Nghiên cứu xác định một số micrornas tiềm năng liên quan đến u thần kinh đệm (Glioma) nghiên cứu dữ liệu microarray từ GEO và các công cụ thống kê sinh học được dùng để đánh giá mức độ biểu hiện miRNAs liên quan đến Glioma ở bệnh nhân châu Á. Kết quả cho thấy miR-6780a-5p và miR-6754-3p đóng vai trò như một miRNA ức chế khối u và giá trị AUC của hai phân tử này nằm trong khoảng 84%-88%. Mời các bạn cùng tham khảo!
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ MICRORNAS TIỀM NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN U THẦN KINH ĐỆM (GLIOMA) Nguyễn Bằng Phi1, Võ Hoàng Xuân Đạt2 Viện Phát Triển Ứng Dụng,Trường Đại học Thủ Dầu Một Khoa Khoa Học Sinh Học, Trường Đại học Nơng Lâm TPHCM TĨM TẮT U thần kinh đệm (Glioma) loaị khối u gây chết người chiếm phần lớn các loại khối u ác tính não hệ thống thần kinh trung ương Ngày nay, việc áp dụng các dấu ấn sinh học chẩn đoán, tiên lượng ngày trọng microRNA (miRNA) lên dấu ấn cho việc phát Glioma Trong nghiên cứu này, liệu microarray từ GEO các công cụ thống kê sinh học dùng để đánh giá mức độ biểu miRNAs liên quan đến Glioma bệnh nhân châu Á Kết cho thấy miR-6780a-5p miR-6754-3p đóng vai trò miRNA ức chế khối u giá trị AUC hai phân tử nằm khoảng 84%-88% Mơ hình chẩn đoán dựa phân tử đánh giá có khả chẩn đoán tiên lượng Glioma với độ nhạy độ chuyên biệt 87,71% 74,71% Kết đạt nghiên cứu hứa hẹn tiềm sử dụng cặp phân tử miRNAs miR-6780a-5p miR-6754-3p cho các đánh giá thực nghiệm tương lai Từ khoá: biểu gen, chẩn đoán, microRNA, tin sinh học, u thần kinh đệm ĐẶT VẤN ĐỀ U thần kinh đệm (Glioma) xem loại ung thư chiếm phần ba loại khối u não đa số hệ thần kinh trung ương Glioma thường bắt nguồn từ hệ thống tế bào thần kinh đệm bao gồm hai loại khối u lành tính không lan tỏa khối u lan tỏa (ác tính), đó khối u lan tỏa nguy hiểm, dễ tái phát khó điều trị chúng len lỏi vào hệ thống tế bào thần kinh dây thần kinh (Mondal & Kulshreshtha, 2021) Các khối u lành tính WHO xếp vào nhóm khối u cấp khối u ác tính phân thành nhiều loại từ cấp đến giai đoạn cao cấp gọi u nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) (Louis nnk., 2016) Mặt khác Glioblastoma (GB) đại diện cho 6070% khối u thần kinh đệm ác tính phân thành dạng u nguyên phát u thứ phát (Ohgaki & Kleihues, 2013) GB dạng u thần kinh đệm mạnh bệnh nhân mang khối u thường sống 15 tháng với tiên lượng xấu khả tái phát cao việc chẩn đoán bệnh thường phát giai đoạn muộn CT-MRI triệu chứng biểu rõ Hiện phương pháp điều trị GB phẫu thuật cắt bỏ khối u kết hợp hóa xạ trị việc phẫu thuật cắt bỏ hồn tồn khơng thể với tổn thương não có thể mắc phải (Alifieris & Trafalis, 2015; Tamimi & Juweid, 2017) Gần việc phát triển thị sinh học không xâm lấn mở bước ngoặt cho việc chẩn đoán sớm tiên lượng GB Một thị sinh học tiềm chẩn đoán nhiều loại ung thư 210 chính biểu phân tử miRNAs tế bào (Calin & Croce, 2006; Visone & Croce, 2009) Hiện nay, cơng nghệ “omics” đóng vai trị quan trọng việc phát miRNAs vốn phân tử RNA nhỏ không mã hóa gây tượng kìm hãm dịch mã suy thối mRNA (Iorio & Croce, 2009) Việc đánh giá dạng biểu miRNA cách sử dụng phương pháp đại microarray giải trình tự hệ (Next generation sequencing – NGS) hữu ích để hiểu đặc điểm ung thư nói chung u nguyên bào thần kinh đệm (GB) tìm dấu hiệu miRNA tiềm quan trọng có thể sử dụng để chẩn đốn khơng xâm lấn (Dat nnk., 2022; Murakami nnk., 2014) Trong nghiên cứu phân tử miRNAs liên quan đến Glioma xác định thu thập từ sở liệu microarray Gene Expression Omnibus (GEO) nhằm có phân tích ổn định chúng cho trình chẩn đoán tiên lượng Glioma bệnh nhân nhóm châu Á Thông qua công cụ tin sinh học, miRNAs thống kê xem xét mức độ biểu khác biệt mẫu mô ung thư mô khỏe bệnh nhân châu Á Sau đó, chúng tơi đánh giá hiệu mơ hình chẩn đốn dựa miRNAs tiềm để tìm nhóm phân tử miRNA hiệu cho việc chẩn đốn tiên lượng Glioma hỡ trợ cho nghiên cứu thực nghiệm mẫu bệnh phẩm Việt Nam PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Tìm kiếm thu thập liệu: Phương pháp nghiên cứu thực theo phương pháp Dat nnk (2022) Trên sở liệu biểu gene, Gene Expression Omnibus (GEO) NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), số cơng cụ truy cập, tìm kiếm nâng cao, trình duyệt dataset, GEO2R, xây dựng cho việc tìm kiếm phân tích liệu biểu gene Các mẫu microarray chứa liệu biểu miRNA mẫu huyết bệnh nhân mang khối u glioma thu thập thông qua cụm từ khóa “Glioma”; “miRNA”; “Expression profiling by array” 2.2 Phát miRNA biểu khác biệt (DEMs): Dữ liệu biểu miRNA phân nhóm theo kiểu hình mơ ung thư mơ khỏe Các giá trị lỗi “null” mẫu mẫu loại bỏ khỏi nghiên cứu Các miRNA đánh giá thống kê mức độ biểu khác biệt hai nhóm đối tượng công cụ GEO2R với mức kiểm định thống kê Benjamini & Hochberg (FDR) Danh pháp phân loại miRNAs kiểm tra sở liệu cấu trúc miRNAs, MIRBase (http://www.mirbase.org/) Các phân tử miRNAs xác định có biểu khác biệt giá trị p < 0.001 giá trị FDR 2 Cơng cụ Venn diagram dùng để tìm kiếm miRNAs có biểu khác biệt mẫu khác (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) Công cụ giúp loại bỏ phân tử miRNAs biểu khác biệt mẫu mà mẫu khác khác biệt giúp loại bỏ trường hợp dương tính giả 2.3 Phân tích đường cong ROC giá trị AUC: Giá trị biểu DEMs đưa vào phần mềm Graphpad Prism 8.3.4, dựa kiểu hình mẫu để xem xét độ nhạy độ đặc hiệu mơ hình xây dựng Sau chuẩn hóa liệu, đường cong Receiveroperating characteristic (ROC) xây dựng tính toán diện tích bên đường cong (AUC) theo phương pháp Willson/ Brown Giá trị AUC cho thấy mức độ hiệu mỗi 211 DEM chẩn đoán dao động từ đến 1, đó mơ hình chẩn đốn xem có hiệu đạt giá trị AUC từ 0,8 trở lên đến xấp xỉ Mơ hình nhóm miRNAs tiềm xây dựng dựa mơ hình hồi quy tuyến tính nhị phân với biến độc lập biểu miRNAs biến phụ thuộc kiểu hình bệnh mẫu Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thu thập liệu microarrays phân tử miRNA liên quan đến u thần kinh đệm Glioma Thông qua công cụ chọn lọc, mẫu ghi nhận để nghiên cứu mẫu có chứa thông tin biểu phân tử miRNAs tiềm hai nhóm đối tượng người khỏe bệnh nhân mang khối u Có tổng cộng mẫu có chứa thông tin biểu miRNA liên quan đến Glioma chọn sử dụng nghiên cứu GSE112264; GSE124158 GSE113740 Bộ mẫu GSE112264 gồm có 1591 mẫu với 50 mẫu bệnh 41 mẫu khỏe (Urabe nnk., 2019) Như thể Bảng 1, mẫu GSE113740 gồm 25 mẫu khối u 1033 mẫu bình thường (Yamamoto nnk., 2020) mẫu GSE124158 có 30 mẫu u đệm 275 mẫu khỏe (Asano nnk., 2019) Những nghiên cứu RNA không mã hóa nói chung miRNA nói riêng nhận nhiều quan tâm gần hứa hẹn dấu ấn sinh học cho việc chẩn đoán tiên lượng ung thư bệnh lý khác bao gồm glioma Bảng Thông tin dataset dùng nghiên cứu GEO accession Bộ dữ liệu microarray Quốc gia Số lượng mẫu Tài liệu tham khảo GSE112264 GPL21263 Nhật Bản Mẫu khỏe: 41 Mẫu bệnh: 50 (Urabe nnk., 2019) GSE113740 GPL21263 Nhật Bản Mẫu khỏe: 1033 Mẫu bệnh: 25 (Yamamoto nnk., 2020) GSE124158 GPL21263 Nhật Bản Mẫu khỏe: 275 Mẫu bệnh: 30 (Asano nnk., 2019) 3.2 Biểu miRNA khác biệt (DEMs) mẫu Dựa phân tích mức độ biểu phân tử miRNA liên quan đến u thần kinh đệm (Glioma) với liệu microarray sử dụng nghiên cứu này, kết có 659/2565 miRNAs thể khác biệt mặt điều hòa gen người khỏe người măc khối u mẫu GSE112264 Con số hai mẫu lại 1014/2565 với mẫu GSE113740 26/2565 mẫu GSE124158 Bằng công cụ Venn diagram, DEMs thể khác biệt biểu người mắc u thần kinh đệm so với người bình thường xác định nghiên cứu (Hình 1) Trong đó bao gồm miRNAs ức chế khối u miR-6780a-5p miR-6754-3p, phân tử lại chưa thể ổn định khuynh hướng biểu mẫu vừa đóng vai trò miRNAs ức chế khối u miRNAs gây ung thư Glioma (Bảng 2) Mức độ biểu trung bình miR6780a-5p miR-6754-3p cho thấy khác biệt giảm lớn xấp xỉ 2,9 3,5 lần so với biểu thông thường chúng mẫu đối chứng phù hợp làm dấu ấn cho việc chẩn đoán tiên lượng Glioma dựa ngưỡng biểu (Bảng 2) 212 Bảng Kết thể mức độ biểu các DEMs trùng lắp mẫu liệu microarray Số lần khác biệt MicroRNA miR-518a-3p miR-6780a-5p miR-6750-3p miR-6885-3p miR-6754-3p miR-1976 GSE112264 GSE124158 GSE113740 Số trung bình 3.434 -3.030 -4.033 2.720 -4.054 -4.765 -3.360 -2.314 2.139 -2.981 -2.220 3.772 5.064 -3.490 -3.608 -3.268 -4.205 -4.217 1.713 -2.945 -1.834 -1.176 -3.493 -1.737 Khuynh hướng Điều hoà Chưa rõ Giảm Chưa rõ Chưa rõ Giảm Chưa rõ Mối tương quan hai phân tử ung thư nói chung ghi nhận song chưa có nghiên cứu ghi nhận bệnh nhân mắc u nguyên đệm MiR-6780a-5p ghi nhận tăng biểu khối mô ung thư biểu mô tế bào thân so với khối mô bình thường tham gia vào việc điều hịa trục tín hiệu E-cadherin / EMT giúp ngăn chặn di cư xâm lấn tế bào ung thư biểu mô (Asano nnk., 2019) Trong miR-6754-3p báo cáo 16 dấu ấn phân tử cho bệnh Alzheimer biểu phân tử gia tăng so với người bình thường đóng vai trò miRNA gây ung thư (Chen nnk., 2017) Hình Kết thể trùng lấp các DEMs các mẫu dựa phân tích sơ đồ Venn 3.3 Đường cong ROC hiệu phân tích mô hình miRNA cho chẩn đoán Glioma Để đánh giá tính hiệu phân tử miRNAs chẩn đoán sớm tiên lượng cho Glioma, DEMs phân tích đường cong ROC giá trị AUC mơ hình chẩn đốn (Hình 2) Kết phân tích ROC ba mẫu từ bệnh nhân Nhật Bản tương đồng giá trị AUC miR-6780a-5p cao đạt 88% (Bảng 3) Ngược lại, mơ hình xây dựng dựa phân tử miR-6754-3p lại thể tính hiệu cao hai mẫu (GSE112264, GSE113740) với giá trị AUC 93.5% 92.7% Trong hiệu chẩn đoán phân tử đạt mức trung bình mẫu GSE124158 AUC đạt 67,4%, song nhìn chung phân tử dấu ấn tiềm có thể ứng dụng nghiên cứu thực nghiệm với AUC trung bình đạt 84% (Bảng 3) 213 Bảng Kết phân tích giá trị AUC các DEMs tiềm MicroRNA AUC GSE112264 GSE113740 GSE124158 Mean ± SD miR-6780a-5p 0,896 0,866 0,878 0,88 ± 0,01 miR-6754-3p 0,935 0,927 0,674 0,84 ± 0,12 GSE112264 60 hsa-miR-6754-3p 100 hsa-miR-6885-3p 80 hsa-miR-6750-3p 40 hsa-miR-6780a-5p hsa-miR-518a-3p 20 Sensitivity% 80 Sensitivity% GSE113740 hsa-miR-1976 GSE124158 hsa-miR-1976 hsa-miR-6754-3p hsa-miR-6885-3p 60 hsa-miR-6750-3p 40 hsa-miR-6780a-5p hsa-miR-518a-3p 20 hsa-miR-6754-3p hsa-miR-6885-3p 60 hsa-miR-6750-3p 40 hsa-miR-6780a-5p hsa-miR-518a-3p 0 100% - Specificity% hsa-miR-1976 80 20 0 20 40 60 80 100 100 Sensitivity% 100 20 40 60 80 100 100% - Specificity% 20 40 60 80 100 100% - Specificity% Hình Kết phân tích biểu đồ đường cong ROC các DEMs riêng lẻ Mặc dù giá trị AUC hai phân tử miRNAs riêng lẻ phân tích đường cong ROC dao động ngưỡng từ 84% - 88%, kết hợp theo nhóm có khác biệt có ý nghĩa nhóm miR-6780a-5p miR-6754-3p với giá trị AUC tăng cao mơ hình riêng lẻ, dao động khoảng 89,6% - 96,9% Nhóm phân tử miR-6780a-5p miR-6754-3p tổ hợp xây dựng thành công mẫu, tổ hợp miRNA cho thấy hiệu mẫu với độ nhạy trung bình 87,71% độ đặc hiệu trung bình 74,71% (Bảng 4) Hơn nữa, mơ hình xây dựng dựa cặp miRNA cho hiệu cao phương pháp chẩn đốn thơng thường CT-MRI với AUC đạt xấp xỉ 77% (Lu nnk., 2021) Điều độ nhạy độ chuyên biệt đạt từ cặp miRNA hữu ích cho việc phát triển công cụ hỗ trợ cho việc chẩn đoán tiên lượng u thần kinh đệm (Glioma) Bảng Kết phân tích giá trị AUC tổ hợp miR-6780a-5p miR-6754-3p các mẫu Bộ mẫu GSE112264 GSE113740 GSE124158 AUC 0,969 0,924 0,896 95% CI 0,94-1,00 0,87-0,97 0,84-0,95 Độ nhạy (%) 88,37 85,45 89,32 Độ đặc hiệu (%) 93,75 60,00 70,37 KẾT LUẬN Dựa phân tích liệu microarray công cụ tin sinh học, biểu khác biệt mặt biểu phân tử miRNAs lưu thông huyết người mắc u thần kinh đệm người khỏe mạnh xác định Phân tích ROC nhóm miR-6780a-5p miR-6754-3p thể độ nhạy độ chuyên biệt cao so với số phương pháp không xâm lấn thường quy khác Mặc dù kết không hỗ trợ việc sử dụng lâm sàng lập tức, nhóm miRNA mà xác định hứa hẹn thị phân tử tiềm cho việc xây dựng liệu pháp chẩn đoán tiên lượng u thần kinh đệm 214 (Glioma) Các phân tử miRNAs cần phải đánh giá thực nghiệm mẫu không xâm lấn huyến thanh, huyết tương với cỡ mẫu lớn nhằm xác định khác biệt có ý nghĩa ngưỡng giá trị biểu nhóm mang khối u nhóm khoẻ thực tế TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 Alifieris, C., & Trafalis, D T (2015) Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment Pharmacology & Therapeutics, 152, 63–82 Asano, N., Matsuzaki, J., Ichikawa, M., Kawauchi, J., Takizawa, S., Aoki, Y., Sakamoto, H., Yoshida, A., Kobayashi, E., & Tanzawa, Y (2019) A serum microRNA classifier for the diagnosis of sarcomas of various histological subtypes Nature Communications, 10(1), 1–10 Calin, G A., & Croce, C M (2006) MicroRNA-cancer connection: the beginning of a new tale Cancer Research, 66(15), 7390–7394 Chen, F., Liu, X., Cheng, Q., Zhu, S., Bai, J., & Zheng, J (2017) RUNX3 regulates renal cell carcinoma metastasis via targeting miR-6780a-5p/E-cadherin/EMT signaling axis Oncotarget, 8(60), 101042 Dat, V H X., Nhung, B T H., Chau, N N B., Cuong, P H., Hieu, V D., Linh, N T M., & Quoc, N B (2022) Identification of potential microRNA groups for the diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC) using microarray datasets and bioinformatics tools Heliyon, 8(2), e08987 Iorio, M V, & Croce, C M (2009) MicroRNAs in cancer: small molecules with a huge impact Journal of Clinical Oncology, 27(34), 5848 Louis, D N., Perry, A., Reifenberger, G., Von Deimling, A., Figarella-Branger, D., Cavenee, W K., Ohgaki, H., Wiestler, O D., Kleihues, P., & Ellison, D W (2016) The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: a summary Acta Neuropathologica, 131(6), 803–820 Lu, L., Dai, W.-Z., Zhu, X.-C., & Ma, T (2021) Analysis of Serum miRNAs in Alzheimer’s disease American Journal of Alzheimer’s Disease & Other Dementias®, 36, 15333175211021712 Mondal, I., & Kulshreshtha, R (2021) Potential of microRNA based diagnostics and therapeutics in glioma: a patent review Expert Opinion on Therapeutic Patents, 31(1), 91–106 Murakami, Y., Tanahashi, T., Okada, R., Toyoda, H., Kumada, T., Enomoto, M., Tamori, A., Kawada, N., Taguchi, Y H., & Azuma, T (2014) Comparison of hepatocellular carcinoma miRNA expression profiling as evaluated by next generation sequencing and microarray PloS One, 9(9), e106314 Ohgaki, H., & Kleihues, P (2013) The definition of primary and secondary glioblastoma Clinical Cancer Research, 19(4), 764–772 Tamimi, A F., & Juweid, M (2017) Epidemiology and outcome of glioblastoma Exon Publications, 143–153 Urabe, F., Matsuzaki, J., Yamamoto, Y., Kimura, T., Hara, T., Ichikawa, M., Takizawa, S., Aoki, Y., Niida, S., & Sakamoto, H (2019) Large-scale circulating microRNA profiling for the liquid biopsy of prostate cancer Clinical Cancer Research, 25(10), 3016–3025 Visone, R., & Croce, C M (2009) MiRNAs and cancer The American Journal of Pathology, 174(4), 1131–1138 Yamamoto, Y., Kondo, S., Matsuzaki, J., Esaki, M., Okusaka, T., Shimada, K., Murakami, Y., Enomoto, M., Tamori, A., & Kato, K (2020) Highly sensitive circulating microRNA panel for accurate detection of hepatocellular carcinoma in patients with liver disease Hepatology Communications, 4(2), 284–297 215 ... LUẬN 3.1 Kết thu thập li? ?u microarrays phân tử miRNA liên quan đến u thần kinh đệm Glioma Thông qua công cụ chọn lọc, m? ?u ghi nhận để nghiên c? ?u m? ?u có chứa thông tin bi? ?u phân tử miRNAs tiềm. .. chung u nguyên bào thần kinh đệm (GB) tìm d? ?u hi? ?u miRNA tiềm quan trọng có thể sử dụng để chẩn đốn khơng xâm lấn (Dat nnk., 2022; Murakami nnk., 2014) Trong nghiên c? ?u phân tử miRNAs liên quan. .. M? ?u khỏe: 275 M? ?u bệnh: 30 (Asano nnk., 2019) 3.2 Bi? ?u miRNA khác biệt (DEMs) m? ?u Dựa phân tích mức độ bi? ?u phân tử miRNA liên quan đến u thần kinh đệm (Glioma) với li? ?u microarray sử dụng nghiên