Microsoft Word Môc lôc docx Y häc thùc hµnh (787) – sè 10/2011 65 PH¸T HIÖN VI RóT DENGUE Vµ VI RóT CHIKUNGUNYA TR£N BÖNH NH¢N SèT XUÊT HUYÕT B»NG PCR §A MåI VŨ XUÂN NGHĨA1,2; NGUYỄN ĐÌNH ỨNG1; NGUYỄN[.]
PHáT HIệN VI RúT DENGUE Và VI RúT CHIKUNGUNYA TRÊN BệNH NHÂN SốT XUấT HUYếT BằNG PCR ĐA MồI 1,2 VŨ XUÂN NGHĨA ; NGUYỄN ĐÌNH ỨNG ; 1,2 NGUYỄN THU THỦY ; NGUYỄN TRỌNG VIỄN TT nghiên cứu ứng dụng Y Sinh Dược học - Học viện Quân y Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Dengue (DENV) thuộc họ Flavivirus có serotype Nhiễm DENV, đặc biệt trường hợp có kết hợp serotype DENV, gây nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, thay đổi từ nhiễm trùng không triệu chứng đến bệnh sốt cấp tính (sốt Dengue) Sốt xuất huyết Dengue (SXH-D) hội chứng sốc Dengue gây tử vong Virus Chinkungunya (CHIKV) thuộc nhóm Alphavirus, họ Togaviridae Cả hai loại virus gây bệnh thông qua vector muỗi Các vector CHIKV/DENV Aedes aegypti Aedes albopictus Thời gian gần đây, CHIKV lên nguyên nhân gây sốt xuất huyết Đông Nam Á khu vực Thái Bình Dương Bệnh cảnh lâm sàng CHIKV gây nguy hiểm không so với DENV Ở Việt Nam, theo số liệu Cục y tế dự phòng môi trường – Bộ Y tế, tháng cuối năm 2009 số ca mắc SXH Hà Nội – địa phương 10 năm qua số ca mắc bệnh mức thấp tăng gấp 14 lần so với kỳ năm 2008 Trong số ca chẩn đốn SXH có tới 50% xác định nhiễm DENV Những khu vực phân lập CHIKV khu vực có dịch SXH Dengue lưu hành Bởi vậy, nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR đa mồi phát đồng thời DENV CHIKV Kết góp phần vào điều trị dự phòng bệnh sốt xuất huyết DENV CHIKV gây ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh nhân nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng huyết tương (n=50) bệnh nhân giai đoạn cấp vụ dịch sốt xuất huyết 2009 từ viện quân y 103 trạm xá xã Tản Lĩnh, Thanh Trì Hà Nội Bệnh nhân nhập viện trung tâm y tế với biểu sốt cao, phát ban xuất huyết Nhiều bệnh nhân có biểu đau sưng khớp Nhóm người khỏe mạnh (n=10) sử dụng chứng âm nghiên cứu Chứng dương Chứng dương CHIKV plasmid bao gồm tồn đoạn gene mã hóa cho protein màng E1 clone vào vector pGOV4 Đây plasmid nhận từ Malaysia theo chương trình hợp tác nghiên cứu Chứng dương DEN thiết kế trung tâm Y Sinh Dược học Học viện Quân y Nó cấu trúc gồm đoạn gene đặc hiệu DEN clone vào vector pGOV4 cặp mồi DEN1, DEN2 Thiết kế mồi cho PCR đa mồi Các primers đặc hiệu cho CHIKV DEN thiết kế lựa chọn dựa công bố trước Những primer đánh giá cho chuẩn hóa với qui trình chuẩn Onestep RT-PCR đảm bảo tính đặc hiệu nhạy cặp mồi CHIKV E1F =5’ACCGGCGTCTACCCATT-3’ E1R=5’AGGGCGGGTAGTCCATG-3’, dựa CHIKV (S27 Y häc thùc hµnh (787) – sè 10/2011 strain) (GenBank accession no AF490259) Cặp mồi DEN DEN1-(5'-TCAATATGCTGAAACGCGC-3’ DEN2- (5'-TGCACCAACAGTCAATGT-3') theo trình tự DEN type II công bố 4.Tách chiết RNA virus RNA virus tách từ 150µl plasma Qiagen RNA Blood mini kit theo qui trình chuẩn (Qiagen, Germany) cất giữ -800C đến sử dụng Chuẩn hóa qui trình Onestep RT-PCR đa mồi Qui trình thực theo hướng dẫn kít có thay đổi để tối ưu hóa phương pháp Thành phần tham gia phản ứng: 5x Qiagen Onestep RT-PCR buffer, dNTP 10mM, cặp mồi phát CHIKV DEN 20pmol, enzyme Mix 2,5 đơn vị, RNA virus nước cất vừa đủ 50µl Chu trình nhiệt thực theo 45 °C 45 phút Tiếp đến 95 °C phút 40 vòng giai đoạn: duỗi xoắn 94 °C 30 s, bám mồi 55 °C phút, kéo dài 72 °C phút Cuối giai đoạn kéo dài 72 °C 10 phút Sản phẩm PCR chạy Agarose Gel 1,2% 100v chụp hệ thống máy đọc gel KẾT QUẢ Chuẩn hóa Onestep RT-PCR đa mồi Phương pháp Onestep RT-PCR đa mồi chuẩn hóa với chứng dương kết PCR CHIKV DEN chạy agarose gel 1,2% với 100v đạt 331 bp 511 bp riêng biệt (1) (2) Hình 1: Chuẩn hóa qui trình chạy Onestep RT-PCR đa mồi CHIKV (1), DEN (2) M: marker DNA 50bp; P+: chứng dương Lane 1: chứng âm; Phát DENV CHIKV Onestep RTPCR đa mồi Phương pháp Onestep RT-PCR đa mồi sử dụng phát nhanh, xác RNA CHIKV DENV mẫu nghiên cứu Trong 50 mẫu nghiên cứu 65 cho thấy số mẫu nhiễm DENV 20/50 (40%), CHIKV 4/50 (8%) đồng nhiễm DENV/CHIKV 3/50 (6%) Hình ảnh đồng nhiễm (mẫu 4,5,6) rõ vạch band có độ lớn 331 bp 511bp (Hình 2) Hình 2: Kết chạy RT-PCR bệnh nhân đồng nhiễm DENV CHIKV (M) Thang chuẩn; (1) chứng âm; (2) chứng dương DENV; (3) chứng dương CHIKV; (4,5,6) Bệnh nhân đồng nhiễm DENV/CHIKV BÀN LUẬN Phương pháp Onestep RT-PCR đa mồi sử dụng nghiên cứu cho phép kỹ thuật thực nhanh hơn, thuận lợi giảm thiểu tối đa khả lây nhiễm Hơn nữa, sử dụng Onestep RT-PCR đa mồi phát sớm virus CHIKV DENV nhóm bệnh nhân có nguy cao nhiễm hai loại virus mở hướng cơng tác phịng chống bệnh sốt xuất huyết nước ta Kết cho thấy, 50 mẫu bệnh phẩm, tỉ lệ nhiễm CHIKV 4/50 chiếm 8%, nhiễm DENV 20/50 chiếm 40% đồng nhiễm 3/50 chiếm 6% Tỉ lệ nhiễm CHIKV đồng nhiễm CHIKV/DENV vụ dịch cao so với số khu vực giới Gabon, số 773 bệnh nhân sốt xuất huyết có đến 275 dương tính với CHIKV 54 với DENV khơng có ca đồng nhiễm DENV CHIKV Với kết ban đầu cho thấy vụ dịch sốt xuất huyết không DEN gây mà thay đổi tích chất, cường độ dịch phản ánh vai trò CHIKV vụ dịch KẾT LUẬN Phương pháp sinh học phân tử Onestep RT-PCR đa mồi thực nghiên cứu phương pháp hữu dụng sử dụng phát sớm nhanh CHIKV, DENV Bởi vậy, sử dụng rộng rãi chẩn đoán thường quy khu vực có dịch, có virus lưu hành khơng có dịch Mặc dù tỉ lệ phát CHIKV, DENV đồng nhiễm CHIKV/DENV nhóm bệnh nhân sốt xuất huyết khơng cao (4/50; 20/50; 3/50) cho thấy lưu hành đồng thời CHIKV DENV khu vực có tỉ lệ bệnh nhân xuất huyết cao DETECTION OF DENGUE FEVER AND CHIKUNGUNYA VIRUS ON HEMORRAGIC FEVER PATIENTS BY MULTI-PCR Both of Chikungunya virus (CHIKV) and Dengue fever virus (DENV) are of considerable public health concern in Southeast Asian and African countries Despite of serological evidence, the diagnosis of this arthropod-borne human disease is confirmed infrequently and needs to be improved In fact, illness caused by CHIKV or DENV can be confused with each other, based on the similarity of the symptoms, and laboratory confirmation of suspected cases is required to launch control measures during an epidemic Moreover, no sensitive and early tool is described to detect CHIKV/DENV in clinical samples In this study, a specific and sensitive multi-RT-PCR assay was used as a tool to detect CHIKV/DENV Results showed that cases were positive with CHIKV, 20 cases were positive with DENV and cases were co-infection with CHIKV/DENV in 50 suspected clinical samples TÀI LIỆU THAM KHẢO Bodenmann P, Genton B Chikungunya, an epidemic in real time Lancet 2006, Vol 368, p.258 Harendra S Chahar, Preeti Bharaj, Lalit Dar, Randeep Guleria, Sushil K Kabra, and Shobha Broor Co-infections with Chikungunya Virus and Dengue Virus in Delhi, India, Emerg Infect Dis 2009, 15(7), pp.10771080 Carey, D E Chikungunya and dengue, a case of mistaken identity? J Hist Med Allied Sci 1971, Vol 26, pp.243-262 Charrel RN, de Lamballerie X, Raoult D Chikungunya outbreaks-the globalization of vectorborne diseases N Engl J Med 2007, Vol 356, pp.769-771 Kowalzik S, Xuan NV, Weissbrich B, Scheiner B, Schied T, Drosten C, Mỹller A, Stich A, Rethwilm A, Bodem J.Characterization of a chikungunya virus from a German patient returning from Mauritius and development of a serological test Med Microbiol Immunol.2008, 197 (4), pp.381-386 Robinson MC An epidemic of virus disease in southern province, Tanganyka Territory, in 19521953.Trans R Soc Trop Med Hyg.1955, 49, pp.28-32 Mét sè yÕu tè tiên lượng sốc bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue điều trị khoa Truyền nhiễm Bệnh viện 103 năm 2009 Đỗ Tuấn Anh Bộ môn Khoa truyền nhiễm viện 103-HVQY Tóm tắt Nghiên cứu 258 bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue (SXHD) có sốc không sốc điều trị khoa Truyền nhiễm Bệnh viện 103 năm 2009, rút số yếu tố tiên lượng sèc sau: 66 Y häc thùc hµnh (787) – sè 10/2011 Ngoài dấu hiệu TCYTTG (1986) đưa (Vật v li bì, đau bụng tăng lên, lạnh đầu chi, da xung huyết, đái ít) dấu hiệu: hạ sốt đột ngột, gan to, nôn nhiều, tràn dịch màng tim, tràn dịch màng phổi, tràn dịch màng bụng, xuất huyết nội tạng