Bài viết Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu khuynh diệp to (Eucalyptus grandis Hill ex Maiden) tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu khuynh diệp to mọc tại Phú Yên nhằm góp phần giúp hiểu rõ hơn việc sử dụng loài cây này trong chữa bệnh dân gian cũng như định hướng cho các hướng ứng dụng tiếp theo của tinh dầu loài cây này. Mời các bạn cùng tham khảo!
THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU KHUYNH DIỆP TO (EUCALYPTUS GRANDIS HILL EX MAIDEN) Dương Thị Ánh Tuyết 1 Email: tuyetdta@tdmu.edu.vn TÓM TẮT Khuynh diệp to thuốc sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng phế quản, hen suyễn ho Do vậy, việc khảo sát tinh dầu lồi giúp hiểu rõ việc sử dụng loài chữa bệnh Tinh dầu khuynh diệp to thu nhận phương pháp chưng cất nước Thành phần hóa học tinh dầu xác định phương pháp GC-MS Kết xác định 30 chất với tổng % GC-MS 94.35% Các chất chiếm phần trăm cao tinh dầu khuynh diệp trắng Eucalyptol/1,8-Cineole (52,25%), oCymene (14,43%), Limonene (4,8%), α-Pinen (4,5%) α-Terpinenol (3,92%) Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa cho thấy tinh dầu thu có giá trị SC50 1,49 ± 0,17 mg/ml Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tinh dầu khuynh diệp trắng cho hoạt tính kháng Staphylococcus aureus với kích thước đường kính vịng vơ khuẩn 32 mm, khơng có hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli Từ khóa: tinh dầu khuynh diệp to, thành phần hóa học, khả chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn ĐẶT VẤN ĐỀ Khuynh diệp to, tên khoa học Eucalyptus grandis Hill ex Maiden thuộc họ Sim (Myrtaceae), có nguồn gốc Úc Các chương trình trồng đại trà thực Cộng hòa miền Nam Châu Phi, Zambia Zimbabwe Khuynh diệp sử dụng để chữa nhiều bệnh nhiễm trùng, cảm lạnh, cúm, viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi, đau nhức, cứng khớp, đau dây thần kinh, dùng kháng sinh, chất chống nấm cho số bệnh nhiễm trùng da (Soyingbe nnk., 2013) Ngoài khả kháng khuẩn (Elaissi nnk., 2011) kháng nấm (Su nnk., 2006), tinh dầu khuynh diệp to cho thấy khả diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypti (Lucia nnk., 2007) Trên giới, nhiều báo nghiên cứu tinh dầu khuynh diệp to Việt Nam chưa có báo cáo tinh dầu khuynh diệp to mọc Phú Yên Do vậy, báo tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu khuynh diệp to mọc Phú Yên nhằm góp phần giúp hiểu rõ việc sử dụng loài chữa bệnh dân gian định hướng cho hướng ứng dụng tinh dầu loài PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ly trích tinh dầu Lá khuynh diệp to thu hái xã Sơn Xuân, huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên vào 154 sáng ngày 15 tháng năm 2019 Tên khoa học định danh TS Phạm Văn Thế, Phòng quản lý phát triển Khoa học & Công nghệ, ĐH Tôn Đức Thắng Lá khuynh diệp to loại bỏ sâu, héo úa, rửa cắt nhỏ Cân 1,7 kg khuynh diệp to cắt nhỏ vào bình cầu tích 6000 ml với 3,6 lít nước Ráp hệ thống chưng cất Tiến hành chưng cất Tắt bếp, để nguội, trích lấy tinh dầu Làm khan muối Na2SO4 khan, ta thu tinh dầu tinh khiết Tinh dầu bảo quản ngăn mát tủ lạnh cho thí nghiệm Hiệu suất trình chưng cất tính sau: m H = mTD X 100 NL Trong đó: H: hiệu suất trình chưng cất (%) mTD: khối lượng tinh dầu (gam) mN : khối lượng nguyên liệu tươi (gam) 2.2 Xác định thành phần hóa học Các cấu phần có tinh dầu định danh GC Agilent 7890A, đầu dò phổ khối lượng (MSD) 5975C VL Triple-Axis với cột mao quản không phân cực Phenomenex 7HG-G01011 Zebron ZB-5MS (30,0 m x 0,25 mm x 0,25 μm), phịng thí nghiệm hóa hữu cơ, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh Khí mang helium với chế độ đẳng áp 12000 psi Nhiệt độ đầu nạp đầu dò thiết lập 300oC Thể tích mẫu tiêm vào 0,1 μl với chế độ đẳng dịng Chương trình nhiệt thiết lập với nhiệt độ đầu 60oC, tăng 3oC/phút đến 240oC Việc định danh cấu tử tinh dầu thực cách so sánh giá trị số lưu tuyến tính (linear retention index, LRI) hay cịn gọi số số học (arithmetic index, AI) phổ khối lượng chúng với hợp chất tham khảo công bố Adams hệ thống liệu MS hợp chất từ thư viện phổ NIST 2014 Các giá trị số lưu tuyến tính cấu phần tinh dầu xác định qua dãy đồng đẳng alkane C5-C20 (Adams, 2017) 2.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Q trình thử nghiệm thực phịng thí nghiệm sinh học, chương trình Cơng nghệ sinh học, đại học Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu thực chủng Staphylococcus aureus nhạy methicillin (MSSA) ATCC 6538 chủng Escherichia coli ATCC 8739 cung cấp công ty Microbiologics (USA) S.aureus, E.coli nuôi môi trường lỏng Trypton Soy (Himedia, Ấn Độ), môi trường Trypton Soy agar (Himedia, Ấn Độ) Chủng vi khuẩn nuôi tủ ấm (DaiHan, Hàn Quốc), nhiệt độ 370C, vòng 18 Chuẩn bị đĩa môi trường Trypton Soy agar (Himedia, Ấn Độ) môi trường dùng để khảo sát khả kháng khuẩn Mỗi đĩa khảo sát có bổ sung 100µl dịch mơi trường nuôi vi khuẩn mật độ 106CFU/ml Sử dụng phương pháp Kirby-Bauer, giếng đĩa thạch khoan có kích thước lỗ 5.5 mm, cho 100l dịch tinh dầu nguyên chất Sau đó, đĩa ủ 370C vịng 18 Các thí nghiệm lặp lại lần Các kích thước vòng kháng khuẩn theo milimet (mm) đọc sau 18 sử dụng tiêu chuẩn vịng kháng khuẩn CLSI để giải thích (Bauer nnk., 1966) 155 2.4 Khảo sát khả kháng oxy hóa Hoạt tính kháng oxy hóa thực phương pháp bắt gốc tự (DPPH), Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp xác định khả kháng oxy hóa hợp chất dựa khả bắt gốc tự DPPH (1,1 –diphenyl-2-picrylhydrazyl) có khả tạo gốc tự bền methanol có độ hấp thu cực đại bước sóng 517 nm Khi cho mẫu thử nghiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm trung hịa bao vây gốc tự làm DPPH chuyển từ màu tím sang vàng Tín hiệu đo máy ELISA reader Hoạt tính kháng oxi hóa chất thử nghiệm đánh giá thông qua phần trăm làm giảm giá trị hấp thu ánh sáng mẫu thử nghiệm so với đối chứng Kết hoạt tính kháng oxy hóa chất phương pháp DPPH biểu diễn giá trị SC50 SC50 định nghĩa nồng độ chất thử nghiệm bắt giữ 50% gốc tự DPPH SC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế mạnh yếu mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính cao thì giá trị SC50 thấp (Huang nnk., 2015) Tỷ lệ phần trăm bắt gốc tự DPPH tính theo cơng thức sau: 𝑂𝐷𝑡 SC50 =1- 𝑂𝐷 𝑋 100(%) 𝐶 Trong đó: ODt: mật độ quang mẫu thí nghiệm sau trừ blank (khơng có DPPH) ODC: mật độ quang mẫu control sau trừ blank (khơng có DPPH) 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu trung bình, độ lệch chuẩn sai số phần mềm Excel 2016 (Microsoft Inc, Redmond, California, USA) Tất thí nghiệm thực với ba lần lặp lại thiết kế hoàn tồn ngẫu nhiên Số liệu trình bày dạng: Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết ly trích tinh dầu Hình Hình ảnh khuynh diệp to tinh dầu khuynh diệp to 156 Qua định danh, khuynh diệp to có tên khoa học Eucaylptus grandis Hill ex Maiden Kết sau ly trích cho 17,7595g tinh dầu (hiệu suất 1,0446%) Tinh dầu có màu vàng, suốt với mùi thơm đặc trưng khuynh diệp 3.2 Thành phần hóa học Thành phần hóa học phần trăm tỉ lệ cấu tử tinh dầu xác định phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trình bày bảng Bảng Thành phần hóa học tinh dầu khuynh diệp to STT RT RI (Mẫu) 5,303 5,693 5,738 6,517 6,803 7,369 7,724 7,999 8,17 938 953 955 985 996 1012 1022 1030 1035 932 945 946 974 988 1002 1014 1022 1024 10 8,33 1039 1026 1062 1091 1096 1124 1145 1176 1185 1201 1224 1248 1288 1297 1431 1439 1459 1486 1586 1597 1605 1608 1054 1086 1089 1114 1135 1165 1174 1186 1226 1239 1289 1298 1431 1439 1458 1496 1590 1595 1602 1600 11 9,183 12 10,219 13 10,396 14 11,575 15 12,462 16 13,795 17 14,184 18 14,831 19 15,872 20 16,953 21 18,733 22 19,151 23 25,227 24 25,582 25 26,509 26 27,768 27 31,871 28 32,334 29 32,637 30 32,769 Tổng % GC-MS Hợp chất RI (Adam) α-Pinen α-Fenchene Camphene β-Pinene Myrcene α-Phellandrene α-Terpinene o-Cymene Limonene Eucalyptol/1,8Cineole γ-Terpinen Terpinolene p-Cymenene endo-Fenchol trans-Pinocarveol Borneol Terpinen-4-ol α-Terpinenol cis-Carveol Carvone Thymol Carvacrol β-Gurjenene Aromandendrene allo-Aromadendrene Viridflorene Globulol Cubeban-11-ol Ledol Rosifoliol %GCMS 4,5 0,05 0,13 2,01 0,2 0,03 0,06 14,43 4,8 MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam 52,25 MS+Adam 2,94 0,24 0,19 0,22 0,31 0,29 1,93 3,92 0,11 0,05 0,42 0,25 0,09 1,09 0,29 0,06 2,97 0,21 0,12 0,19 94,35 MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam MS+Adam Ghi Kết phân tích GC-MS tinh dầu khuynh diệp trắng (Bảng 1) cho thấy số chất xác định tên 30 chất với tổng % GC-MS 94,35% Những chất chiếm phần trăm cao tinh dầu khuynh diệp to Eucalyptol/1,8-Cineole (52,25%), o-Cymene (14,43%), Limonene (4,8%), α-Pinen (4,5%) α-Terpinenol (3,92%) 157 So với cơng trình nghiên cứu tinh dầu trước đây, cấu tử chính tinh dầu khuynh diệp to Eucalyptol/1,8-Cineole chiếm tỉ lệ phần trăm tinh dầu cao hẳn so với cơng trình trước (Bảng 2) Bảng So sánh cấu tử tinh dầu khuynh diệp to STT Số hợp chất xác định 10 39 31 33 28 12 67 30 Thành phần tinh dầu α-Pinene 1,8-Cineole p-Cymene α -Terpineol γ -Terpinene α-Pinene γ-Terpinene o-Cymene α-Terpineol p-Cimen-8-ol α-Pinene 1,8-cineole α-Terpineol Borneol D-Limonene p-Cymene α-Terpineol α-Pinene Isoleptospermone 1,8-Cineole α-Pinene p-Cymene Isoleptospermone 1,8-Cineole γ-Terpinene 1.8-Cineole Spathulenol p-Cymene Bicyclogermacrene α -Phellandrene 1,8-Cineole α-Terpinyl acetate α-Pinene β-Caryophyllene α-Terpineol Eucalyptol/1,8Cineole o-Cymene Limonene α-Pinen α-Terpinenol Hàm lượng (%) 52,71 18,38 9,70 5,67 5,00 40,55 16,25 13,13 2,90 2,9 29,67 12,80 6,48 3,43 3,14 20,5 14,3 12,2 9,4 7,8 24,7 14,5 13,2 5,5 5,1 16,0±5,0 15,3±5,8 11,7±3,2 6,7±3,1 6,3±4,2 19,8 12,8 11,4 6,9 5,0 Bộ phận Nơi thu hái TLTK Lá tươi Argentina (Lucia nnk., 2017) Lá tươi Brazil (BatistaPereira nnk., 2006) Lá tươi Nam Phi (Soyingbe nnk., 2013) Lá (Mùa đông) Brazil (Oliveira nnk., 2008) Lá (Mùa hè) Lá Tunisia (Salah nnk., 2011) Lá Đài Loan (Chang nnk., 2006) Lá Phú Yên, Việt Nam Công 52,25 14,43 4,8 4,5 3,92 158 trình 3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật Bảng Kích thước vịng kháng khuẩn tinh dầu khảo sát Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) S.aureus E.coli 32 - Tinh dầu khảo sát Khuynh diệp to Ghi chú: (-) Khơng có hoạt tính Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật (Bảng 3) tinh dầu khuynh diệp to cho hoạt tính kháng S.aureus mạnh với vịng kháng khuẩn có kích thước 32 mm, khơng cho hoạt tính kháng khuẩn E.coli Điều cho thấy tinh dầu cho hoạt tính kháng khuẩn theo chủng vi khuẩn cách chọn lọc Kết có khác biệt so với cơng trình nhóm Soyingbe Nam Phi, tinh dầu khuynh diệp to cho kết kháng khuẩn hai chủng vi khuẩn S aureus E coli (Soyingbe nnk., 2013) Điều khuynh diệp to mọc vùng đất có thổ nhưỡng khí hậu khác nhau, có thành phần hóa học khác nên hoạt tính kháng khuẩn khác 3.4 Hoạt tính kháng oxy hóa Phần trăm bắt gốc DPPH mẫu xác định phương pháp DPPH Kết trình bày bảng Bảng Tỷ lệ (%) bắt gốc tự DPPH nồng độ khảo sát tinh dầu khuynh diệp to Mẫu Nồng (mg/ml) độ Phần trăm bắt gốc DPPH (%) Lần Lần TB ± ĐLC Bị đục 9,73 Khuynh diệp to Lần 4,87 73,88 73,97 72,80 73,55 ± 0,65 2,43 56,14 62,73 63,41 60,76 ± 4,02 1,22 45,22 47,94 47,65 46,94 ± 1,49 0,61 30,60 28,09 30,96 29,88 ± 1,56 Khi tăng nồng độ tinh dầu phần trăm bắt gốc DPPH tăng dần theo (giá trị TB ± ĐLC tăng theo nồng độ) Điều chứng tỏ khả kháng oxy hóa tinh dầu tăng tỉ lệ thuận với chiều tăng nồng độ Với phương trình hồi quy trên, giá trị SC50 hoạt tính bắt gốc tự DPPH tinh dầu xác định 1,49± 0,17 mg/ml, tương tự với kết nhóm nghiên cứu trước 1,36 mg/ml (Soyingbe nnk., 2013) Khả kháng oxy hóa cao cho thấy tiềm ứng dụng tinh dầu khuynh diệp to bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm KẾT LUẬN Kết khảo sát tinh dầu tinh dầu khuynh diệp to cho thấy số chất xác định tên 30 chất với tổng % GC-MS 94,35% Những chất chiếm phần trăm cao tinh dầu khuynh diệp to Eucalyptol/1,8-Cineole (52,25%), o-Cymene (14,43%), Limonene (4,8%), α-Pinen (4,5%) α-Terpinenol (3,92%) Tinh dầu khuynh diệp to cho hoạt tính kháng khuẩn theo chủng vi khuẩn cách chọn lọc, cho hoạt tính kháng S aureus mạnh khơng cho hoạt tính kháng E coli Khả kháng oxy hóa tinh dầu tăng tỉ lệ thuận với chiều tăng nồng độ có giá trị SC50 1,49± 0,17 mg/ml 159 TÀI LIỆU THAM KHẢO Adams, R.P (2017) Identification of essential oil components by gas chromatography mass spectrometry Allured Publishing corporation Bauer, A.W., Kirby, W.M.M., Sherris, J.C., & Turck, M (1966) Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method American journal of clinical pathology, 45(4), 493-496 Batista-Pereira, L G., Fernandes, J B., Silva, M.F.G F da, Vieira, P C., Bueno, O C., & Corre, A G (2006), Electrophysiological Responses of Atta sexdens rubropilosa Workers to Essential Oils of Eucalyptus and its Chemical Composition Zeitschrift für Naturforschung C, 61 (9-10), 749–755 Elaissi, A., Salah, K H., Mabrouk, S., Larbi, K M., Chemli, R., & Harzallah-Skhiri, F (2011) Antibacterial activity and chemical composition of 20 Eucalyptus species’ essential oils Food Chemistry, 129, 1427–1434 Huang, H.C., Ho, Y.C., Lim, J.M., Chang, T.Y., Ho, C.L., & Chang T.M (2015), Investigation of the Anti-Melanogenic and Antioxidant Characteristics of Eucalyptus camaldulensis Flower Essential Oil and Determination of Its Chemical Composition Int J Mol Sci., 16, 10470-10490 Lucia, A., Audino, P G., Seccacini, E., Licastro, S., Zerba, E., & Masuh, H (2007) Larvicidal Effect Of Eucalyptus Grandis Essential Oil And Turpentine And Their Major Components On Aedes Aegypti Larvae Journal of the American Mosquito Control Association, 23(3), 299-303 Oliveira, F N M., Ferri, P H., Paula, J R., Seraphin, J C., & Filho, E P (2008) Seasonal Influence on the Essential Oil Compositions of Eucalyptus urophylla S T Blake and E grandis W Hill ex Maiden from Brazilian Cerrado Journal of Essential Oil Research, 20(6), 555-560 Soyingbe, O S., Oyedeji, A., Basson, A K., & Opoku, A R (2013) The Essential Oil of Eucalyptus grandis W Hill ex Maiden Inhibits Microbial Growth by Inducing Membrane Damage Chinese Medicine, 4, 7-14 Su, Y.C., Ho, C.L., Wang, I.C., Chang, S.T (2006) Antifungal activities and chemical compositions of essential oils from leaves of four eucalypts Taiwan J For Sci, 21(1), 49-61 160 ... chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết ly trích tinh dầu Hình Hình ảnh khuynh diệp to tinh dầu khuynh diệp to 156 Qua định danh, khuynh diệp to có tên khoa học Eucaylptus grandis Hill ex Maiden Kết... trích cho 17,7595g tinh dầu (hiệu suất 1,0446%) Tinh dầu có màu vàng, suốt với mùi thơm đặc trưng khuynh diệp 3.2 Thành phần hóa học Thành phần hóa học phần trăm tỉ lệ cấu tử tinh dầu xác định phương... cứu tinh dầu trước đây, cấu tử chính tinh dầu khuynh diệp to Eucalyptol/1,8-Cineole chiếm tỉ lệ phần trăm tinh dầu cao hẳn so với công trình trước (Bảng 2) Bảng So sánh cấu tử tinh dầu khuynh diệp