Đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ mẫu giáo

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống vi khuẩn Haemophilus loại vi khuẩn ký sinh đường hô hấp người số loài động vật Loài H influenzae nguyên số bệnh nhiễm trùng người (có thể từ viêm đường hơ hấp viêm màng não) H.influenzae typ b (Hib) giới xác định nguyên gây viêm màng não vi khuẩn, đặc biệt trẻ em tuổi [24], [89] Tại nước phát triển khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu hết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mang Hib họng cao trẻ nhỏ, đặc biệt trẻ chăm sóc trung tâm giữ trẻ ban ngày mang Hib đến 15% [52], [69] Bên cạnh đó, Hib đánh giá nguyên nhân hàng đầu gây bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ viêm màng não, viêm phổi để lại di chứng tỷ lệ tử vong cao (khoảng 10%) Gánh nặng bệnh tật Hib giảm đáng kể nhờ có vacxin phòng bệnh nước [89] Tuy nhiên, số nước giới sau đánh giá trình thực phịng bệnh Hib vacxin cho thấy tỷ lệ thất bại vacxin không nhỏ Xuất phát từ vấn đề này, có nhiều nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử (phổ biến sử dụng kỹ thuật PFGE) Hib tiến hành để đánh giá dịch tễ học phân tử vi khuẩn dựa nghiên cứu so sánh với đặc điểm chủng Hib phân lập từ người khỏe mạnh người tiếp xúc mang vi khuẩn [82], [100], [105], [111], [112] Tại Việt Nam, số nghiên cứu đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn H influenzae nói chung [1] Hib nói riêng [7], tỷ lệ mắc viêm màng não H.influenzae (chưa có điều kiện xác định typ huyết thanh) trẻ tuổi [6], [22] Cho thấy tỷ lệ trẻ tuổi mang H.influenzae chiếm khoảng 21,4% - 35,5% [8], Hib chiếm khoảng 15,0% - 17,5% [7] H.influenzae nguyên hàng đầu gây viêm màng não (50 - 60% trường hợp viêm màng não xác định vi khuẩn) trẻ nhỏ [6] Từ năm 1994 đến 2004, số nghiên cứu Ngô Thị Thi, Phan Lê Thanh Hương cộng đưa tỷ lệ viêm màng não Hib trẻ tuổi Hà Nội số tỉnh phía Bắc [11], tìm hiểu phân bố theo biotype, genotype (phân loại PFGE) gen mã hóa tổng hợp enzym b-lactamase Hib phân lập từ trẻ viêm màng não tuổi thực [10] Tuy nhiên, số lượng chủng Hib sử dụng nghiên cứu hạn chế chưa có so sánh với chủng Hib phân lập trẻ khỏe mạnh Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân tử chủng Hib gây viêm màng não cho trẻ tuổi trẻ khỏe mạnh lứa tuổi mẫu giáo có mang Hib Chúng tơi thực đề tài: “Đặc điểm sinh học phân tử Haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo”, nhằm thực mục tiêu: Xác định biotype, genotype, khả sinh enzym b-lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả sinh enzym b-lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo So sánh đặc điểm sinh học Hib gây viêm màng não trẻ tuổi với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Haemophilus influenzae typ b (Hib) 1.1.1 Haemophilus influenzae: lịch sử tên gọi Haemophilus influenzae (H.influenzae) phân lập lần Richard Pfeiffer từ đờm bệnh nhân bị viêm phổi đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn hiểu lầm nguyên nhân gây bệnh cúm nên gọi trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria) Mãi đại dịch cúm xảy năm 1918-1919, người ta biết H.influenzae thành viên hệ vi khuẩn ký sinh đường hô hấp lúc gây bệnh Năm 1933, phát virus cúm nguyên bệnh cúm, vai trò H.influenzae làm sáng tỏ: virus cúm gây bệnh cúm, H.influenzae vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau tế bào đường hô hấp bị tổn thương nặng virus cúm Xuất phát từ yếu tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) nhu cầu đòi hỏi yếu tố phát triển có mặt máu (Haemophilus: ưa máu) nên vi khuẩn có tên gọi H.influenzae [19], [43], [89] 1.1.2 Đặc điểm sinh học H.influenzae typ b (Hib) 1.1.2.1 Hình thể cấu trúc [19], [89] H influenzae lồi vi khuẩn nhỏ nhất, cịn gọi cầu trực khuẩn vi khuẩn có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5mm) uốn cong hai đầu trơng hình cầu Tuy nhiên chúng dịch não tuỷ, hình thể H influenzae kéo dài gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1) H influenzae bắt màu Gram âm, khơng di động khơng hình thành nha bào Thành tế bào vi khuẩn có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự thành vi khuẩn Gram âm khác Tuy nhiên, H influenzae phân loại thành nhóm: loại khơng vỏ polysaccharide (non-typeable khơng xác định typ huyết thanh) loại có vỏ (typeable xác định typ huyết thanh) Lồi H influenzae có vỏ bọc phân loại tiếp tục theo typ huyết (serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên vỏ polysaccharide gen qui định [19], [43], [89] Vỏ bọc typ b dạng trùng hợp ribose, ribitol phosphate, gọi polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Những polysaccharide bề mặt có liên quan chặt chẽ với độc lực vi khuẩn, đặc biệt H influenzae typ b (Hib), nguyên nhân nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm viêm màng não (chiếm 90% ca nhiễm khuẩn xâm hại Hib) Bạch cầu đa nhân Hib Hình 1.1 Hình thể Hib tiêu nhuộm Gram dịch não tuỷ kính hiển vi quang học (độ phóng đại × 1000) [99] Trên thực tế, nhuộm Gram bệnh phẩm dịch não tủy mà vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái nhiều bạch cầu đa nhân dấu hiệu quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng não H influenzae [89] 1.1.2.2 Sức đề kháng [127] H influenzae loại vi khuẩn chịu đựng với yếu tố ngoại cảnh Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng để ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô lạnh giá Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn cách dễ dàng Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đốn vi khuẩn nên vận chuyển phịng thí nghiệm vịng giờ, khơng q nhiệt độ phịng thí nghiệm (24 - 28oC) Nếu tăm bệnh phẩm phải giữ môi trường vận chuyển (mơi trường bảo quản), giữ nhiệt độ - 8oC tối đa 24 môi trường 1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy [19] Điều kiện ni cấy: H influenzae loại vi khuẩn khó ni cấy Chúng không mọc môi trường nuôi cấy thơng thường, mọc mơi trường có sẵn hai yếu tố X V Yếu tố X có lẽ khơng phải chất túy mà hỗn hợp chất có chứa sắt (như hemin hematin) H influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp số enzym catalase, peroxidase cytochrom hệ thống vận chuyển điện tử Máu sản phẩm máu, kể hemin nguồn nguyên liệu truyền thống sử dụng để sản xuất yếu tố X Thạch máu (5%) có khả cung cấp đủ lượng yếu tố X mà H influenzae cần thiết phát triển Khi dùng hematin tinh chế nồng độ cần thiết 0,1 - 1,0 mg/ml Yếu tố V NAD NADP có mặt máu, phần chúng nằm bên tế bào Mặt khác, máu nhiều lồi động vật có enzym NADase có tác dụng phân hủy NAD, nên máu tươi khơng có NAD dạng tự Thạch chocolate, NAD giải phóng khỏi tế bào enzym NADase bị nhiệt phá huỷ Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết 0,2 - 1,0 mg/ml H influenzae hiếu khí, địi hỏi mơi trường ni cấy có CO2 (2 - 5%) phân lập Mọc tốt môi trường chocolate Levinthal nhiệt độ khoảng 23 - 390C, tối ưu 370C Không mọc thạch máu cừu; mọc loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) khơng gây tan máu khuẩn lạc nhỏ nhiều so với chocolate điều kiện nuôi cấy Cũng thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm to, vùng xa khuẩn lạc khơng mọc, bé Hiện tượng gọi tượng “vệ tinh” (satellitism), khả tiết yếu tố V vi khuẩn bội nhiễm giúp H influenzae phát triển thạch máu thơng thường Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh khuẩn lạc S aureus môi trường thạch máu thỏ Môi trường nuôi cấy đặc điểm khuẩn lạc: Để ni cấy H influenzae, có loại mơi trường được sử dụng [19], [43], [89], [127]: - Thạch chocolate có khơng có 300mg bacitracin/ml mơi trường (có tác dụng ức chế số vi khuẩn khác, đặc biệt liên cầu) để phân lập H.influenzae Đây loại môi trường thường sử dụng nuôi cấy phân lập vi khuẩn - Thạch máu thỏ tươi 7% thạch Levinthal Sau nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm khí trường 5% CO2 (nếu khơng có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy đặt chuông thủy tinh đốt nến chng Sau nến tắt, khí trường bên chng - 5% CO2) 37oC thời gian 18 - 24 Hình 1.3: Khuẩn lạc H influenzae mọc môi trường chocolate Sau 16 - 18 nuôi cấy, H influenzae phát triển thành khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ - 2mm khơng gây tan huyết Vi khuẩn Hib ln có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh ánh sáng chiếu vào có đường kính lớn Ngồi ra, mơi trường ni cấy vi khuẩn thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol) Sau 24 - 48 giờ, trạng thái vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải tính chất bắt màu Gram thay đổi Trên môi trường lỏng, H influenzae thường phát triển làm đục mơi trường Tình trạng vỏ xảy sớm môi trường thạch, muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm ni cấy thích hợp (18 giờ) Tính chất sinh hóa đặc trưng H influenzae: Tính chất sinh hóa đặc trưng H influenzae nhu cầu đòi hỏi bắt buộc yếu tố phát triển X V mơi trường ni cấy Tính chất xác định thử nghiệm XV thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]: (1) (2) Hình 1.4: Thử nghiệm với khoanh giấy X, V XV (1); thử nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H influenzae địi hỏi bắt buộc phải có yếu tố X V cho phát triển H influenzae phân biệt với loại Heamophilus khác đặc điểm sau đây: Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H influenzae với Haemophilus khác [127] Tính chất Lồi Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2 H influenzae - + + + H parainfluenzae - - + - H hemolyticus + + + - H parahemolyticus + - + ± H aphrophilus - + - + H paraphrophilus - - + + 1.1.3 Đặc điểm phân loại theo typ huyết (serotype) typ sinh học (biotype) H influenzae 1.1.3.1 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ huyết [19], [43], [89] Năm 1930, H influenzae xác định thành nhóm chính, lồi khơng vỏ (không xác typ huyết - non typeable) lồi có vỏ (xác định typ huyết - typeable) Dựa tính đặc hiệu kháng nguyên vỏ polysaccharide, vi khuẩn H influenzae có vỏ chia thành typ huyết từ a đến f Theo hầu hết nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H influenzae gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều H influenzae typ b 1.1.3.2 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ sinh học (biotype) Bảng 1.2: Phân loại H influenzae theo typ sinh học Killian [43] Biotype Các tính chất hố học Test Urease Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC) I + + + II + + - III + - - IV + - + V - + + VI - - + VII - + - VIII - - - Kilian đưa phương pháp sử dụng số thử nghiệm sinh hoá để xác định biotype đặc điểm sinh học loài Haemophilus dựa kết thử nghiệm: tìm khả sinh indol, hoạt động hai enzym urease decarboxylase vi khuẩn Trước đây, Kilian nghiên cứu chia H influenzae thành biotype từ I đến IV Những biotype độc lập với typ huyết vi khuẩn đó, chủng khơng có vỏ cho kết tương tự với ba phản ứng sinh hoá Sau này, với thử nghiệm tương tự, Kilian bổ sung thêm biotype từ V đến VIII Vì vậy, H influenzae chia làm typ theo tiêu chuẩn Killian [43] 10 1.1.4 Miễn dịch [28], [89] Kháng thể (Kháng kháng nguyên thân) Kháng nguyên thân (LPS protein màng ngoài) Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate) Kháng thể (Kháng kháng nguyên vỏ) Đại thực bào Đại thực bào Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ kháng nguyên thân [89] Miễn dịch tự nhiên thể Hib đa dạng, bao gồm hợp tác phức tạp nhiều thành phần hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa q trình hoạt hóa phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả thực bào, diệt vi khuẩn đại thực bào tế bào đa nhân, 5) Chức miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T Trong khó đánh giá rạch ròi chế miễn dịch quan trong chế bảo vệ thể vật chủ Tuy nhiên, hầu hết cá thể có khả miễn dịch bảo vệ 124 (indistinguishable) hay xếp vào nguồn gốc, có mối liên quan gần (closely related), có liên quan (possibly related) khác hồn tồn (different) Vì vậy, kỹ thuật hữu ích nghiên cứu xác định nguồn gốc chủng vi khuẩn gây bệnh [10], [12], [122], [123] - Tại Việt Nam, dựa vào phương pháp PFGE, Phan Lê Thanh Hương cộng có nghiên cứu xác định Hib gây viêm màng não với nguồn lây mang tính gia đình [10] - Trên giới, điển hình Nhật Bản Hiroshi Wantanabe cộng cho thấy có lây truyền chủng H.influenzae không định typ huyết (non-typeable) đề kháng ampicillin-không sản xuất βlactamase trẻ em bố mẹ chúng dựa nghiên cứu 15 gia đình [122] Bên cạnh đó, Saito cộng cho thấy lan truyền Hib từ trẻ mắc viêm màng não vi khuẩn sang cho người chăm sóc chưa tiêm vacxin với tỷ lệ cao [103] Ngồi ra, với mục đích này, số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PFGE để đánh giá khác biệt đặc điểm ADN chủng H.influenzae phân lập từ nguồn gốc khác Cụ thể, nghiên cứu Patricia Ezekiel Moor cộng đánh giá khác cấu trúc ADN chủng Hib phân lập từ thổ dân đối tượng thổ dân Úc [82] 4.4.1.3 Sử dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng H.influenzae gây bệnh nhiễm trùng PFGE kỹ thuật đánh giá cơng cụ hữu ích áp dụng nghiên cứu dịch tễ học phân tử loài vi khuẩn [107], [115], [116] Đối với vi khuẩn H.influenzae, có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử nhiều khía cạnh khác Cụ thể, nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng H.influenzae phân lập từ vùng hầu họng trẻ khoẻ mạnh nhà trẻ trại trẻ mồ côi [90], chủng H.influenzae đề kháng 125 ampicillin không sinh enzym β-lactamase [48] hay chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não [79] Tất nghiên cứu dựa sở phân loại genotype H.influenzae theo kỹ thuật PFGE kết hợp với đặc điểm đối tượng địa điểm nghiên cứu để đánh giá mặt dịch tễ học [48], [79], [100] 4.4.2 Tỷ lệ phân bố genotype chủng Hib gây viêm màng não 102 chủng Hib phân lập từ bệnh nhi mắc viêm màng não nhiều vùng khác thuộc khu vực miền Bắc thăm khám điều trị bệnh viện Nhi Trung ương Do đó, chủng Hib nghiên cứu xác định có nguồn gốc khác địa lý Tuy nhiên, kết phân tích kỹ thuật PFGE cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn phân bố vào ba nhóm genotype chính, A (48,4%), B (20,1%), C (21,7%) chủng riêng lẻ không xếp loại chiếm 5,9% Tương tự, nghiên cứu Anna Skoczyn´ska đặc điểm vi khuẩn Hib gây viêm màng não Ba Lan thu 233 chủng Hib từ 64 trung tâm, đại diện cho Ba Lan vòng năm (1997 - 2004) Những chủng vi khuẩn này, sau phân tích kỹ thuật PFGE cho thấy chủng Hib gây viêm màng não tập trung chủ yếu vào nhóm genotype A (97,4%) số genotype riêng lẻ B, C, D, E, F[4] (chỉ chiếm 2,6%) [108] Điều gợi ý cho thấy chủng Hib gây viêm màng não tập trung vào vài nhóm genotype định cho dù có phân lập nhiều vùng khác Yếu tố thời gian phân lập Hib đánh giá nghiên cứu Kết cho thấy thời gian phân lập không ảnh hưởng nhiều đến biến đổi genotype chủng vi khuẩn Hib: chủng kiểu A phân lập vào thời gian từ 2004 đến 2007 có liên quan gần với chủng phân lập khoảng thời gian từ 2001 - 2003, có liên quan (liên quan xa) với kiểu A2 thời gian phân lập chủng Hib thuộc 126 kiểu A A2 (2004-2007) Có lẽ, kiểu A2 gồm chủng có khả sinh b-lactamase kiểu A A1 khơng có khả sinh enzym Như vậy, thời gian năm, chủng vi khuẩn Hib gây bệnh có biến đổi chút gen khơng nhiều, chúng ln có mối liên quan gần với Hiện tượng khác từ - band (liên quan xa hay có liên quan) lại xảy chủng khác khả sinh enzym b-lactamase, nghĩ đến việc số chủng Hib nhận thêm đoạn gen sinh b-lactamase theo chế transposon [23], [119] có thêm phân đoạn plasmid mang gen quy định tổng hợp b-lactamase nên làm biến đổi kiểu gen vi khuẩn Hib Bởi vì, tượng xảy làm thay đổi vị trí cắt enzym giới hạn SmaI Hầu hết nghiên cứu đánh giá khả gây bệnh Hib xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn Yếu tố độc lực phần lớn dựa vào cấu trúc vỏ polysaccharide vi khuẩn typ sinh học (biotype) Trong đó, typ huyết b typ sinh học I, II đóng vai trị gây bệnh chủ yếu Tuy nhiên, số nghiên cứu xác định sâu vai trò độc lực Hib Những yếu tố độc lực khác phải kể đến như: yếu tố bám (pili), khả sống sót môi trường thể với chất dinh dưỡng đặc trưng khả xâm nhập vào tế bào Cụ thể, gen có vai trị độc lực H.influenzae bao gồm: vùng gen Cap mã hóa vỏ polysaccharide, nhóm gen hif mã hóa yếu tố bám pili, nhóm gen hmw1 hmw2 mã hóa yếu tố bám có trọng lượng phân tử lớn nhóm gen quy tổng hợp enzym tryptophanase Vì vậy, chủng Hib gây bệnh quan thường có tương đồng gen độc lực, dẫn đến kết cho thấy chủng Hib gây viêm màng não với kiểu genotype có tính tập trung vào số nhóm genotype định (trong genotype nhóm có liên quan với giống hoàn toàn gen) 127 phù hợp với khoa học [60], [61] Ngồi ra, kết luận khu vực nghiên cứu (các tỉnh miền Bắc Việt Nam), chủng Hib tồn luân chuyển cộng đồng Chú thích: [4] Genotype A, B, C quy ước đặt cho phân loại PFGE nghiên cứu Vì vậy, genotype A B nghiên cứu khác với genotype A B nghiên cứu khác) 4.4.3 Phân bố tỷ lệ genotype chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo Phân tích 52 chủng Hib chúng tơi phân lập trẻ khỏe mạnh tuổi nghiên cứu kỹ thuật PFGE thu 36 genotype Kết đồng nghĩa với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh phân bố vào rải rác vào nhiều genotype khác không tập trung vào nhóm genotype định Trên giới, nhiều nghiên cứu cho thấy H.influenzae nói chung Hib nói riêng phân lập từ nguồn khác thường có khác biệt ADN Cụ thể với nghiên cứu Henri Dabernat năm 2003 dịch tễ học phân tử H.influenzae phân lập từ trẻ chăm sóc nhà trẻ nước Pháp, với 663 chủng H.influenzae sau phân tích kỹ thuật PFGE cho 366 genotype; đó, hầu hết chủng H.influenzae phân lập nằm rải rác vào nhiều genotype khác khơng tập trung vào nhóm định [41] Tương tự, nghiên cứu khác Saito cộng Nhật Bản năm 1999 178 chủng H.influenzae phân lập khơng có liên quan mặt dịch tễ học kỹ thuật PFGE, sau phân tích thu 165 genotype khác [103] Vì vậy, thấy khác biệt chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não với chủng Hib phân lập từ họng trẻ khỏe mạnh hay chủng có liên quan dịch tễ học Đó Hib gây viêm màng não có genotype mang tính tập trung (tương đồng), cịn Hib phân 128 lập từ họng trẻ khỏe mạnh thường có kiểu genotype rải rác khơng có tính tập trung Theo Gilsdorf, thay đổi gen tác động chọn lọc tự nhiên sở để xác định độc lực H.influenzae Cụ thể, ADN H.influenzae xảy đột biến nhận đoạn gen độc lực dẫn đến khác biệt gen chủng vi khuẩn Sự đa dạng đột biến tạo vừa có vai trị thuận lợi phản ánh khả sống sót môi trường khác [50] Điều cho thấy chủng Hib gây viêm màng não thường có tương đồng gen độc lực Hơn nữa, chủng Hib gây viêm màng não phải tương đồng gen quy định đặc điểm giúp cho vi khuẩn sống sót dịch não tủy để gây bệnh Cho nên, chủng Hib gây viêm màng não thường có phân loại genotype tương đồng khác với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi 4.4.4 Mối liên quan genotype (kiểu PFGE ADN) với khả sinh b-lactamase chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích kết PFGE, xác định enzym β-lactamase chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh tuổi, chúng tơi sử dụng thuật tốn thống kê (Chi-square test, Fisher’s exact test) để đánh giá mối liên quan genotype với khả sinh b-lactamase Kết cho thấy khơng có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đặc điểm phân loại genotype khả sinh enzym b-lactamase chủng Hib phân lập (p > 0,05) Trên thực tế, người ta chứng minh gen TEM-1 thuộc hai transposon có ký hiệu Tn2 hay Tn3 gen ROB-1 đóng vai trị mã hóa enzym b-lactamase [119] Cả hai enzym nằm plasmid nên di truyền theo chế plasmid lan truyền theo chế transposon 129 [23] (hình 4.3) Trong đó, nhân lên plasmid thường nhịp nhàng với ADN nhiễm sắc thể vi khuẩn, plasmid bảo tồn "tương đối" qua hệ Những vi khuẩn có khả sinh enzyme b-lactamase xác định vi khuẩn nhận plasmid mang đoạn gen mã hóa enzyme này, đặc biệt F-plasmid (F: Fertility- factor) (1) Chú thích: (1): Tn3 “nhảy” vào F-plasmid có khả tiếp hợp với vi khuẩn khác (2): Tn3 hình thành cấu trúc “thịng lọng” tách khỏi F-plasmid (2) (3): Tn3 giải phóng từ F-plasmid “nhảy” sang ADN khác (3) Hình 4.3 Cơ chế di truyền tranposon Tn3 Vì vậy, vi khuẩn H.influenzae thuộc genotype bị nhiễm plasmid mang gen mã hố enzyme b-lactamase tạo nên chủng vi khuẩn kháng nhóm thuốc b-lactam mà genotype quy định khả sinh enzym Thêm vào đó, chế di truyền transposon gen nhảy (jumping gene) Cho nên, Tn3 nhảy từ plasmid thơng thường sang F-plasmid truyền sang tế bào vi khuẩn khác theo chế tiếp hợp 130 (conjugation) dẫn đến tượng tế bào vi khuẩn nhận gen đề kháng (TEM-1) [23], [119] 4.4.5 Mối liên quan genotype (kiểu PFGE ADN) với biotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích mối liên genotype biotype chủng Hib phân lập được, thấy tất chủng vi khuẩn có chung genotype ln nằm biotype Điều giải thích chủng Hib genotype có đặc điểm phân tích ADN theo kỹ thuật PFGE giống (PFGE kỹ thuật có khả phân biệt tốt có tính ổn định phân loại vi khuẩn [115]) Tuy nhiên, so sánh mối liên quan nhóm genotype với phân bố theo biotype chủng Hib chúng tơi thấy khơng có ý nghĩa thống kê Sở dĩ có kết khác biệt cấu trúc phân tử ADN genotype xếp nhóm [115], [116] Theo tiêu chuẩn Tenover (cụ thể áp dụng nghiên cứu này), chủng Hib có genotype khác - biến cố đột biến xếp chung vào nhóm genotype Những đột biến thường gặp như: đột biến điểm (mất cặp thêm cặp base vào phân tử ADN), đột biến đoạn (ADN đoạn ADN ngắn) đột biến thêm đoạn (ADN nhận thêm đoạn ADN ngắn) [115] Vì vậy, thay đổi cấu trúc ADN dẫn đến sai khác cấu trúc gen quy định enzym đóng vai trị phân loại biotype H.influenzae nói chung Hib nói riêng, làm cho Hib nhóm genotype (khác genotype) lại xếp vào biotype khác Ngoài ra, số chủng Hib nghiên cứu chưa thực đủ lớn để nghiên cứu đánh giá tất tỷ lệ nên kết cho thấy nhóm genotype chủng Hib phân lập khơng có liên quan đến phân loại biotype Tuy nhiên, số chủng Hib thực nghiên cứu đủ lớn 131 chắn thấy nhóm genotype có liên quan đến phân loại biotype, đặc điểm kiểu hình ln quy định đặc điểm kiểu gen 4.4.6 Mối liên quan genotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Sau phân tích tồn chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo kỹ thuật PFGE, kết cho thấy: 01 chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype giống 01 chủng phân lập từ bệnh nhi 02 chủng Hib khác phân lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype liên quan gần với 02 chủng phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Trong đó, tất chủng thuộc genotype không xếp loại (KXL) 52 chủng Hib phân lập từ bệnh phẩm dịch ngoáy họng trẻ khỏe mạnh tuổi Sở dĩ có kết chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh ln có genotype tản mạn khơng tập trung vào số nhóm genotype định, chủng Hib gây viêm màng não tập trung nhiều vào vài nhóm genotype Hầu hết nghiên cứu xác định Hib loại vi khuẩn có độc lực, kể chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh Tuy nhiên, chủng Hib gây viêm màng não cần phải chứa nhiều loại gen độc lực đặc trưng Trong nghiên cứu này, thấy hầu hết chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh giống có mối liên quan genotype chung nguồn gốc phân lập, ngoại trừ genotype nhóm genotype loại gồm chứa chủng khác nguồn gốc Điều giải thích tượng lây nhiễm chéo Hib trẻ nuôi dưỡng nhà trẻ, mẫu giáo Đặc điểm phù hợp với nhiều nghiên cứu khác giới [100], [122] báo cáo, điển hình nghiên cứu Raquel Sa - Leao Bồ Đào Nha cho thấy có tỷ lệ cao vi khuẩn H.influenzae lan truyền những đứa trẻ ni dưỡng trung tâm chăm sóc 132 ban ngày [105] Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi cho thấy tỷ lệ cao (24,5%) trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo mang vi khuẩn Hib; số trẻ mang Hib độc lực mà khơng có biểu bệnh, nguồn lây quan trọng sang trẻ khác khó tránh 4.5 So sánh đặc điểm sinh học chủng Hib gây viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi Nghiên cứu cho thấy phân bố tỷ lệ chủng Hib gây viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi theo biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase mức độ nhạy cảm với kháng sinh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, phân bố chủng Hib theo genotype hầu hết có khác chủng phân lập từ bệnh nhi viêm màng não chủng phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi; có 01 chủng Hib (khơng xếp loại) 02 chủng (không xếp loại) phân lập từ trẻ khỏe mạnh lần lượt: có genotype với 01 chủng gây viêm màng não có mối liên quan gần gen với 02 chủng gây viêm màng não Vì vậy, đánh giá đặc điểm biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym β-lactamase, mức độ nhạy cảm với kháng sinh Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh khơng có khác Sự khác chủng Hib phân lập từ hai nguồn gốc thể phân bố genotype Điều minh chứng cho thấy để gây bệnh viêm màng não, chủng Hib không phụ thuộc vào đặc điểm biotype, serotype mà phải cần nhiều đến yếu tố độc lực khác [50] 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi nhà trẻ, mẫu giáo Hiện có nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tuổi có mang vi khuẩn H.influenzae nói chung Hib nói riêng Tuy nhiên, tỷ 133 lệ khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố ảnh hưởng chính, bao gồm: kiện sống trẻ (như sống nơi đông đúc, tập trung nhiều người chăm sóc nhà trẻ hay trại trẻ mồ cơi) làm gia tăng tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib; ngược lại, hiệu việc tiêm chủng vacxin đặc hiệu liệu pháp điều trị kháng sinh lại làm tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn Hib giảm đáng kể [28] Tại Việt Nam, hầu hết nghiên cứu tỷ lệ mang vi khuẩn H.influenzae (chưa có điều kiện định typ huyết thanh) trẻ em 60 tháng cộng đồng số tỉnh miền Bắc Lê Huy Chính cộng Kết cho thấy: tỷ lệ trẻ tuổi mang vi khuẩn H.influenzae chiếm 21,4% (trẻ 12 tháng); 35,5% (trẻ 13 - 24 tháng); 32,5% (trẻ 25 - 36 tháng); 27,7% (trẻ 37 - 48 tháng); 31,6% (trẻ 49 - 60 tháng); khơng có khác biệt tỷ lệ trẻ mang H.influenzae nhóm tuổi khác (p > 0,05) [4] Tuy nhiên, nghiên cứu Phạm Văn Ca Lê Đăng Hà năm 2003 Vị Xuyên (Hà Giang) Vân Đồn (Quảng Ninh) cho thấy tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang H.influenzae 24,0% 14,7%; tỷ lệ vi khuẩn H.influenzae Hib tương ứng 73,1% 76,7% [7] Trên giới, phần lớn nghiên cứu trẻ khỏe mạnh mang H.influenzae định typ huyết Nghiên cứu Staphanie H Factor cộng tỷ lệ trẻ tuổi có mang Hib Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung 6% Trong đó, tỷ lệ trẻ mang Hib chiếm: 3% (ở trẻ – tháng); 10% (ở trẻ - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23 tháng); 8% (ở trẻ 24 - 35 tháng); 4% (ở trẻ 36 - 47 tháng) 5% (ở trẻ 48 - 59 tháng) [56] Bên cạnh đó, Gómez Elizabeth cộng nghiên cứu dịch tễ học trẻ khỏe mạnh mang Hib Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (ở trẻ tháng); cao 12,5% (ở trẻ - 11 tháng); 6% (ở trẻ 12 23 tháng); 7,9% (ở trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (ở trẻ 36 - 47 tháng) [62] Thêm 134 vào đó, Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu Muge Oguzkaya - Artan cộng cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ lứa tuổi - mang Hib với tỷ lệ 4,2% [87]; Sao Paulo Brazil, Lucia Ferro Bricks với 1200 trẻ nhỏ tuổi chăm sóc 29 Nhà trẻ Taubaté (trong đó, 213 trẻ khơng tham dự, cịn lại 987) cho thấy 172 trẻ phân lập H.influenzae (17,4%), có 73 chủng Hib Nghĩa tỷ lệ trẻ mang Hib nhà trẻ nghiên cứu 7,4% [36] Vì vậy, hầu hết nghiên cứu nước nước cho thấy tỷ lệ mang H.influenzae nói chung, Hib nói riêng trẻ chăm sóc nhà trẻ - mẫu giáo thường cao (khoảng 15,0% - 25%) Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp lứa tuổi tháng, tỷ lệ cao lứa tuổi từ tháng - tuổi (đặc biệt nhóm tuổi - 11 tháng) giảm dần tuổi trưởng thành [7], [8], [56], [63], [87] Điều kiện sống đông đúc hộ, trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trẻ nhỏ cao cách đáng kể Một số nghiên cứu cho thấy có xảy nhiễm khuẩn xâm lấn Hib, tỷ lệ mang vi khuẩn đứa trẻ khác nhóm 58% trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày 91% nhà giữ trẻ nhỏ Tương tự, gia đình, có trường hợp bị nhiễm bệnh xảy ra, tỷ lệ nhiễm khuẩn khảo sát 6070% anh em ruột 20% bậc cha mẹ [28], [77] Tuy nhiên, số nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn Hib cao số trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày cho dù khơng có trường hợp mắc bệnh xảy Điều cho thấy vi khuẩn Hib lây truyền trẻ mang vi khuẩn triệu chứng Mặc dù thực tế cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib thường 5%, tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày báo cáo chiếm khoảng 15-25% [56], [76], [87], [128] Điển hình nghiên cứu lâu dài 18 tháng trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày Dallas, người ta thấy khơng có trường 135 hợp mắc bệnh tỷ lệ mang vi khuẩn Hib trung bình 10%, đó: trẻ từ 18-35 tháng tuổi tỷ lệ mang vi khuẩn 71%, 48% trẻ từ 3671 tháng tuổi Điều gợi ý nguồn vi khuẩn lứa tuổi mẫu giáo bị lây từ lứa tuổi bé Sự xâm chiếm vi khuẩn tỵ hầu tồn hàng tháng [76] Nghiên cứu tiến hành trẻ tuổi số nhà trẻ - mẫu giáo, với điều kiện hồn tồn khơng mắc bệnh đường hơ hấp, chưa sử dụng vacxin phịng Hib không sử dụng loại kháng sinh vòng 15 trước ngày lấy bệnh phẩm tăm bơng ngốy họng để ni cấy xác định Hib Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ mang vi khuẩn H.influenzae nói chung chiếm 43,8% cao so với nghiên cứu nước Lê Huy Chính năm 2007 [8] Phạm Văn Ca năm 2003 [7], phù hợp với kết nghiên cứu Mỹ [63] Tỷ lệ vi khuẩn Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi chiếm 24,5% cao so với nghiên cứu Phạm Văn Ca (13,5% - 17,5%), tương tự số nghiên cứu giới [65] Điều giải thích đối tượng trẻ khỏe mạnh nghiên cứu thu thập nhà trẻ, mẫu giáo nên tỷ lệ mang Hib thông thường cao trẻ thu thập cộng đồng [56], [128] Ngoài ra, tỷ lệ khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) theo giới, theo nhóm tuổi hay điều kiện nhà trẻ - mẫu giáo điều tra Điều gợi ý cho thấy trẻ tuổi mang Hib ln có tỷ lệ cao hầu hết tất nhà trẻ - mẫu giáo có lây truyền Hib trẻ thuộc nhóm tuổi khác nên dẫn đến khơng có khác biệt tỷ lệ mang vi khuẩn nhóm tuổi 136 KẾT LUẬN 4.1 Tỷ lệ loại biotype chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), chủ yếu tập trung biotype II (lần lượt là: 70,6%; 48,1%) biotype I (lần lượt là: 16,7%; 26,9%), biotype khác (III, IV, V) chiếm tỷ lệ không đáng kể 4.2 Tỷ lệ chủng Hib có khả sinh enzym β-lactamase phân lập từ bệnh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh khác biệt có ý nghĩa thống kê (lần lượt là: 50,0%; 46,2%); gen mã hóa enzym chủ yếu TEM-1 (lần lượt là: 98,0%; 95,8%), ROB-1 chiếm tỷ lệ không đáng kể (lần lượt là: 2,0%; 4,2%) 4.3 Kết xác định mức độ nhạy cảm với số kháng sinh Hib: - Những chủng Hib phân lập nhạy cảm tốt với số loại kháng sinh: cephalosporin hệ 3, clarithromycin, azithromycin, rifampicin (100%) ampicillin/sulbuctam (97,1% Hib gây viêm màng não; 98,1% với chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) - Hib phân lập đề kháng nhiều kháng sinh ampicillin (50,0% Hib gây viêm màng não 48,1% Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) choloramphenicol (54,9% Hib gây viêm màng não 44,2% Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh) Khả đề kháng hai loại kháng sinh có liên quan với khả sinh enzym β-lactamase Hib 4.4 Phân bố genotype (theo kỹ thuật PFGE) Hib gây viêm màng não có tính tập trung vào nhóm genotype chính, chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh có genotype tản mạn vào nhiều gentype khác Trong đó, 1,9% (01) chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh có chung genotype với 01 chủng Hib gây viêm màng não 3,9% (02) chủng Hib khác phân lập từ trẻ 137 khỏe mạnh có genotype liên quan gần gen với genotype 02 chủng Hib khác gây viêm màng não 4.5 Giữa chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh khơng có khác biệt đặc điểm phân loại biotype, khả sinh enzym β-lactamase, gen mã hóa enzym mức độ nhạy cảm với kháng sinh Tuy nhiên, chủng Hib phân lập từ bệnh nhi viêm màng não trẻ khỏe mạnh có khác biệt với phân loại theo genotype 4.6 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo điều tra mang Hib chiếm 24,5% Tỷ lệ khơng có liên quan đến giới, nhóm tuổi trẻ điều kiện nhà trẻ, mẫu giáo (thành thị hay nông thôn) 138 KIẾN NGHỊ Tiến hành tiêm chủng mở rộng vacxin cộng hợp Hib cho trẻ từ sau 02 tháng tuổi Để điều trị có hiệu phịng ngừa phát triển lây lan chủng vi khuẩn Hib kháng thuốc cần coi trọng công tác xét nghiệm điều trị theo kháng sinh đồ Đảm bảo hiệu điều trị diệt khuẩn: cần thu thập chủng vi khuẩn Hib gây bệnh, theo dõi thay đổi tính nhạy cảm với kháng sinh để phát chủng có gen kháng thuốc đột biến (thuộc chủng BLNAR) Tiến hành thu thập số chủng Hib từ bệnh nhi viêm màng não từ trẻ khỏe mạnh tuổi địa điểm với số lượng nhiều để đánh giá phát tán genotype gây viêm màng não cho trẻ tuổi cộng đồng ... tài: ? ?Đặc điểm sinh học phân tử Haemophilus influenzae typ b phân lập từ b? ??nh nhi viêm màng não tuổi trẻ khỏe mạnh nhà trẻ, mẫu giáo? ??, nhằm thực mục tiêu: Xác định biotype, genotype, khả sinh. .. cảm với kháng sinh chủng Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh tuổi số nhà trẻ, mẫu giáo So sánh đặc điểm sinh học Hib gây viêm màng não trẻ tuổi với Hib phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn 3 Chương... chủng Hib phân lập trẻ khỏe mạnh Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân tử chủng Hib gây viêm màng não cho trẻ tuổi trẻ khỏe mạnh lứa tuổi mẫu giáo có mang Hib Chúng thực