Luận án nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm

ĐẬT VẮN ĐÈ Theo thống kê tổ chức Y tế giới tỉ lệ ca tử vong ung thư 70% [13] Các oxazaphosphorin ifosfamid (IFM), cyclophosphamid (CYP) có tác dụng hiệu nhiều loại ung thư khác Tuy nhiên nhóm dược chất gây độc tính cao tủy xương, thận bàng quang [4], [9], [77] Mesna (natri 2mercaptoethansuỉ/onat) thuốc định bắt buộc trình trị liệu, tương tác với chất chuyển hóa (bao gồm acrolein) thuốc kháng ung thư, làm giảm độc đường tiết niệu [4] Ưu điểm lớn sử dụng mesna vừa có hiệu lực cao chống lại độc tính bàng quang acrolein, hạn chế tác dụng không mong muốn CYP IFM, vừa không ảnh hưởng đến tác dụng thuốc ung thư dùng đồng thời [4], [25], [31], [71], [78], [85], [133] Cấu tạo mesna có hai nhóm chức thiol sulíbnat, nối cầu ethylen Tuy cấu trúc đơn giản, dược chất lại dễ bị oxy hóa, đặc biệt mơi trường giàu khí oxy [61], [103] Do cần có biện pháp đế tổng hợp, tinh chế nguyên liệu đạt tiêu chuẩn chống oxy hóa dược chất dạng bào chế Sản xuất nguyên liệu làm thuốc Việt Nam thiếu nhiều nguyên nhân qui trình sản xuất chưa khả thi, việc tinh chế loại tạp chất chưa đạt yêu cầu giá thành nguyên liệu cao so với nước giới Mesna nằm danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam lần thứ VI với dạng bào chế viên nén 400 mg, 600 mg dung dịch tiêm 100 mg/ml [7], Là dược chất sử dụng nhiều điều trị mesna chưa nghiên cứu sản xuất nước Do vậy, vấn đề nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp cơng bố giới tìm kiếm phương pháp tổng hợp mesna hướng đến sản xuất nguyên liệu bào chế thành phẩm nước việc làm cần thiết Từ thực tế đó, luận án tiến hành nhằm xây dựng phương pháp tổng hợp mới, cải tiến qui trình tống hợp cũ đế thu nguyên liệu mesna ứng dụng bào chế thuốc tiêm Các mục tiêu luận án sau: ỉ Thiết kế phương pháp tổng hợp mesna Xây dựng qui trình tống hợp mesna qui mơ 200 g/mẻ Đánh giá độc tính cấp, độ ổn định nguyên liệu mesna Xây dựng công thức bào chế đề xuất tiêu chuẩn sở dung dịch tiêm mesna ỉ 00 mg/mỉ Đe hoàn thành mục tiêu trên, luận án cần thực nội dung sau: 1 Tổng quan phương pháp tổng hợp mesna công bố, phương pháp tạo nhóm thiol, đối sánh phương pháp, lựa chọn đề xuất phương pháp tổng hợp mesna Khảo sát qui trình tổng hợp mesna bao gồm phương pháp số phương pháp công bố Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lựa chọn phản ứng tốt Tìm kiếm phương pháp thích hợp để tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015 Phân tích, đánh giá, lựa chọn phương pháp đế xây dựng qui trình tổng hợp mesna 200 g/mẻ Đánh giá độc tính nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp Theo dõi độ ổn định nguyên liệu mesna tổng hợp Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml: xây dựng công thức phương pháp bào chế, đề xuất tiêu chuẩn sở phương pháp kiểm tra chất lượng, theo dõi độ ổn định dung dịch tiêm pha chế qui mơ phịng thí nghiệm Chương TỎNG QUAN 1 Tổng quan mesna 1.1.1 Nguồn gốc tính chất lý hóa Mesna tổng hợp xác định cấu trúc từ năm 1954 Nghiên cứu lâm sàng tác dụng bảo vệ đường tiết niệu mesna thực Bộ môn Dược lý Trường Đại học Bielefeld - Asta-Werke A.G (nay Frankfurt-ASTA MeđicaA.G.) từ cuối năm 1970 [78] bắt đầu đưa vào sử dụng từ năm 1980 [109] 1.1.1.1 Tinh chất vật lý - Cấu trúc hóa học - Cơng thức phân tử: C2HsNa0 S2 - Khối lượng phân tử: 164,17 đvC - Thành phần: c 14,63%; H 3,07%; Na 14,00%; o 29,24%; s 39,06% - Tên khoa học: natri 2-sulfanylethansulfonat, natri 2-mercaptoethansulfonat - Mesna bột kết tinh màu trắng vàng nhạt, dễ hút ẩm - Độ tan: tan tự nước, không tan cyclohexan [116] - Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu mesna theo BP 2015 sau [116]: + Tính chất: Bột kết tinh màu trắng vàng, hút ẩm, dễ tan nước, tan ethanol 96%, không tan cyclohexan + Định tính: Phổ hồng ngoại mẫu thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại mesna chuẩn Chế phẩm phải thể phản ứng định tính natri + Độ màu sắc dung dịch (dd): phải đạt theo qui định + pH: từ 4,5 - 6,0 (dd 10% nước) + Mất khối lượng làm khô: không 1,0% + Clorid: không 250 ppm + Sulfat: không 500 ppm + Dinatri edetat: không 500 ppm + Kim loại nặng: không 10 ppm + Tạp chất liên quan: tạp c không 0,2%; tạp D không 3,0 %; tạp A, B, E không 0,3%; tạp khác không 0,1%; tổng tạp khác không 0,3% Công thức tạp sau: Tạp A: Acid 2-(carbamimidoylsulfanyl)ethansulfonic Tạp B: Acid 2-[[(guanidino)(imino)methyl]sulfanyl]ethansulfonic Tạp C: Acid 2-(acetylsu 1fanyl)ethansulfonic o.\\ OH Tạp D: Acid 2,2’-(disulfandiyl)bisethansulfonic Tạp E: Acid 2-(4,6-diamino-l,3,5-triazin-2-yl)sulfanylethansulfonic NH, + Định lượng: chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% theo chế phẩm làm khan 1.1.1.2 Tỉnh chất hóa học Mesna hợp chất có chứa nhóm thiol, hóa tính thể tính chất nhóm Nhóm thiol tương tự nhóm hydroxyl, với nguyên tử oxy thay nguyên tử lưu huỳnh, phân nhóm bảng hệ thống tuần hồn ngun tố hóa học, nên tạo thioether, thioester a) Tỉnh acid Hợp chất chứa nhóm thiol thể tính acid rõ rệt (đặc biệt mơi trường có pH từ 10-11) mơi trường base tạo anion thiolat [87] Dung dịch mesna 10% nước có pH từ 4,5-6 [82], [116] b) Tỉnh khử (dễ bị oxy hóa) ■ Oxy hóa bỏi hợp chất peroxyd Các sản phẩm hình thành hầu hết trường hợp disulfid, dễ dàng bị oxy hóa mạnh chất oxy hóa dư thừa [63] Nghiên cứu cho thấy tốc độ phản ứng không phụ thuộc nồng độ thiol tỉ lệ nghịch với bậc nồng độ H+ [61], [103] Điều cho thấy bước chậm phản ứng liên quan đến hình thành gốc linh động peroxyd [20] Một số ý kiến cho phản ứng tăng tốc độ có xúc tác ion kim loại nặng giảm tốc độ có mặt muối edetat [61], [103] ■ Oxy hóa bỏi halogen Các sản phấm q trình oxy hóa nhóm thiol halogen khác phụ thuộc halogen chất phản ứng Các dd nước clo brom phản ứng với thiol tạo thành sulfonyl halogenid acid sulfonic Trong điều kiện khan nước tạo thành disulfid, halogen dư tạo thành trihalogen Neu thủy phân trihalogen thu sản phẩm acid có lưu huỳnh (sơ đồ 1.1) [103], RSH+ 3X2+ 2H20 RS02X ► RSH + 3X2 + 3H20 +5HX RSO3H + 6HX Trong điều kiện khan: RSH + x -► RSX + x RSX + HX RSX3 RSX + RSH - RSSR + RSSR + x 2^==5sr HX 2RSX Sơ đồ 1.1 Phản ứng oxy hóa hợp chất thiol halogen ■ Oxy hóa bỏi ion oxid kim loại Phức hợp Fe3+ [Fe(CN)6]3~và sắt octanoat, oxy hóa thiol thành disulíid khơng có mặt oxy (sơ đồ 1.2) 2RSH + 2Fe3+ *- 4RSH + Pb02 RSSR + 2Fe2+ + 2H+ 2RSSR + Pb(SR)2 + 2H20 Sơ đồ 1.2 Phản ứng tạo dỉsulíld với tác nhân ion kim loại oxiđ kim loại Quá trình oxy hóa thiol [Fe(CN)6]3' mơi trường kiềm acid nghiên cứu Trong hai trường hợp disulfid sản phẩm oxy hóa Giống ion sắt, ion kim loại nặng khác trạng thái oxy hóa cao phản ứng với thiol đế tạo disulíìd tương ứng, ví dụ Ce4+, Co3+ v 5+ môi trường acid [121], [122] Một số lượng lớn oxid kim loại MnƠ2, PbƠ2, CrƠ3 , Fe2Ơ , C02 O3 , CuO oxy hóa thiol nhiệt độ thấp cloroform xylen để tạo thành disulfid Trong MnƠ2 tác nhân mạnh [103] ■ Oxy hóa khí oxy Phản ứng oxy hóa khí oxy xúc tác số chất như: base, amin, ion kim loại nặng - Xúc tác base: Tỉ lệ hấp thụ oxy thiol nhanh lúc đầu đạt đến giá trị cố định sau phản ứng 20-30% Điều giải thích disulfid bổ sung tối đa vào môi trường phản ứng Cơ chế phản ứng sau [61], [103]: RSH + B -T RS + BH RS" + o *■ RS* RS~ + o r — RS* + 22 2RS1 — + o T RSSR ► 2BH + 22“ ► 1/2 + 2B Sơ đồ 1.3 Cơ chế oxy hóa nhóm thiol mơi trường base Tỉ lệ tiêu thụ oxy phụ thuộc nhiệt độ Trong trường hợp nồng độ kiềm cao, khả tiêu thụ oxy tăng lên 152% hình thành disulíìd Tốc độ oxy hố dithiol monothiol phụ thuộc vào pH, pH cao tốc độ oxy hóa nhanh [61], [82] - Xúc tác amin: Qwk trình oxy hóa nhóm thiol xúc tác alkylamin, hình thành "muối" alkylamin-thiol [91] Nhóm -SH bị oxy hóa oxy khơng khí nên tạo thành disulfid nước đồng thời có tái tạo amin Tốc độ oxy hoá thiol phụ thuộc nồng độ amin [61], [97], [123] R3N.HSR + 2RSSR + 2H20 +4R3N - Xúc tác ion kim loạt Việc thêm muối kim loại nặng vào dd thiol môi trường base làm tăng tỉ lệ hấp thu oxy Q trình oxy hóa tạo thành disulíìd mà khơng có sản phẩm khác (sơ đồ 1.4) Tăng nồng độ ion kim loại, tỉ lệ hấp thu oxy không tăng theo Tỉ lệ hấp thu oxy không phụ thuộc vào thiol lại khác kim loại khác [103] 2Mn+ + ► 2M(tt+1)+ + 22" 2RS- + 2M(n+1)+ *» 2RS' 2RS' +2M“+ - 2RSSR Sơ đồ 1.4 Cơ chế oxy hóa nhóm thiol xúc tác ion kim loại Vai trò ion kim loại tạo phứcchelat với nhóm thiol sau bịoxy hóa oxy tạo thành disulíĩd Ngồi q trình oxy hóa hợp chất thiolcịn xúc tác dẫn chất quinon, alken [61], [103] Oxy hóa xạ 2RSH hv > RSSR + H2 Khi chiếu xạ tia 2500Â liên kết S-H bị đứt cung cấp gốc thioyl nguyên tử hydro Sản phẩm phản ứng disulfid phân tử hydro [103], [115] ■ Oxy hóa bỏi dimethylsulfoxid sulfoxid khác Nghiên cứu cho thấy rằng, thiol bị oxy hóa DMSO tạo thành disulfid tương ứng với hiệu suất cao dimethyl sulíĩd Kết cho thấy tốc độ oxy hoá phụ thuộc vào nồng độ acid thiol mối tương quan pKa Mức oxy hóa phụ thuộc vào cấu trúc sulfoxid [103], [120] 2RSH + (CH3)2SO -RSSR + (CH3)2S + H20 Theo số tác giả, bước chậm trình phản ứng cộng, phản ứng nhanh với phân tử thứ hai thiol [82] c) Vai trị hợp chất nucỉephil Nhóm thiol phân tử đóng vai trị nucleophil, nên tham gia phản ứng cộng phản ứng [2], [82] 1.1.2 Các phương pháp định lượng mesna Nhóm thiol mesna dễ bị oxy hóa, định lượng phương pháp chuẩn độ thể tích Phương pháp Dược điển Anh 2015 [116], Dược điển Mỹ 38 [117] sử dụng đế định lượng mesna nguyên liệu với chất oxy hóa iod môi trường acid Iod dư chuẩn độ bang natri thiosulfat, chất thị màu hồ tinh bột [116] Mesna chất khơng có đỉnh hấp thụ vùng ƯV-VIS [32], phương pháp định lượng mesna quang phố hấp thụ tử ngoại đo hấp thụ dẫn chất mesna với hợp chất khác Tác giả Skowen cộng [111] định lượng mesna dịch sinh học, sử dụng N, //-dimethyl-p-phenylendiamin mơi trường acid với có mặt chất oxy hóa Fe3+, đo quang bước sóng 490 nm [111] Mesna chế phẩm nguyên liệu oxy hóa tác nhân thích hợp sau sử dụng chất tạo phức Fe3+ kali rhodanat (X = 480 nm) [127], natri hipoclorit methyl da cam (X = 505 nm) đỏ công-gô (X = 605 nm) [14], 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol (X = 414 nm), 2,4-dinitrofluorobenzen (X = 332nm), 1,10-phenanthrolin, bạc eosin ( X = 547 nm), 1,10-phenanthrolin, bạc đỏ bromopyrogallol (X = 635 nm) [42] hay oxy hóa trực tiếp ceri [95] Tác giả L.F Capita-Vallvey (2000) [68] xây dựng phương pháp định lượng mesna dựa tượng phát quang phản ứng hóa học thiol ceri (IV), làm nhạy quinin Chất phát quang phổ kế (luminescence speetrometer) Phương pháp phân tích dịng chảy sử dụng để định lượng mesna chế phẩm thuốc tiêm với khoảng nồng độ 0,29-2,21 ng (1,97 - 9,85 mg/1), giới hạn phát 0,21 ng, RSD = 4,1% Khả tìm lại dược chất nằm khoảng 94-105% [68] Phương pháp đơn giản, nhanh khơng đắt Nhóm tác giả B Lin Ling cộng [76] định lượng nhóm thiol (captopril, coenzym A, cystein glutathion ) chế phấm sinh học HPTCL với detector huỳnh quang Phương pháp đơn giản, nhanh, đáng tin cậy để xác định số lượng nồng độ nhóm thiol hợp chất Tuy nhiên việc tạo dẫn chất với tác nhân flurobenzoxadiazol SBD-F ABD-F tương đối phức tạp [76] Các tài liệu định lượng mesna phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đề cập tương đối nhiều, chủ yếu định lượng dịch sinh học, nước tiểu mô thể với detector khác detector u v [38], [39], detector điện hóa [54], [119], detector huỳnh quang [69] Các tài liệu định lượng mesna nguyên liệu chế phẩm chưa có nhiều Năm 2014, M Rizk cộng [94] sử dụng cột RP amid Ci6 150 X 4,6 mm với pha động methanol: đệm phosphat pH (10 : 90, v/v); tốc độ dịng ml/phút; thể tích tiêm 20 Jil; bước sóng phát 210 nm Kết phân tích cho thấy đường chuẩn tuyến tính khoảng nồng độ lựa chọn từ 50 đến 1000 jug/ml với hệ số tương quan 0,9998 Giới hạn phát giới hạn định lượng 7,5 22,7 jng/ml Các mẫu chuẩn bị ổn định ngày [94] Năm 2016, theo dõi độ ổn định mesna sản phẩm phân hủy nó, D Salman [99] sử dụng sắc ký lỏng khối phổ phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cột sắc ký với kích thước 4,6 mm X 250 mm, kích thước hạt nhồi 5jim, nhiệt độ cột trì 37 °c, nhiệt độ cột mẫu tự động 20 °c Pha động acetonitril (dung môi A) amoni bicarbonat nồng độ 1% (dung môi B) Tốc độ tiêm dịng 1000 Jil/phút với tỉ lệ dung mơi A B 50 : 50 vòng phút đầu, sau tăng dần tỉ lệ dung mơi A lên 100% sau 4,5 phút Phổ khối đo chế độ ion âm, điện áp phun 4000V nhiệt độ buồng phun mẫu 250 °c Pha động acetonitril (dung môi C) amoni bicarbonat nồng độ 1% (dung mơi D) Tốc độ tiêm dịng 1000 ỊLil/phút với tỉ lệ dung môi c D 50 : 50 Giới hạn định lượng khoảng 0,00-1000 ppb; hệ số tương quan R2 = 0,994; độ xác 100,36%; độ 0,24; giới hạn phát 0,24 ppb; giới hạn định lượng 1,82 ppb [99] Bảng 1.1 u, nhược điểm số phương pháp định lương mesna Dạng mesna Phương pháp Đo quang Nguyên liệu HPLC Đo quang Ưu điểm Nhược điểm TLTK Đơn giản, dễ thực hiện, hiệu kinh tế, lượng dung mơi ít, ứng dụng để kiểm tra chất lượng phòng thí nghiệm Độ nhạy cao, khoảng tuyên tính rộng với độ lặp lại tốt Định lượng mẫu có nồng độ thấp Có thể định lượng nhiều mẫu thời gian ngắn Đơn giản, dê thực hiện, hiệu kinh tế, lượng đung mơi ít, ứng dụng phịng thí nghiệm Đơn giản, nhanh - Khoảng tuyến tính hẹp [14],[42] [111] Phức tạp từ q trình chuẩn bị mẫu đến trang thiết bị, qui trình sắc ký Lượng dung môi hữu sử dụng tương đối nhiều Khoảng tuyên tính hẹp Độ đặc hiệu chưa cao [94] Phân tích địng chảy Chê phẩm Độ nhạy cao, khoảng tuyến tính rộng với độ lặp lại tốt Định lượng mẫu HPLC có nồng độ thấp Có thể định lượng nhiều mẫu thời gian ngắn Đơn giản, nhanh, đáng tin Sắc kv lớp cậy để xác định số lượng mỏng hiệu nồng độ nhóm thiol cao hợp chất Đòi hỏi hệ thống, trang thiết bị phức tạp, sử dụng nhiều dung mơi hữu Qui trình chuẩn bị mẫu, chạy sắc ký phức tạp, sử dụng nhiều dung môi hữu Khoảng tuyến tính có hệ số tương quan thấp, RSD phép đo cao, sử dụng nhiều dung môi hữu [14], [42], [111], [127] [68] [94], [99] [76] Dạng mesna Mô chuột Mô thận lợn Huyết tương nước tiêu Phương pháp HPLC Ưu điểm Nhược điểm Là phương pháp chủ yêu có độ nhạy cao, khả phát định lượng dược chất mơ sinh học với nồng độ nhỏ, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại phép đo cao, cho phép đánh giá ảnh hưởng thành phần khác mẫu Phức tạp, đòi hỏi phải tạo dẫn xuất với chât hâp thụ ƯV mạnh, yêu cầu thiết bị đại, sử dụng nhiêu dung môi hữu TLTK [69] [119] [54], [38], [39] 1.1.3 Đặc điểm dược lý 1.1.3 ỉ dược động học Với liều mesna tiêm tĩnh mạch, sinh khả dụng trung bình mesna (có hoạt tính bàng quang) 50% Mesna tiết vào nước tiểu gần hoàn toàn vòng - đầu sau tiêm sau liều uống [4], [71], [133] Trong nước tiểu có khoảng 32% 33% liều mesna dimesna Phần lớn thuốc thải trừ vòng [4], [25], [31], [71] Mesna hợp chất thân nước, khơng thấm vào mơ mà cịn khoang nội mạch thải trừ nhanh qua thận Mesna khơng qua hàng rào máu não Thế tích phân bố 0,652 1/kg Tỉ lệ mesna, dimessna liên kết với protein huyết tương tương ứng 69-75%, độ thải huyết tương 1,23 1/kg/giờ [4] Mesna chuyển hóa nhanh sau uống truyền tĩnh mạch thành dạng disulfid (dimesna) tiết vào nước tiểu dạng chuyển hóa dạng khơng hoạt tính [25], [78] Sau uống thuốc vài phút, khoảng 90% liều thuốc chuyến hóa thành disulíìd, phần cịn lại vào hệ thống tuần hoàn thải trừ nhanh qua thận [25], [71] Sau lọc cầu thận, phần đáng kể dimesna chuyển mesna để tham gia phản ứng giải độc sản phẩm chuyển hóa gây độc đường tiết niệu có nước tiểu Cơ chế giải thích dimesna phản ứng với glutathion chất sinh lý có vai trị đặc biệt làm giảm đimesna, chuyển lại mesna biếu mô thận Hai phản ứng xúc tác thiol tranferase (glutathion transhydrogenase) sau glutathion reductase [25] 10 Bảng Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất TT Tên hóa chất Nguồn gốc Số 10 Chuẩn mesna, 99% tính theo nguyên trạng USP LOT F0H331 Chuẩn mesna, 98% tính theo nguyên trạng Aros Tetra butylamonium hydrogen sulfat Merck S7484358739 Kali dihydrophosphat Prolabo 17C164121 Dikali hydrophosphat Seharlau PO 02711000 Acid phosphoric BDH 17F274006 Methanol HPLC Merck 1811107 601 Bảng Danh mục thiết bị TT Tên thiết bị Nguồn gốc Máy HPLC: Agilent 1260 Mỹ Cân phân tích: Mettler Toledo MS 105 Mỹ Máy đo pH: Metrohm Thụy sỹ Cột phân tích: C18 (250 x4,6 mm; 10 p,m) Mỹ Bộ lọc dùng cho sắc ký với màng lọc 0,45p,m Mỹ Các dụng cụ thuỷ tinh xác loại A: bình định mức, pipet Đức - Mau thử: dung dịch tiêm mesna, ngày pha chế: 02/07/2016 - Mau placebo (không mesna): natri edetat (0,25 mg); dd natri hydroxyd để điều chỉnh pH đến pH 7,2-7,6 (0,05 ml); Nước cất pha tiêm vừa đủ 1,0 ml 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tiến hành thẩm định qui trình định lượng mesna để đánh giá phù hợp việc áp dụng qui trình định lượng cho thành phẩm thuốc tiêm mesna Việc thẩm định tiến hành theo hướng dẫn thẩm định qui trình phân tích ICH (Q2) Các tiêu cần thẩm định bao gồm độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng, khoảng xác định độ xác (gồm độ lặp ỉại, độ xác trung gian) 2.2.1 Độ đặc hiệu Dung dịch chuẩn mesna: Cân xác 25 mg chất chuẩn mesna vào bình định mức dung tích 50 ml, hịa tan, pha lỗng pha động thành 50 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 Ịnm tiến hành đo HPLC Dung dịch chuẩn tạp chất C: Hòa tan khoảng 3,0 mg chuẩn tạp chất c nước cất pha loãng thành 25,0 ml nước cất Lọc qua màng lọc 0,45 ỊLim PL88 Dung dịch thử: Pha chế phẩm thuốc tiêm tự tạo có nồng độ mesna 100 mg/ml, dinatri edetat 0,25 mg/ml, điều chỉnh đến pH 7,4 NaOH; pha loãng nước cất lần đến nồng độ khoảng 0,5 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 Ịim Dung dịch trắng: Pha dđ với thành phần giống thành phần dd thử khơng có dược chất (dd placebo) Hút 1,0 ml dd placebo, pha loãng 200 lần với pha động Lọc qua màng lọc 0,45 Ịim Tiêm mẫu dd chuẩn mesna, dd thử, dd chuẩn tạp chất c , dd trắng Ghi lại sắc ký đồ Xác định thời gian lưu mesna; độ tinh khiết pic mesna sắc ký đồ mẫu thử; phổ u v pic mesna sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn Yêu cầu: Thời gian lưu pic mesna thu từ sắc ký đồ dung dịch thử từ sắc ký đồ dung dịch chuẩn phải giống (khác không 2%) sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mesna Pic mesna sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết Phổ ƯV pic Mesna thu sắc ký đồ dung dịch thử phải tương ứng với phổ ƯV pic Mesna sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2 Tính thích hợp hệ thống Dung dịch đánh giá tính thích hợp hệ thống: có chứa 0,18 mg/ml chất chuẩn mesna 0,004 mg/ml chất chuẩn tạp chất c nước cất Lọc qua màng 0,45 Ịj.m Dung dịch chuẩn 1: Tiến hành sắc ký, tiêm lặp lại 06 lần, ghi lại sắc ký đồ giá trị thời gian lưu Tính giá trị trung bình RSD lần tiêm lặp lại Dung dịch chuẩn (chuẩn kiểm tra)\ Tiến hành sắc ký, tiêm lặp lại 03 lần, ghi lại sắc ký đồ Tính giá trị trung bình lần tiêm lặp lại Tính hệ số tương đồng theo cơng thức sau: Cơng thức tính hệ số tương đồng: RF = (Sc2 X Wci)/(Sci X ntữì) Trong đó: Sci : Diện tích pic mesna dung dịch chuẩn Rc2 : Diện tích pic mesna dung dịch chuẩn mci : Khối lượng mesna pha dung dịch chuẩn ĨĨ C : Khối lượng mesna pha dung dịch chuẩn Tiêm dd thích hợp hệ thống (có chứa 0,18 mg/ml chất chuẩn mesna 0,004 mg/ml chất chuẩn tạp chất c nước cất) lần, xác định thời gian lưu (ỉr), diện tích pic (Spic) pic sắc ký đồ PL89 Yêu cầu RSD thời gian lưu < 2,0%, RSD diện tích pic mesna < 2,0% (đánh giá lần tiêm dung dịch chuẩn 1), hệ số tương đồng phải đạt: 0,980 < RF < 1,020 Độ phân giải pic mesna pic tạp chất c khơng 3,0 2.2.3 Độ tuyến tính Pha mẫu mesna chuẩn pha động với nồng độ từ 0,1 đến 1,0 mg/ml Chuẩn bị dung dịch dãy chuẩn cách pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với hệ số pha loãng khác Tiến hành sắc ký, ghi sắc ký đồ xác định đáp ứng pic Xác định tương quan nồng độ mesna mẫu diện tích pic phương pháp hồi qui tuyến tính u cầu: Bình phương hệ số tương quan tuyến tính (R2) phải > 0,996 2.2.4 Độ Tiến hành cân mesna chuẩn hòa tan vào dd placebo nhằm đạt nồng độ 80, 100, 120 mg/ml tương ứng với mức nồng độ 80%, 100%, 120% Tại mức nồng độ, thực 03 mẫu độc lập Pha loãng 200 lần, tiêm mẫu vào hệ thống HPLC Xác định hàm lượng mesna mẫu tự tạo sử dụng dung dịch chuẩn mục 2.2.2 Tính thích hợp hệ thống Xác định độ phương pháp hay tỉ lệ thu hồi theo công thức: Ỵ Lượng hoạt chất tìm thấy Độ hay tỉ lệ thu hồi (%) = -—— -—— — Lượng hoạt chât thêm vào X 100 Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi nằm khoảng 98,0 - 102,0% mức nồng độ RSD tỷ lệ thu hồi (< 2,0%) mức nồng độ 2.2.5 Khoảng xác định: Được suy từ kết thẩm định độ tuyến tính độ 2.2.6 Độ xác (độ lặp lại độ xác trung gian) Độ lặp lại phép định lượng đánh giá cách tiêm 06 thử độc lập (mỗi mẫu thử tiêm 01 lần) Xác định hàm lượng hoạt chất có mẫu thử, sử dụng dung dịch chuẩn mục 2.2.2 Tính thích hợp hệ thống Độ lặp lại phương pháp xác định giá trị RSD (%) kết xác định hàm lượng mesna có mẫu thử Yêu cầu: Giá trị RSD kết định lượng mẫu thử < 2% Độ xác trung gian xác định cách định lượng mẫu thử phần đánh giá độ lặp lại thực ngày khác nhau, thiết bị máy sắc ký lỏng khác Xác định giá trị trung bình, giá trị RSD (%) kết xác định PL90 hàm lượng mesna có mẫu thử Yêu cầu, giá trị RSD ngày (n=6) hai ngày n=12) phải < 2,0% Kết 3.2 Thực nghiệm kết thẩm định 3.2.1 Độ đặc hiệu Dung dịch mẫu trắng; Hút xác 1,0 ml mẫu placebo, pha lỗng với pha động thành 200 ml Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 ịim tiến hành đo HPLC Dung dịch chuẩn 1: Cân xác 25,04 mg chất chuẩn mesna vào bình định mức dung tích 50 ml hịa tan pha loãng pha động thành 50 ml Dung dịch thử: Hút xác 1,0 ml thuốc tiêm pha loãng với pha động thành 200 ml Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 Ịim tiến hành đo HPLC Dung dịch thích hợp hệ thống: phần 3.2.2 Độ thích hợp hệ thống Kết quả: Thời gian lưu pic mesna sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử giống nhau: - 5,1 phút Phổ ƯV pic mesna sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch chuẩn giống Dung dịch placebo không xuất pic thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic mesna nên không ảnh hưửng tới phép thử Độ đặc hiệu đạt yêu cầu r 'X » *7 Hình 2: Săc ký dung dịch mâu chuân PL91 cu 0A01A Sg«216.4 (Mmịvb 2018-07-06 19-23-30\me»n4000000T.D) eo60- 3020- ' ĩ ± _ § M _ M ỈM n» Hình 3: sắc ký đồ dung dịch mẫu thử 3.2.2 Độ thích hợp hệ thống Dung dịch chuẩn gốc tạp chất C: hòa tan 4,36 mg chất chuẩn tạp chất c pha động thêm pha động vừa đủ 50,0 ml Hút xác 2,0 ml dung dịch này, pha loãng thành 20,0 ml Dung dịch chuẩn gốc mesna: hòa tan 18,98 mg chất chuẩn mesna pha động thêm pha động vừa đủ 50,0 ml Dung dịch đánh giá tỉnh thích hợp hệ thống: Hỗn hợp hút xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc tạp chất c 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc mesna, lắc - Tiêm lần dung dịch chuẩn 1: Cân xác 25,04 mg chất chuẩn mesna vào bình định mức dung tích 50 ml hịa tan pha loãng pha động thành 50 ml - Tiêm lần dung dịch chuẩn 2: Cân xác 25,03 mg chất chuẩn mesna vào bình định mức dung tích 50 ml hịa tan pha lỗng pha động thành 50 ml Hình 4: sắc ký đồ dung dịch thích hợp hệ thống mesna tạp c Kết quả: sắc ký đồ thu từ dung dịch phân giải cho kết sau: Độ phân giải pic mesna tạp chất c = 3,06 (> 3,0) PL92 Bảng Kết thu từ lần tiêm dung dịch chuẩn Lần đo Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) Số đĩa lý thuyết 5,037 936,14673 2725 5,039 934,13904 2710 5,042 934,23480 2696 5,044 933,31812 2678 5,047 934,37665 2680 5,047 931,37848 2659 TB 5,043 933,93230 2691,33 RSD (%) 0,08 < 1,0 0,17 0,999) Hệ số chắn (intercept) b = 7,8046 2000 00000 1800.00000 oc 1600 00000 P 1400 00000 < S, 1200 00000 • a 1000 00000 ;S 800 00000 3,0) Bảng Ket đánh giá độ xác phương pháp định lượng TT Ngày Ngày Spic(mAU.s) Hàm lượng (% ) 929,43140 98,68 931,68274 98,65 930,75635 98,82 932,91050 98,78 930,99744 98,85 933,28828 98,82 PL96 S p ic (mAƯ.s) Hàm lượng (% ) Ngày TT S p ic (mAƯ.s) Ngày Hàm lượng (% ) S p ic ( m A U s ) Hàm lưọng (% ) 930,50220 98,79 932,62717 98,75 931,58435 98,91 933,76049 98,87 928,78876 98,61 931,96607 98,68 TB 930,34342 98,78 932,70588 98,76 RSD (%) 0,11% 0,11% 0,08% 0,08% Bảng cho thấy, phương pháp cho độ lặp lại tốt với kết định lượng ngày 1, ngày với RSD = 0,11%; 0,08%; 1,6% < 2% Trung bình kết định lượng 02 ngày 98,76%, RSD = 0,16% < 2,0% Như phương pháp phân tích đạt yêu cầu độ xác trung gian Kết luận Qui trình định lượng Mesna tiêu chuẩn thành phẩm dung dịch tiêm mesna đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, khoảng xác định độ xác (bao gồm độ lặp lại độ xác trung gian), phù hợp để áp dụng kiểm tra hàm lượng thành phẩm PL97 Phụ lục 17 Dự thảo tiêu chuấn sử dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml D ự THẢO TIÊU CHUẨN c SỞ DƯNG DỊCH TIÊM MESNA 100 MG/ML TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ợ c HÀ NỘI B ộ MÔN CÔNG NGHIỆP D ợ c DƯNG DỊCH Ký hiệu: TIEM MESNA Có hiệu lực từ: lOOmg/mL I YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Công thức bào chế cho 01 lọ thuốc tiêm ml Mesna Natri edetat Natri hydroxyd 1M điều chinh pH Nước cất pha tiêm 1.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu Bốn trăm miligam Một phẩy không miligam Vừa đủ Bốn mililít Mesna Natri edetat Natri hydroxyd để điều chỉnh pH Nước cất pha tiêm 1.3 Chất lượng thành phẩm 400,00 mg 1,00 mg pH 7,2-7,6 ml Đạt tiêu chuẩn BP 2015 Đạt tiêu chuẩn BP 2014 Đạt tiêu chuẩn BP 2014 Đạt tiêu chuẩn DĐVNIV 1.3.1 Tính chất: Dung dịch suốt, khơng màu 1.3.2 Độ trong: Dung dịch phải suốt khơng có tiểu phân khồng tan kiểm tra mắt thưởng điều kiện quy định 1.3.3 Giới hạn tiểu phân khơng nhìn thấy mắt thường: Phải đạt DĐVN IV 1.3.4 Định tính: Chế phẩm phải thể phép thử định tính mesna 1.3.5 Thể tích: Thể tích ống phải từ 100% đến 115% thể tích ghi nhãn 1.3.6 pH: 6,5-8,0 1.3.7 Nội độc tố vi khuẩn: Không 0,20 IƯ/mg Mesna 1.3.8 Độ vô khuẩn: Chế phẩm phải vồ khuẩn 1.3.9 Tạp chất liên quan: PL98 - Tạp chất D: Không 3,0% - Tạp chất C: Không 0,2% - Tạp chất A, B, E: Không 0,3% - Tạp chất không định danh: Không 0,1 % - Tổng tạp đơn không định danh: Không 0,3%- 1.3.10 Định lượng:Chế phẩm phải chứa mesna (C2H5NaOsS2) từ 90,0% đến 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn II PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Bằng cảm quan dung dịch không màu ống thủy tinh không màu 2.2 Độ trong:Thử theo DĐVNIV, Phụ lục 11.8- Mục B 2.3 Giói hạn tiễu phân khơng nhìn thấy mắt thường: Thử theo DĐVN IV, Phụ lục 11.8-Mục A 2.4 Định tính: Phương pháp HPLC: Trên sắc ký đồ thu phần định lượng Mesna dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với thòi gian lưu pic Mesna sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2.5 Thể tích:Thử theo DĐVNIV, Phụ lục 1.19- Mục B 2.6 pH:Thử theo DĐVNIV, Phụ lục 6.2 2.7 Nội độc tố vi khuẩn:Thử theo DĐVNIV, Phụ lục 13.2 2.8 Thử độ vô khuẩn:Thử theo DĐVNIV, Phụ lục 13.7 2.9 Tạp chất liên quan: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, DĐVNIV, phụ lục 5.3 ■ Thuốc thử: Theo DĐVNIV - Kali dihydro phosphat - Dikali hydro phosphat - Tetrabutylamoni hydrogen Sulfat - Methanol HPLC - Acid phosphoric ■ Cách thứ Điểu kiên sắc kỷ: PL99 - Pha động: Hòa tan 2,94 g kali dihydrophosphat; 2,94 g dikali hydro phosphat 2,6 g Tetrabutylamoni hydrogen Sulfat khoảng 600 mL nước Điều chinh đến pH 2,3 acid phosphoric, thêm 335 mL methanol pha loãng thành 1000 mL với nước - Cột: C18 (250 X 4,6 mm; 10 |im) - Detector: 235 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 jLil Tiến hành: Mau placebo: hịa tan 25 mg natri edetat 90 mL nước, điều đến pH 7,4 dung dịch natri hydroxyd N Thêm nước vừa đủ 100 mL Dung dịch placebo: Pha lỗng 1,0 mL mẫu placebo thành 25,0 mL vói pha động Lọc qua màng lọc 0,45 Ịim tiến hành đo HPLC Dung dịch thử: Pha loãng 1,0 mL thuốc tiêm thành 25,0 mL với pha động Lọc qua màng lọc 0,45 ịim tiến hành đo HPLC Dung dịch thích hợp hệ thống: Dung dịch có chứa 0,18 mg/mL chất chuẩn mesna 0,004 mg/mL chất chuẩn tạp chất c pha động Lọc qua màng lọc 0,45 ỊLL111 tiến hành đo HPLC Dung dịch chuẩn 1: Dung dịch Ịig/mL chất chuẩn tạp chất c 120 ỊLig/ml chất chuẩn tạp chất D pha động Lọc qua màng lọc 0,45 ỊHĨĨ1 tiến hành đo HPLC Dung dịch chuẩn 2:12 ỊLig/mL chất chuẩn mesna pha động Lọc qua màng lọc 0,45 ịim tiến hành đo HPLC Thòi gian chạy sắc ký: Gấp lần thời gian lưu Mesna Kiểm tra khả thích họp hệ thống sắc ký: Tiêm dung dịch thích hợp hệ thống, độ phân giải pic Mesna tạp chất c không nhỏ 3,0 Tiêm mẫu trắng, dung dịch chuẩn 1, 2, dung dịch placebo dung dịch thử PL 100 - Thời gian lưu tương đối pic so với pic mesna sau: Tạp chất A tạp chất B khoảng 0,6; tạp chất E khoảng 0,8; tạp chất c khoảng 1,4; tạp chất D khoảng 2,3 Tính tốn kết quả: - Trên sắc ký đồ dung dịch thử loại pie placebo - Hệ số hiệu chỉnh để tính hàm lượng tạp: Nhân diện tích pic tạp chất A, B E với 0,01 - Tính tốn kết hàm lượng tạp chất c tạp chất D theo nồng độ tạp chất c tạp chất D dung dịch chuẩn - Tính tốn hàm lượng tạp chất A, B, E tạp không định danh khác theo nồng độ Mesna dung dịch chuẩn - Bỏ qua pic tạp chất nhỏ 0,05% sắc ký đồ dung dịch thử Ghi chú: Tạp chất A: acid 2-(carbamimidoylsufanyl)ethanesulfonic Tạp chất B: acid 2-[[(guanidmo)(imino)methyl]sulfanyl]ethansulfonic Tạp chất C: acid 2-(acetylsulfanyl)ethansulfonic Tạp chất D: 2,2’-(disulfaneiyl)bis(ethanesulfonic acid) Tạp chất E: acid 2-(4,6-diamino-l,3>5-triazin-2-yl)sulfanylethansulfonic 2.10 Định lượng mesna Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, DĐVNIV, phụ lục 5.3 Điều kiện sắc ký phần tạp chất liên quan loại trừ bước sóng detector đặt 215nm - Dung dịch thích hợp hệ thống phần tạp chất liên quan - Dung dịch chuẩn mesna: Cân xác khoảng 25 mg chất chuẩn mesna vào bình định mức dung tích 50 mL, hịa tan pha loãng pha động thành 50 mL Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 Jim tiến hành đo HPLC - Dung dịch thử: Hút xác 1,0 ml thuốc tiêm pha loãng với pha động thành 200 mL Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 Ịim tiến hành đo HPLC PL101 Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: Tiêm dung dịch thích hợp hệ thống, độ phân giải pic mesna tạp chất c khơng nhỏ 3,0 Tính tốn kết hàm lượng mesna (X^HsNaCbS) chế phẩm dựa vào lượng cân chất chuẩn, diện tích pic mesna dung dịch chuẩn dung dịch thử, hệ số pha loãng dung dịch chuẩn dung dịch thử Thuyết minh xây dựng tiêu chuẩn sở Xây dụng TCCS sở đáp ứng yêu cầu chung theo quy định DĐVN thuốc tiêm Chi tiêu tạp chất liên quan định lượng mesna dựa tiêu tạp chất liên quan chuyên luận nguyên liệu mesna ƯSP 38 BP 2015 III ĐÓNG GÓI - GHI NHÃN - BẢO QUẢN Nhãn rõ ràng, quy chế Bảo quản nơi khô mát, tránh ánh sáng PL102 ... số nghiên cứu dạng bào chế độ ổn định mesna Các dạng bào chế mesna gồm có: viên nén, dung dịch tiêm, xơng hít Chính thế, nghiên cứu bào chế mesna công bố tập trung vào dạng bào chế Dung dịch tiêm. .. giá độc tính nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp Theo dõi độ ổn định nguyên liệu mesna tổng hợp Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml: xây dựng công thức phương pháp bào chế, đề xuất... Các đường thực nghiệm tổng hợp mesna - Đánh giá độc tính nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp - Theo dõi độ ốn định nguyên liệu mesna 2.3.2 Bào chế dung dịch tiêm mesna - Xây dựng thẩm