn vào, hiệu q trình đồng hóa, mức độ tính chất biến đổi sinh học độc tố, tốc độ suy giảm tốc độ tăng trưởng cá [7] Hình 1.3 Mơ chuỗi thức ăn biển [7] 1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ Hiện sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-MS sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công nghiệp số mảng khác 45 Kiểm tra tính tương thích hệ thống Để đảm bảo độ thích hợp hệ thống LC/MS-MS điều kiện phương pháp xây dựng phân tích định tính định lượng độc tố CTX-1B dung dịch chuẩn 10 ng/mL độc tố phân tích lặp lại lần đánh giá tiêu chí sau: độ lặp lại thời gian lưu; độ lặp lại diện tích pic ion thứ cấp m/z 1133,6; tỷ lệ đáp ứng pic theo ion thứ cấp m/z 1133,6 1117,6 Bảng 3.4 Đánh giá độ thích hợp hệ thống cột Agilent Poroshell 120 ECC18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) Chỉ tiêu đánh giá (n = 6) CTX-1B Thời gian lưu (phút) 10,858 ± 0,132 RSD: 1,22 % Diện tích pic (counts) ion m/z 1133,6 (ion sơ cấp) 71500 ± 400 RSD: 0,6 % Tỷ lệ đáp ứng ion m/z mẹ ion m/z thứ cấp (%) 9,0 ± 0,1 RSD: 1,4 % Nhận xét: Kết trình bày bảng 3.4 cho thấy, với lần lặp lại, thời gian lưu (RSD nhỏ 10%), diện tích peak diện tích peak theo ion thứ cấp m/z 1117,6 dùng cho định lượng (RSD nhỏ 2%) ổn định sau lần tiêm lặp lại, đồng thời tỷ lệ đáp ứng ion thứ cấp m/z 1133,6 1117,6 dao động cao 1,4 % so với giá trị trung bình Như vậy, điều kiện LC/MS-MS sử dụng với cột Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) thích hợp để phân tích định tính, định lượng độc tố cá chình 46 3.3 QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS Trên sở số liệu thu nhận trình thực nghiệm, quy trình đề xuất cho tách chiết làm độc tố CTXs từ mơ cá Chình mơ tả sơ đồ sau: Mẫu 5g (Cơ/gan cá chình) + 15 mL Acetone (để qua đêm) Ly tâm Hỗn hợp Acetone, CTXs tạp chất Cô quay đuổi Acetone + mL Diethyl ether Dung dịch phân thành lớp → Diethyl ether (lớp trên) Cô quay đuổi Diethyl ether + mL MeOH-DW (9:1, v/v) + mL Hexan Dung dịch phân thành lớp → Lấy lớp (MeOH-DW) Cô quay đuổi MeOH-DW + mL EtOAc – MeOH (9:1, v/v) Cho qua cột InertSep FL-PR, 500 mg Dịch Cô quay chân không + mL ACN Cho qua cột InertSep FL-PR, 200 mg 47 Dịch Cô quay chân không + mL ACN Cho qua cột InertSep PSA, 200 mg* Dịch Cô quay chân không Cặn + μL MeOH LC/MS-MS (*) Nếu mẫu cá khơng cần cho qua cột PSA - Phân tích LC/MS-MS + Ion sơ cấp lựa chọn [M+Na]+ CTX-1B có m/z 1133,6 + Điều kiện sắc ký: ion spray voltage (IS) 5500V nhiệt độ buồng ion IS 500°C (TEM) Nguồn lượng ion GS1 GS2 lần lượt 80 30, giá trị tối ưu DP (thể tách chùm) 400, lượng bắn phá ion sơ cấp CE 12V để đáp ứng cường độ peak tốt đầu dò khối phổ MS + Chế độ chạy: Q3 SIM Event Tên chất m/z CTX-1B 1133.60 54 deoxy-CTX-1B 1117.60 CTX-4A/4B 1083.60 CTX-3C 1045.60 48 + Nhiệt độ cột: 40°C + Thời gian chạy mẫu: 27 phút/mẫu + Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút + Pha tĩnh: Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) + Pha động:  Kênh A: Nước cất hỗn hợp dung dịch (5 mM HCOONH4, 0,1% HCOOH) theo tỉ lệ 95:5 (v/v) (475 mL:25 mL)  Kênh B: MeOH  Chương trình: Thời gian (phút) 17 27 % MeOH 80 80 95 3.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN) Trên sở quy trình thực nghiệm xây dựng được, luận văn phân tích độc tố CTXs mẫu Chình biển thu thập được, đối chiếu với kết phân tích PTN Viện Nghiên cứu Thủy Sản Nhật Bản Kết thu trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Hàm lượng CTXs mẫu Chình biển phân tích PTN Việt Nam PTN Nhật Bản Mẫu C026 Hàm lượng (ng/mL) Việt Nam Nhật Bản 0,58 0,55 Mẫu G026 Hàm lượng (ng/mL) Việt Nam Nhật Bản 0 49 C027 0,28 0,22 G027 12,21 10,15 C028 0,36 0,33 G028 20,89 19,98 C029 0,79 0,77 G029 2,54 1,80 C030 0,32 0,29 G030 189,41 80,10 C031 0 G031 5,24 3,12 C032 0 G032 0 C033 0 G033 0 C034 0,95 0,89 G034 0 C035 0 G035 2,94 2,20 C036 0 G036 0,77 C037 0 G037 4,70 3,98 C038 0 G038 0 C039 0 G039 0 Những mẫu có hàm lượng (ng/mL) khơng có peak sắc ký đồ Để đánh giá hai dãy số liệu từ thực nghiệm phân tích CTX-1B mẫu Cá chình Việt Nam Nhật Bản có khác biệt trung bình tổng thể mang ý nghĩa thống kê hay không, tiến hành xử lý thống kê phần mềm Excel với phương pháp thống kê t-test: phương pháp kiểm định giả thuyết khác biệt hai trung bình tổng thể hai tổng thể độc lập số lượng quan sát mẫu nhỏ - Trước tiên cần so sánh phương sai hai dãy số liệu Việt Nam Nhật Bản, sử dụng phương pháp kiểm định giả thuyết với giả thuyết H0 hai dãy số có phuơng sai H1 hai dãy số có phương sai khơng Kết kiểm định chức F-test two samples for variances (bảng 3.6, 3.7) phần mềm Excel cho thấy: 50 Bảng 3.6 Kết so sánh phương sai mẫu phân tích PTN Việt Nam PTN Nhật Bản Trung bình Phương sai Cỡ mẫu Df F P(F