TIÊU CHUẨN QUỐC GIA : SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA - PHƯƠNG PHÁP ENZYM Milk - Determination of lactulose content - Enzymatic method

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8108 : 2009 ISO 11285 : 2004 SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA - PHƯƠNG PHÁP ENZYM Milk - Determination of lactulose content - Enzymatic method Lời nói đầu TCVN 8108 : 2009 hồn toàn tương đương với ISO 11285 : 2004; TCVN 8108 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LACTULOZA - PHƯƠNG PHÁP ENZYM Milk - Determination of lactulose content - Enzymatic method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactuloza sữa Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 2.1 Hàm lượng lactuloza (lactulose content) Khối lượng chất xác định theo quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hàm lượng lactuloza biểu thị theo số miligam kilogam Nguyên tắc Chất béo protein kết tủa cách bổ sung dung dịch kẽm sulfat dung dịch kali hexaxyanoferat (II), sau lọc bỏ kết tủa Lactoza lactuloza thủy phân thành galactoza glucoza galactoza fructoza, có mặt enzym β-D-galactosidaza (β-gal) Từ lượng fructoza giải phóng tính lượng lactuloza lactoza + H2O ← β − gal → galactoza + glucoza (1) lactoza + H2O ← β − gal → galactoza + fructoza (2) Lượng lactoza có sữa cao nhiều so với lactuloza Vì vậy, glucoza sinh sau thủy phân gây nhiễu việc xác định fructoza Do đó, hầu hết glucoza oxy hóa thành axit gluconic glucoza oxidaza (GOD) với có mặt oxy: glucoza + H2O + O2 ← GOD  → axit gluconic + H2O2 (3) Bằng phương pháp xác định lượng nhỏ lactuloza có mặt lượng vượt trội lactoza Hydro peroxit sinh phản ứng (3) phân hủy catalaza Phản ứng sử dụng để cung cấp khí oxy cho phản ứng oxy hóa glucoza: catalaza H2O2 ←   → H2O + O2 (4) Lượng glucoza chưa bị oxy hóa cịn lại lượng fructoza sinh từ phản ứng thủy phân lactuloza phosphoryl hóa cách sử dụng adenozin triphosphat (ATP) với có mặt hexokinaza (HK) để tạo glucoza-6-phosphat fructoza-6-phosphat tương ứng glucoza + ATP ← HK → glucoza-6-phosphat + ADP (5) fructoza + ATP ← HK → fructoza-6-phosphat + ADP (6) Glucoza-6-phosphat oxy hóa cách sử dụng NADP + với có mặt glucoza-6phosphat dehydrogenaza, sản phẩm phản ứng 6-phosphogluconat NADPH Sau kết thúc phản ứng NADPH tạo thành xác định cách đo độ hấp thụ bước sóng 340 nm G − − P − DH glucoza-6-phosphat + NADP+ ←  → 6-phosphogluconat + NADPH + H+ (7) Fructoza-6-phosphat đồng phân hóa thành glucoza-6-phosphat với có mặt enzym phosphoglucoza-izomeraza (PGI) Glucoza-6-phosphat oxy hóa theo phản ứng (7) Lượng NADPH tăng lên xác định cách đo độ hấp thụ bước sóng 340 nm, lượng NADPH tương ứng với hàm lượng fructoza lactuloza fructoza-6-phosphat ← PGI  → glucoza-6-phosphat (8) Để xác định fructoza tự có mẫu ban đầu, tiến hành xác định với mẫu trắng mà không thêm β-galactosidaza Giá trị đối chứng trừ vào công thức cuối xác định hàm lượng lactuloza mẫu thử Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích Các thuốc thử dùng để xác định fructoza (4.15 đến 4.18) hợp chất thử nghiệm có bán sẵn Thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 4.1 Nước sử dụng để chuẩn bị dung dịch enzym dung dịch đệm nước chưng cất hai lần dụng cụ thủy tinh Nước sử dụng cho mục đích khác nước cất dụng cụ thủy tinh có độ tinh khiết tương đương 4.2 Dung dịch kẽm sulfat, ρ (ZnSO4) = 300 g/l Hòa tan 30,0 g kẽm sulfat ngậm bảy phân tử nước (ZnSO 4.7H20) nước đựng bình định mức vạch dung tích 100 ml (5.2) Thêm nước đến vạch trộn 4.3 Dung dịch kali hexaxyanoferat (II), ρ (K4[Fe(CN)6]) = 150 g/l Hòa tan 15,0 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K 4[Fe(CN)6].3H2O) nước đựng bình định mức vạch dung tích 100 ml (5.2) Thêm nước đến vạch trộn 4.4 Dung dịch đệm A, pH = 7.5 Hòa tan 4,80 g dinatri hydrophosphat (Na2HPO4), 0,86 g natri dihydrophosphat ngậm phân tử nước (NaH2PO4.H2O) 0,10 g magiê sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO 4.7H2O) vào 80 ml nước (4.1) Chỉnh pH đến 7,5 ± 0,1 nhiệt độ 20 °C dung dịch natri hydroxit mol/l (4.10), cần Thêm nước đến 100 ml trộn (đủ cho khoảng 15 lần phân tích) 4.5 Dung dịch đệm B, pH = 7,6 Hòa tan 14,00 g trietanolamin hydroclorua [N(CH2CH2OH)3.HCl] 0,25 g magiê sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O) vào 80 ml nước (4.1) Chỉnh pH đến 7,6 ± 0,1 nhiệt độ 20 °C dung dịch natri hydroxit mol/l (4.10), cần Thêm nước đến 100 ml trộn (đủ cho khoảng 60 lần phân tích) 4.6 Dung dịch đệm C Pha loãng 40,0 ml dung dịch đệm B (4.5) nước đến 100 ml trộn (cho khoảng 50 lần phân tích) 4.7 Natri hydro cacbonat (NaHCO3) 4.8 Hydro peroxit (H2O2), 30% (khối lượng) 4.9 Octan-1-ol (C8H18O) 4.10 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,33 mol/l mol/l 4.11 β -D-galactosidaza (β-gal), có nguồn gốc từ E coli (β-gal EC 3.2.1.23), huyền phù mg/ml dung dịch amoni sulfat [(NH4)2SO4] 3,2 mol/l, chứa 30 đơn vị miligam (ở 25 °C với chất lactoza) 300 đơn vị miligam [ở 37 °C với chất 2-nitrophenyl-β-D-galactozid (onitrophenyl-β-D-galactopyranosid)], tương ứng 4.12 Glucoza oxydaza (GOD, có nguồn gốc từ Aspergillus niger (EC 1.1.3.4), độ tinh khiết cấp II, dạng đông khô, chứa 200 đơn vị miligam (ở 25 °C với chất glucoza) 230 đơn vị miligam (ở 37 °C với chất glucoza) 4.13 Dung dịch oxy hóa Hịa tan 20 mg glucoza oxidaza (4.12) ml nước Chuẩn bị dung dịch trước sử dụng 4.14 Catalaza, từ gan bò (EC 1.11.1.6), huyền phù 20 mg/ml nước (đã ổn định), chứa 65 000 đơn vị miligam (ở độ 25 °C với chất H2O2) 4.15 Hexokinaza/glucoza-6-phosphat-dehydrogenaza (HK/G6P-DH) hỗn hợp enzym từ nấm men (EC 2.7.1.1 EC 1.1.1.49), huyền phù dung dịch amoni sulfat ([NH 4]2SO4) 3,2 mol/l, HK G6P-DH: - HK: mg/ml; 140 đơn vị miligam (ở 25 °C với chất glucoza ATP); - G6P-DH: mg/ml; 140 đơn vị miligam (ở 25 °C với chất glucoza-6-phosphat) 4.16 Phosphoglucoza izomeraza (PGI), từ nấm men (EC 5.3.1.9) Huyền phù dung dịch amoni sulfat ([NH 4]2SO4) 3,2 mol/l; - PGI: mg/ml; 350 đơn vị miligam (ở nhiệt độ 25 °C với chất fructoza-6-phosphat) CHÚ THÍCH Các số EC 4.11, 4.12, 4.14 đến 4.16 đề cập đến số Phân loại enzym Ủy ban Danh pháp Hội Hóa sinh quốc tế quy định CHÚ THÍCH Đơn vị đề cập 4.11, 4.12, 4.14 đến 4.16 [thường gọi Đơn vị quốc tế (International Unit) hay Đơn vị chuẩn (Standard Unit) xác định theo lượng enzym xúc tác để chuyển hóa µmol chất phút điều kiện chuẩn 4.17 Dung dịch ATP Hòa tan 50 mg muối dinatri adenozin-5-triphosphat (5-ATP-Na 2) 50 mg natri hydrocacbonat (NaHCO3) ml nước 4.18 Dung dịch NADP Hòa tan 10 mg muối dinatri β-nicotinamid adenin dinucleotits phosphat (β-NADP-Na2) ml nước Thiết bị dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 5.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,001 g 5.2 Bình định mức vạch, dung tích 10 ml, 20 ml 100 ml 5.3 Bình nón, có nút thủy tinh mài, dung tích 50 ml 5.4 Phễu, đường kính 50 mm 5.5 Giấy lọc gấp nếp, tốc độ dịng trung bình, đường kính 125 mm 70 mm 5.6 Nồi cách thủy tủ sấy, trì nhiệt độ 40 °C ± °C 5.7 Máy đo phổ, thích hợp để đo bước sóng 340 nm Có thể sử dụng máy đo quang có lọc đường phổ thích hợp để đo bước sóng 365 nm 334 nm (đèn thủy ngân) Hệ số hấp thụ phân tử NADPH (xem 9.1) 3,4 (ở bước sóng 365 nm) 6,18 (ở bước sóng 334 nm) (l.mmol-1.cm-1) 5.8 Cuvet, làm thủy tinh chất dẻo, có chiều dài đường quang 10,0 mm Trong trường hợp sử dụng cuvet chất dẻo cần kiểm tra chiều dài đường quang 5.9 Pipet, dung tích 20 µl, 50 µl, 100 µl, ml, ml, ml 10 ml, thích hợp để phân tích enzym 5.10 Pipet chia độ, dung tích ml 10 ml 5.11 Que khuấy, dùng để trộn dung dịch cuvet 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị hư hỏng không bị biến đổi chất lượng trình vận chuyển hay bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị mẫu thử Trộn kỹ mẫu thử để thu mẫu đại diện Chuẩn bị mẫu thử cho phép thử trắng, xem 8.6 Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị dung dịch thử Cân khoảng 50g mẫu thử chuẩn bị (Điều 7), xác đến 0,001 g, vào bình định mức vạch dung tích 100 ml (5.2) Pha lỗng nước đến vạch trộn 8.2 Làm Dùng pipet (5.10), thêm 10,0 ml dung dịch thử (8.1) vào bình nón 50 ml (5.3) Lần lượt thêm dung dịch sau, lần dùng pipet khác nhau: 1,75 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (4.3), 1,75 ml dung dịch kẽm sulfat (4.2) 6,5 ml dung dịch đệm A (4.4), xoay bình sau lần thêm Lọc dung dịch thu qua giấy lọc gấp nếp (5.5) đường kính 125 mm Loại bỏ vài mililit dịch lọc B.3 Thủy phân lactoza lactuloza Dùng pipet lấy 5,0 ml dịch lọc thu (8.2) cho vào bình định mức vạch dung tích 10 ml (5.2) Dùng pipet (5.9), thêm 50 µl β-D-galactosidaza (4.11) Đậy nắp bình trộn Ủ bình định mức nồi cách thủy tủ sấy (5.6) nhiệt độ 40 °C 10h (để qua đêm) 8.4 Oxy hóa glucoza Dùng pipet quy định (5.9), thêm vào dung dịch thủy phân (8.3) lần lượt: 2,0 ml dung dịch đệm C (4.6), 100 µl dung dịch oxy hóa (4.13), giọt chất chống tạo bọt octan-1-ol (4.9), 0,5 ml dung dịch natri hydroxit 0,33 mol/l (4.10) để trung hòa axit gluconic sinh ra, 50 µl hydro peroxit (4.8) 0,1 ml catalaza (4.14), trộn sau lần thêm Ủ hỗn hợp thu nồi cách thủy tủ sấy (5.6) nhiệt độ 40 °C 3h 8.5 Lọc Sau ủ (8.4), pha loãng hỗn hợp nước đến 10 ml trộn Lọc qua giấy lọc gấp nếp đường kính 70 mm (5.5) Loại bỏ vài mililit dịch lọc 8.6 Phép thử trắng Thực phép thử trắng Tiến hành quy định 8.2 đến 8.5 mẫu thử không thêm β-D-galactosidaza 8.7 Xác định glucoza fructoza Tiến hành theo quy định Bảng Bảng - Xác định glucoza fructoza Quy trình Mẫu trắng Mẫu thử dung dịch đệm B (4.5) 1,00 ml 1,00 ml dung dịch ATP (4.17) 0,100 ml 0,100 ml dung dịch NADP (4.18) 0,100 ml 0,100 ml dịch lọc (8.5) 1,00 ml 1,00 ml nước cất hai lần (4.1) 1,00 ml 1,00 ml Dùng pipet lấy vào cuvet: a Trộn Sau đọc độ hấp thụ (A1) dung dịch Bắt đầu phản ứng cách thêm hexokinaza/glucoza-6phosphat-dehydrogenaza (4.15) 20 µl 20 µl Trộna, chờ đến phản ứng kết thúc (khoảng 10 min) Đọc độ hấp thụ (A2) dung dịch Bắt đầu phản ứng cách thêm phosphoglucoza izomeraza (4.16) 20 µl 20 µl Trộna, chờ đến phản ứng kết thúc (khoảng 10 đến 15 min) Đọc độ hấp thụ (A3) dung dịch a Dùng que khuấy (5.11) để trộn cho cuvet Nếu độ hấp thụ ml dịch lọc tăng vượt q 1,3 giảm thể tích lọc mẫu thử (8.5) tăng thêm nước cho tổng thể tích dịch lọc nước 2,00 ml Thay thể tích dịch lọc mẫu trắng 8.6) giống dịch lọc mẫu thử Độ hấp thụ tốt nên nằm dải từ 0,1 đơn vị đến 1,0 đơn vị, 0,05 giá trị nhỏ chấp nhận Tính biểu thị kết 9.1 Tính 9.1.1 Chênh lệch độ hấp thụ 9.1.1.1 Mẫu thử Tính chênh lệch độ hấp thụ mẫu thử, ∆As, theo công thức: ∆As = (A3 - A2) A2 giá trị độ hấp thụ thu sau thêm hexokinaza/glucoza-6-phosphat-dehydrogenaza (xem 8.7); A3 giá trị độ hấp thụ thu sau đồng phân hóa fructoza thành glucoza (xem 8.7) 9.1.1.2 Phép thử trắng Tính chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng, ∆AB, theo công thức: ∆AB = (A3 - A2) 9.1.1.3 Độ hấp thụ Tính chênh lệch độ hấp thụ thực liên quan đến hàm lượng lactuloza, ∆AL, theo công thức: ∆AL = ∆As - ∆AB 9.1.2 Hàm lượng lactuloza Tính hàm lượng lactuloza, ω, biểu thị theo số miligam lactuloza kilogam mẫu thử, theo công thức sau đây: ω = x ∆AL ∆AL giá trị độ hấp thụ tăng tạo thành fructoza từ lactuloza (9.1.1.3); ML giá trị khối lượng phân tử tương đối lactuloza (M L = 324,3 g.mol-1); ε giá trị độ hấp thụ phân tử NADPH bước sóng 340 nm, ε = 6,3 (l.mmol-1.cm-1); độ hấp thụ phân tử bước sóng 334 nm 365 nm, xem 5.7; V1 tổng thể tích chất lỏng cuvet (nghĩa V1 = 3,240 ml) (8.7), tính mililit (ml); V2 thể tích dịch lọc cuvet (nghĩa V2 = 1,00 ml) (8.7), tính mililit (ml); d độ dài đường quang cuvet (nghĩa d = 1,000 cm) (5.8), tính centimet (cm); m khối lượng phần mẫu thử (8.1), tính gam (g) 9.2 Biểu thị kết Biểu thị kết đến chữ số thập phân 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại độ tái lập thu từ kết phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo ISO 5725 : 19861) công bố (xem [5] [6]) Các giá trị nhận từ phép thử liên phịng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử độc lập, riêng rẽ, thu sử dụng phương pháp, loại vật liệu thử, phòng thử nghiệm, người thao tác sử dụng thiết bị khoảng thời gian ngắn nhau, không 5% trường hợp lớn giá trị sau: - sữa UHT có hàm lượng lactuloza trung bình 278 mg/kg: r = 10,6 mg/kg; s = 3,8 mg/kg; - sữa tiệt trùng có hàm lượng lactuloza trung bình 1044 mg/kg: r = 24,0 mg/kg; s = 8,5 mg/kg 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử độc lập, riêng rẽ, thu sử dụng phương pháp, loại vật liệu thử, phòng thử nghiệm khác nhau, người thao tác khác thực sử dụng thiết bị khác nhau, không 5% trường hợp lớn giá trị sau: - sữa UHT có hàm lượng lactuloza trung bình 278 mg/kg: R = 32,3 mg/kg; s R = 11,4 mg/kg; - sữa tiệt trùng có hàm lượng lactuloza trung bình 1044 mg/kg: R = 77,2 mg/kg; s R = 27,3 mg/kg 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, cho tùy chọn, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; e) kết thử nghiệm thu được, kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] Enzyme Nomenclature Recommedations, Academic Press, New York, 1984 [5] FEIER and GOETSCH Milchwissenschaft, 45(7), 1990, pp 440-441 1) Dữ liệu độ chụm thu được, sử dụng ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by interlaboratory test (Độ chụm phương pháp thử - Xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp thử chuẩn phép thử liên phòng thử nghiệm (đã hủy) [6] Bundesgesundheitsblatt (BGB), April 1990, Nr.4, p 176 ... KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2... chất lượng trình vận chuyển hay bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị mẫu thử Trộn kỹ mẫu thử để thu mẫu đại diện Chuẩn bị mẫu thử cho phép