SSR TRONG CHỌN GIỐNG cây TRỒNG

SSR TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH BẢNG ii DANH SÁCH HÌNH iii CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1 1 1 Đặt vấn đề 1 1 2 Mục tiêu 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 2 1 Chỉ thị di truyền 2 2 2.Các chỉ thị di truyền (genetic markers) là các chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các loài khác nhau. Các chỉ thị này không thể hiện cho các gen mục tiêu mà chỉ là dấu hiệu hoặc như là “cờ đánh dấu”. Chỉ thị di truyền bao gồm cả chỉ thị hình thái (morphological markers) và chỉ thị phân tử (molecular markers như isozyme, protein, DNA). Tất cả chỉ thị di truyền đều chiếm một vị trí đặc biệt trong nhiễm sắc thể (NST) và được gọi là locus

SSR TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phổ điện di primer 155SSR Hình 3.2: Phổ điện di primer 69Mic Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu giống đậu tương với thị SSR Satt202 gel agarose 3% Hình 3.4: Sơ đồ đa dạng di truyền 109 mẫu giống đậu tương phân nhóm dựa 11 thị SSR Hình 3.5: Phổ điện di với mồi RM211 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Hình 3.6: Phổ điện di với mồi RM6329 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Hình 3.7: Phổ điện di với mồi RM24330 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Hình 3.8: Phổ điện di với mồi RM474 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 10 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Hình 3.9: Phổ điện di với mồi RM286 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 11 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Hình 3.10: Sơ đồ di truyền nhánh dựa dấu phân tử SSR 40 giống lúa cải tiến phân tích hệ số tương đồng Nei-Li phương pháp UPGMA CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong vài thập kỷ qua, việc sử dụng thị phân tử đóng vai trò ngày quan trọng việc chọn giống di truyền Trong số loại thị phân tử khác nay, microsatellite sử dụng rộng rãi nhất, chúng dễ dàng khuếch đại PCR số lượng lớn biến thể allele locus Trình tự lặp đơn giản (SSR) cịn gọi microsatellite, lớp trình tự DNA lặp lại có độ dài lặp lại từ – bp nằm vùng gen sinh vật (Romana-Eguia et al., 2004; Alam and Islam, 2005; Chistiakov et al., 2006; Duran et al., 2009) Chúng có mặt phong phú, đồng trội, đa dạng chất với tính đa hình cao thường bao gồm đơn vị lặp lại song song dạng mono-, di-, tri- tetra-nucleotide gen Do đó, thị SSR trở thành thị tiếng cho mục đích khác xác định lồi giống, mơ tả q trình tiến hóa, đánh dấu cho đặc điểm sản xuất hoạt động nghiên cứu di truyền quần thể xây dựng đồ liên kết (Brinez et al., 2011; Ye et al., 2014; Basiita et al., 2015) Các thị đồng trội sử dụng tốt sinh vật khác để nghiên cứu di truyền lập đồ gen Sự đa hình/biến thể SSR xảy trượt DNA polymerase và/hoặc kiện tái tổ hợp không tương đồng nhiễm sắc thể Do mức độ đa hình khả tái tạo cao, thị SSR phát triển cho số loài thực vật, động vật, thơng qua việc giải trình tự DNA với việc xây dựng thư viện làm giàu cDNA 1.2 Mục tiêu Báo cáo “SSR chọn giống trồng” thực nhằm mục tiêu: + Tìm hiểu kỹ thuật SSR + Phân tích số báo sử dụng kỹ thuật SSR số loài thực vật như: hoa hồng, đậu tương lúa Từ biết quy trình cách thức ứng dụng kỹ thuật chọn giống trồng CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Chỉ thị di truyền Các thị di truyền (genetic markers) thị thể khác biệt thể loài khác Các thị cho gen mục tiêu mà dấu hiệu “cờ đánh dấu” Chỉ thị di truyền bao gồm thị hình thái (morphological markers) thị phân tử (molecular markers isozyme, protein, DNA) Tất thị di truyền chiếm vị trí đặc biệt nhiễm sắc thể (NST) gọi locus Các thị di truyền thường liên kết với gen di truyền theo quy luật di truyền Chỉ thị phân tử thường hiểu thị DNA, thị nằm gần hay liên kết với gen khơng có ảnh hưởng đến kiểu hình Chỉ thị di truyền chia thành hai loại: thị truyền thống thị DNA Chỉ thị truyền thống gồm thị hình thái (đây tính trạng đặc điểm hình thái mầu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trưởng, biến đổi sắc tố v.v.), thị tế bào (đặc trưng cấu trúc nhiễm sắc thể) thị sinh hóa (các isozyme, protein chất trao đổi chất) Chỉ thị DNA thay đổi phân tử DNA chia thành nhiều loại dựa khác phương pháp kỹ thuật xác định đa hình Hình 2.1: Sơ đồ phân loại marker (chỉ thị) Các thị DNA sử dụng rộng rãi số lượng thị khơng hạn chế Chỉ thị DNA hình thành từ loại đột biến DNA khác thay (đột biến điểm), xếp lại (thêm vào bớt nucleotide) sai sót chép đoạn DNA lặp lại liền kề Các thị DNA thường nằm vùng không phiên mã Khác với thị hình thái sinh hóa, thị DNA không giới hạn số lượng, không ảnh hưởng yếu tố môi trường giai đoạn phát triển Chỉ thị DNA sử dụng nhiều nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại phân loại phân tử; lập đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc tính trạng kháng bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi môi trường, suất phẩm chất giống 2.2 Các kỹ thuật thị DNA Mỗi loại thị DNA phát triển kỹ thuật tương ứng Kỹ thuật thị DNA lý tưởng cần phải có tiêu chí sau: cho đa hình cao phân bố genome; cho phân biệt rõ khác di truyền, tạo nhiều thị độc lập xác; đơn giản,nhanh tốn kém; cần mẫu DNA; liên kết với kiểu hình định; lặp lại nghiên cứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ xác, có nhiều allele (hàm lượng thông tin cao), không cần biết trước thông tin genome thể Các kỹ thuật thị DNA chia thành nhóm là: kỹ thuật không sử dụng phản ứng PCR kỹ thuật sử dụng PCR Ngoài ra, cần phải kể đến số công nghệ hỗ trợ hiệu cho phát triển thị nhận biết đa hình thị DNA cơng nghệ xếp đa dạng (Diversity array Technology) công nghệ giải trình tự hệ thứ hai (Next-generation sequencing) Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats - SSR) kỹ thuật thị DNA dựa phản ứng PCR sử dụng phổ biến Bảng 2.1: So sánh đặc điểm quan trọng thị phân tử sử dụng phổ biến Đặc điểm RFLP RAPD AFLP ISSR SSR SNP Đồng trội Cao Đồng trội Cao Trội Retrotransp osons Trội Cao Cao Cao Cao Cao Cao Cao Cao Đồng Đồng trội/trội trội Khả Cao tái lập Trội Trội Trội Cao Trung bình Mức độ đa Trung hình bình Yêu cầu Cao chất lượng DNA Rất cao Cao Trung bình Cao Cao Cao Cao Cao Thấp Thấp DArT Thấp Thấp Thấp Thấp Thấp Retrotransp osons Thấp Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Cao Cao Cao Rất cao Trung bình Rất cao Rất cao Rất cao Cao Rẻ Cao Cao Cao Rẻ Rẻ Giải trình Có tự Trạng thái Q khứ u cầu Khơn PCR g Visualizati Radio on active Khơng Khơng Khơng Có Thay đổi Có Có Khơng Q khứ Có Q khứ Có Hiện Hiện Có Có Hiện Có Hiện Hiện Agaros e gel Agaros e gel Agaros e gel Agaro se gel Microar Agaros ray e gel Yêu DNA 20 500– 1000 50 50 SNPVIST A 50 Đặc điểm Yêu cầu số lượng DNA Marker index Sự phong phú gen Giá RFLP RAPD Cao Thấp Trung bình Cao Cao Cao cầu 10000 AFLP ISSR SSR SNP DArT Khơng 50–100 Có 25–50 (Muhammad Azhar Nadeem et al., 2018) 2.3 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản SSR Chuỗi lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats-SSR) (Tautz D., Renz M., 1984), gọi tiểu vệ tinh (microsatellite) (Litt M., Luty J A., 1989), chuỗi lặp lại trước sau ngắn (Short Tandem Repeats - STRs) hay đa hình độ dài chuỗi đơn giản (simple sequence length polymorphisms - SSLPs) (McDonald D B., Potts W K., 1997) lặp lại chuỗi nucleotide ngắn từ 2-6 nucleotide (Chambers et al., 2000) Sequence Primer ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT (AC) TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT (AC)8 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT (AC)10 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT (AC)12 TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (GT)6  GTGTGTGTGTGT hay (CTG)5  CTGCTGCTGCTGCTG hay (ACTC)4  ACTCACTCACTCACTC Microsatellites mononucleotide (A), dinucleotide (GT), trinucleotide (ATT), tetranucleotide (ATCG), pentanucleotide (TAATC) hexanucleotide (TGTGCA) (Beckmann JS, Weber JL, 1990) Microsatellites phân bố gen; nhiên, chúng có lục lạp (Provan J et al., 2001) ty thể (Rajendrakumar P et al., 2007) Các nghiên cứu xác nhận diện SSR gen mã hóa protein thẻ trình tự biểu (ESTs) (Morgante M et al., 2002) SSR đại diện cho lặp lại locus với mức độ đa hình cao (Zane L et al., 2002) Mức độ đa hình cao xuất nhiều lần lặp lại khác vùng microsatellite phát dễ dàng PCR (Kalia RK et al., 2011) Sự xuất SSR trượt DNA sợi đơn, tái tổ hợp DNA sợi đôi, chuyển giao phần tử di động (retrotransposons) không phù hợp (mismatches) Các motif phổ biến SSR Mono-: A, T; Di-: AT, GA; Tri-: AGG; Tetra-: AAAC Chủ yếu trình tự nằm bên cạnh SSR bảo tồn sử dụng trình phát triển mồi (primer) Việc phát triển thư viện gen (genomic library) giải trình tự đoạn gen nghiên cứu dẫn đến phát triển đoạn mồi Để biết thêm thông tin liên quan đến phát triển SSR, xem đánh giá Kalia et al (2011) Sự phát triển dấu SSR liên quan đến việc phát triển thư viện SSR sau phát microsatellite chuyên biệt Sau đó, việc phát vùng thuận lợi để thiết kế mồi thực sau thực PCR Giải thích đánh giá mơ hình band thực đánh giá sản phẩm PCR thực để khảo sát tính đa hình (Wang et al., 2009) Các dấu SSR coi dấu lựa chọn, chúng đồng trội, với khả tái tạo cao phong phú gen, chúng sử dụng hiệu nghiên cứu lập đồ thực vật (Tautz D., 1989; Kalia RK et al., 2011) SSR (Single Sequence Length Polymorphism-SSLP, Sequence-Tagged Microsatellite Site-STMS) trở thành kỹ thuật thị phân tử quan trọng động vật thực vật SSR đa hình đột biến tác động lên số đơn vị lặp lại Sự thay đổi hay đa hình SSR kết khác độ dài đoạn lặp lại genome q trình trao đổi chéo khơng cân giảm nucleotide trình chép SSR khơng phổ biến mà cịn biến động mạnh số lượng kiểu lặp lại genome sinh vật nhân thực Sự khác allele SSR kết thay đổi số lượng đơn vị lặp lại cấu trúc tiểu vệ tinh Các chuỗi lặp lại thường đơn giản cấu tạo 2, nucleotide Kỹ thuật SSR thực phản ứng PCR với mồi SSR xuôi ngược Sản phẩm PCR phân tách gel polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc (AgNO3) máy giải trình tự tự động Việc phát triển thị SSR tiến hành theo số bước như: xây dựng thư viện SSR, xác định locus SSR, xác định vùng phù hợp để thiết kế mồi, PCR với mồi thiết kế, đánh giá phân tích mẫu band, đánh giá đa hình sản phẩm PCR Kỹ thuật SSR có số ưu việt thị khác như: i Cho nhiều allen locus; ii Phân bố genome; iii SSR cho thông tin cụ thể so với di truyền ty thể theo đường mẹ (vì có mức đột biến cao) di truyền theo bố mẹ; iv Là thị đồng trội; v Có tính đa hình đặc thù cao; vi Có thể lặp lại thí nghiệm, sử dụng DNA, rẻ dễ tiến hành, phân tích bán tự động, khơng sử dụng phóng xạ, sử dụng DNA cổ (ancient DNA-aDNA) SSR phân biệt cá thể có mối quan hệ gần Điểm hạn chế quan trọng kỹ thuật thị SSR cần phải đọc trình tự genome để dựa vào thiết kế cặp mồi đặc thù tối ưu hóa điều kiện mồi cho loài trước sử dụng Hiện nay, SSR thị chọn cho nghiên cứu hồ sơ pháp lý, di truyền quần thể nghiên cứu động vật hoang dã Ở thực vật, thị SSR sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn cặp lai, xác định lai lập đồ liên kết phân tử (Dintinger J A., Salgon Sand Reynaud B., 2014; Ma J Q et al., 2014; Nguyen Duc Thanh et al., 2006) + + + + 2.4 Đặc điểm SSR Microsatellite marker lựa chọn việc lập đồ phân tử, xác định giống trồng, đánh giá nguồn gốc tổ tiên trồng cho mục đích nghiên cứu quần thể trồng tiến hóa vì: Có tính đa allele biến dị cao Là marker đồng trội Phân bố ngẫu nhiên khắp gen sinh vật Dễ dàng xác định PCR sử dụng primer đặc biệt Một cá thể có locus đồng hợp có số lần lặp lại hai nhiễm sắc thể, cá thể dị hợp có số lần lặp lại khác hai nhiễm sắc thể Những vùng xung quanh locus microsatellite, gọi vùng hai bên (flanking region) có trình tự Điều quan trọng vùng hai bên dùng primer phản ứng PCR khuếch đại microsatellite, vùng hai bên bảo tồn giống hay họ SSRs khuếch xác định qua trình phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction - PCR), cách sử dụng chuỗi DNA liên tục bị làm biến tính nhiệt độ cao để tách sợi đơi, sau làm lạnh phép ủ mồi phần mở rộng trình tự nucleotide thơng qua SSRs Q trình cho kết nhìn thấy gel agarose gel polyacrylamide, lượng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại theo cách thermocycling tạo gia tăng theo cấp số nhân phân đoạn nhân rộng Nguyên lý SSR marker Kỹ thuật SSR dựa nguyên lý PCR dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn trình tự SSR Sự khác cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại nhân lên xác định chạy điện di gel agarose gel polyacrylamide Dựa vào hai đầu (vùng sườn) đoạn lặp lại có trình tự đặc biệt thống chung cho đoạn DNA gen khơng phân biệt cá thể lồi, cá thể loài số lần lặp lại đơn vị lặp lại khác Từ đó, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân cặp DNA gen chứa trình tự lặp lại Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt giống khác cá thể lồi Đa hình độ dài đoạn microsatellite phát lai với DNA gel nhân PCR để tách dịng, đọc trình tự với mồi đoạn oligonucleotide phụ cận Các vị trí microsatellite thị đồng trội chứa đựng thông tin cao Microsatellite thị lập đồ xác định thị chuẩn Ở động vật microsatellite với trình tự CA/GT lặp lại phổ biến nhất, trình tự thấy nhiều thực vật thực vật trình tự lặp lại AT/TA phổ biến 10 (Vũ Thị Thúy Hằng et al., 2019) a Tách chiết ADN ADN genom tách chiết từ non mẫu giống đậu tương Mẫu thu thập từ 3-5 mẫu giống Phương pháp tách chiết thực theo mô tả Triệu Thị Thịnh Vũ Thị Thúy Hằng (2010) b Phản ứng PCR Nghiên cứu sử dụng 11 thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền chọn lọc từ nghiên cứu đa dạng di truyền đậu tương (Bảng 3.6) Các mồi lựa chọn dựa nghiên cứu công bố đánh giá đa dạng di truyền đậu tương Các mồi lựa chọn mồi QTLs liên quan đến hàm lượng protein 11 mồi tập trung NST NST số 6, 15 20 25 Bảng 6: Chỉ thị SSR sử dụng đánh giá di truyền mẫu giống đậu tương (Vũ Thị Thúy Hằng et al., 2019) Quy trình tách chiết tinh ADN thực theo mô tả Trung tâm Bệnh nhiệt đới Triệu Thị Thịnh ctv (2010) ADN pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 3:4 dùng cho phản ứng PCR, với thể tích phản ứng 15 μl, chứa 0.5 μl ADN, 0.3 μl loại mồi, 7.5 μl 2x iTaqTM DNA Polymerase (iNtRon Biotechnology –Hàn Quốc) 6.4 μl nước Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR - SSR lập trình sau: (1) 94 oC phút, (2) 94oC 30 giây, (3) 48oC 30 giây, (4) 72oC 30 giây 33 chu kỳ lặp từ (2) đến (4), (5) 72oC phút sau giữ lạnh 4oC c Điện di ghi nhận kết Sản phẩm PCR (5 μl) điện di agarose 3% 250V 25 phút dung dịch đệm x Tris-acetate-EDTA (TAE) sử dụng thang chuẩn ADN 100 bp (Biotools – Đài Loan) Sau đó, gel nhuộm EtBr 0,5 g/ml 20 phút soi đèn UV chụp ảnh Các băng gel xác định quy ước (0) khơng có băng (1) có băng d Xử lý số liệu Hệ số tương đồng di truyền Jaccard phương pháp UPGMA NTSYS pc2.2 sử dụng phân tích, đánh giá đa dạng di truyền phân nhóm Nội dung thơng tin đa hình (PIC – Polymorphic Information Content) 26 thị SSR tính theo cơng thức Anderson et al., (1993) sau: PIC(i) = 1-⅀Pij2 Trong đó: Pij tần suất alen thứ j với locus SSR thứ i Phạm vi giá trị PIC từ (khơng đa hình) tới (đa hình hồn tồn) 3.2.2 Kết thảo luận Kết phân tích SSR cho thấy tất 11 thị cho xuất băng ADN (allen) Kết thu tổng số 41 allen/11 locut, với giá trị trung bình allen/1 locut tất băng điện di băng đa hình, tỷ lệ băng đa hình 100% (Hình 3.3) Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu giống đậu tương với thị SSR Satt202 gel agarose 3% Chú thích: kích thước băng khuếch đại: 300 – 400 bp (Vũ Thị Thúy Hằng et al., 2019) Số lượng allen/locut dao động từ đến 6, với trung bình allen/locut; locut Satt520 có số allen lớn (Bảng 3.7) Như vậy, 11 mồi sử dụng cho tỷ lệ số băng đa hình cao Số lượng allen/locut số allen trung bình/locut nghiên cứu tương đương với số nghiên cứu khác Triệu Thị Thịnh ctv (2010) với 10 thị SSR cho 36 mẫu giống đậu tương (1-7 allen/locut, trung bình 3,9 allen/locut), Tantasawat et al., (2011) với 11 thị SSR 25 mẫu giống đậu tương Thái Lan (3-7 allen/locut, trung bình 4,8 allen/locut), Bisen et al., (2015) với 23 thị SSR 38 mẫu giống đậu tương Ấn Độ (1-4 allen/ locut, trung bình allen/locut), hay Moniruzzaman et al (2019) với 10 thị SSR cho mẫu đậu tương (2-5 allen/locut, trung bình 3,3 allen/locut) Các thị có số allen thấp cho đa dạng, hay PIC thấp so với thị có số allen cao Phần lớn giá trị PIC dao động từ 0,46 - 0,93 với PIC trung bình 0,69 Chỉ thị cho giá trị PIC cao Satt384 (PIC = 0,93) Giá trị PIC nghiên cứu cao so với số nghiên cứu khác Anchal et al (2015) Moniruzzaman et al (2019) Các thị nghiên cứu có thơng tin đa hình cao, PIC > 0,5 Allard et al (1984) Vaiman et al 27 (1994) cho thấy thị với giá trị PIC từ 0,5 trở lên cho thông tin đa hình cao cho nghiên cứu di truyền Số lượng mẫu đậu tương có allen xuất dùng thị SSR biến động từ 24 – 78 mẫu Nhiều mẫu đậu tương mang allen thị Satt571 (78 mẫu), có 24 – 31 mẫu mang allen thị Satt384, Satt520 Satt239 Các thị SSR NST 20 nhìn chung tương đối phổ biến cho mẫu giống đậu tương đánh giá thí nghiệm, thị SSR NST 15 phổ biến Bảng 3.7: Số băng giá trị PIC 11 thị SRR dùng đánh giá đa dạng di truyền 109 giống đậu tương (Vũ Thị Thúy Hằng et al., 2019) Ở hệ số tương đồng 0,66, 109 mẫu tốt chọn phân thành nhóm (Hình 3.4): nhóm I có 35 mẫu giống, nhóm II có 44 mẫu giống III có 16 mẫu giống, nhóm IV có mẫu giống nhóm V có mẫu giống đậu tương, Nhóm I, II, III, nhóm gồm có nhóm phụ Trong đó, nhóm II có nhiều số mẫu 28 Hình 3.4: Sơ đồ đa dạng di truyền 109 mẫu giống đậu tương phân nhóm dựa 11 thị SSR (Vũ Thị Thúy Hằng et al., 2019) Phân tích đa dạng di truyền phân nhóm mẫu đậu tương (Hình 3.4) giúp cho việc lựa chọn nguồn vật liệu chọn tạo giống đậu tương xác thông qua lựa chọn mẫu đại diện mà khơng bị trùng lặp Đặc biệt, việc phân nhóm giúp lựa chọn vật liệu bố mẹ lai tạo với mẫu giống từ nhóm khác nhằm làm tăng biến dị di truyền cho chọn lọc Ví dụ để tạo biến dị tái tổ hợp từ lai, mẫu giống nhóm II khơng nên lựa chọn làm bố mẹ có đặc điểm tương đồng khoảng ≥ 75% (Hình 3.4) Tương tự, nhiều biến dị tái tổ hợp xuất lai mẫu giống đậu tương nhóm I II với V, nhóm I II Tóm lại: Nghiên cứu sử dụng 11 thị phân tử SSR phát 41 allen 109 mẫu giống đậu tương với hệ số tương đồng 0,66 Trong đó, thị SSR Satt239, Satt270, Satt277, Satt281 Satt520 có khả phân biệt tính đa hình mẫu giống đậu tương nghiên cứu rõ rệt 3.3 Ứng dụng SSR lựa chọn giống lúa Bài báo “Đánh giá kiểu gene chịu mặn thị phân tử SSR 40 giống/dòng lúa cải tiến” (Nguyễn Văn Mạnh ctv., 2020) 29 3.3.1 Vật liệu phương pháp 3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Nguồn gốc 40 giống lúa cải tiến MTL chọn tạo Viện nghiên cứu Phát triễn Đồng sông Cửu Long (MDI) tồn trữ ngân hàng giống Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Bảng 3.8: Danh sách giống lúa nghiên cứu ST Tên giống T Pokkali IR 28 MTL 30 MTL 91 MTL 142 MTL 180 MTL 250 MTL 259 10 MTL 277 MTL 292 11 MTL 308 12 13 14 15 16 MTL 309 MTL 314 MTL 316 MTL 324 MTL 336 17 18 19 20 21 22 23 MTL 422 MTL 429 MTL 442 MTL 448 MTL 451 MTL 454 MTL 595 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 MTL 604 MTL 666 MTL 667 MTL 672 MTL 676 MTL 678 MTL 679 MTL 688 MTL 691 MTL 702 MTL 703 35 36 37 38 39 40 41 42 MTL 707 MTL 734 MTL 743 MTL 769 MTL 774 MTL 867 MTL 868 MTL 891 Gia phả (nguồn gốc) Cây mẹ Cây cha Lúa chịu mặn Bangladesh Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) IR9129-192-2-3-5 L79 BKN75091 Nếp Thái Lan L192-1-2-12-3 IR26 CNA4130 L204-5-5-9-2-1 MTL119 MTL112 IR68077-69-2-2-2-2 L205-2-17-2-3-3-3-1 MTL119 IR54742-192-3-2 Khao Hom Klong Luang L205-5-2-3-1-2-1 MTL119 IR54742-192-3-2 L205-5-5-4-1-1-2 MTL119 IR54742-192-3-2 L219-3-4-5-4-2-2 MTL119 VTX IR64683-87-2-2-3-3 L246-6-5-2-2-3 MTL119 IIR62112 L261-2-4-3 MTL142 IR64 L220-2-1-2-1-3-3-3-1 IR54743-11-43-12- KhaodawkMa 3-2li L318-1-2-2-3-1-1 MTL156 Khaohom L263-2-6-5-1-1 LTCN MTL142 L293-1-13-1-1-1-1 P6 Jasmin85 L318-1-24-6-2-1-1-1 MTL156 Khaohom L318-1-24-4-4-2-2-1 MTL156 Khaohom L318-1-24-4-4-2-1-1 MTL156 Khaohom L349-4-5-1-1-1-1 MTL241 IR50404/MT L142 L318-8-2-1-5-1 MTL156 Khaohom L448-1-1-1-2-2-1-2 Nếp Dứa Nếp Bè L448-1-1-1-7-1-3-1 Nếp Dứa Nếp Bè L448-1-1-2-5-1-1-1 Nếp Dứa Nếp Bè L449-2-2-6-2-3-1-3 Nếp Thái Nếp Bè L448-1-2-2-3-1-3 Nếp Dứa Nếp Bè L450-1-5-2-2-2-2-2 LV3 Nếp Thái L318-1-24-3-5-1-2-1-3-1 MTL156 Khaohom L318-1-2-4-4-2-1-2-2-1 MTL156 Khaohom L351-4-14-1-1-1-1-1-2-1 L295-2-6-1-2 MTL241 L349-5-6-1-1-1-1-1-1-1 MTL241 IR50404/MT L142 IR78555-68-3-3-3 L485-3-10-4-2-2-2-3-1-2 MTL352 MTL325 L474-6-3-5-2-1-2 OM1490 Nếp Thái Lan T3-1-3-3-4-1-7-3-1 Jasmin85 MTL98 L455-1-9-2-2-3-2-2-1-4-11 Amaroo ST3 L454-1-9-4-2-3-9-2-4-1 Amaroo ST3 L455-1-9-1-4-3-11-2-4-7-2 Amaroo VD20 L349-2-6-8-1-1-1-1-1-1-2 MTL241 IR50404/MT L142 30 3.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu a Đánh giá kiểu gen chịu mặn giống lúa Phân tích kiểu gen chịu mặn: DNA 40 giống lúa ly trích theo phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1987) Dung dịch ly trích DNA sử dụng CTAB 2X (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl) Ngồi cịn có chất hỗ trợ cho việc ly trích DNA thêm hiệu β-mercaptoethanol, chloroform: isoamyl alcohol (24:1), RNase, isopropanol, cồn ethanol (70%) Sau trích xong DNA hịa tan 50 µlTE (pH 8.0) trữ nhiệt độ -200C Kiểu gen chịu mặn đánh giá dựa vào liên kết 12 cặp mồi SSR liên kết với 12 NST theo Lin et al (2007) kỹ thuật PCR Phản ứng PCR thực 15 µL hỗn hợp PCR, sử dụng dung dịch 2xPCR (e-Taq NEXpro, Hàn Quốc) gồm thành phần 10X e-Taq Buffer, 10 mM dNTP, e-Taq DNA Polymerase, thêm vào nước tinh sạch, mồi, DNA Tất trộn trước cho vào máy PCR GeneAmp PCR System 2700 Phản ứng PCR thực 35 chu kỳ gia nhiệt, bao gồm: phút 95 0C, 30 giây 950C, 30 giây 58-700C (tùy vào nhiệt độ mồi), 30 giây 72 0C, kéo dài chuỗi phút 720C sản phẩm trữ 100C 20 phút thứ tự 12 cặp mồi với 12 NST liệt kê Bảng 3.9 Sau điện di gel nhuộm với ethidium bromide (10 mg/mL) Kết PCR ghi nhận dựa vào phổ điện di cho kích thước band trùng khớp với giống đối chứng dương (giống chống chịu), hay giống đối chứng âm (giống mẫn cảm) Bảng 3.9: Danh sách 12 cặp mồi SSR liên kết với QTL chống chịu mặn nằm 12 NST (Lin et al., 2007) Mồi Mồi xuôi 10 11 60 58 59 69 65 58 58 63 65 59 58 Band (bp) 105 161/145 156/120 223 171 141 112 118 86/75 0/240,280 110/97 12 64 168 Mồi ngược NST RM3810 ACGAAGGAACTACCCGTGTG CGCACATGTTACTCTAGCGG RM211 CCGATCTCATCAACCAACTG CTTCACGAGGATCTCAAAGG RM6329 CCCTGGATGAAAAGCACAAG GAAGTTGTAGATGCCCCATC RM127 GTGGGATAGCTGCGTCGCGTCG AGGCCAGGGTGTTGGCATGCTG RM17749 ACGCACATCACAACCTCACTGC TCTCTTGCCACACACCTTACATCC RM253 TCCTTCAAGAGTGCAAAACC GCATTGTCATGTCGAAGCC RM214 CTGATGATAGAAACCTCTTCTC AAGAACAGCTGACTTCACAA RM6369 CAAGCTAGGGCTGCATAAGC GCTTCACCTACCTACCTCACC RM24330 AATCCGCGGGAGCAATCAACC CGATGACCAATGACGAGGTGAGG RM 474 AAGATGTACGGGTGGCATTC TATGAGCTGGTGAGCAATGG RM 286 GGCTTCATCTTTGGCGAC CCGGATTCACGAGATAAACTC CACTAATTCTTCGGCTCCACTTT RM28102 AGG GTGGAAGCTCCGAGAAAGTGC Tm b Phương pháp phân tích số liệu Kích thước band DNA đánh giá kiểu gen tính tốn phần mềm GelAnalyzer (Istvan, 2010) Sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYS pc 2.1 để tạo nên biểu đồ thể mối liên hệ di truyền 31 3.3.2 Kết thảo luận 3.3.2.1 Kết đánh giá kiểu gene Kết nghiên cứu trước Leon et al (2017), nhận định cặp mồi RM211 liên kết với ba QTL qDWT2.3, qSIS2.3 qSHL2.3 alen vùng gene giống lúa Pokkali có tác dụng tích cực khả chịu mặn Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại cặp mồi RM211 liên kết nhiễm sắc thể số có 28 giống mang kiểu gene giống với Pokkali có kích thước khoảng 161 bp, lại 12 giống mang kiểu gene giống với IR28 vị trí 145 bp (Hình 3.5) Hình 3.5: Phổ điện di với mồi RM211 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Tương tự nhiễm sắc thể số tương ứng với mồi RM6329 giống Pokkali cho kiểu hình đồng hợp tử trội có kích thước khoảng 156 bp, cịn giống IR28 cho kiểu hình đồng hợp tử lặn có kích thước khoảng 120 bp Như có giống cho band giống với giống Pokkali, có 32 giống có band giống với giống IR28 có giống số 16 giống số 25 có kiểu hình dị hợp tử Theo kết nghiên cứu trước đây, cặp mồi RM6329 liên kết với QTL qCHL3 thể khả quang hợp gặp điều kiện mặn (Thomson et al., 2010) Như vậy, kết cho thấy giống có kích thước 156 bp có khả quang hợp tốt giống cịn lại điều kiện mặn (Hình 3.6) Hình 3.6: Phổ điện di với mồi RM6329 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Theo Thomson et al (2010), cặp mồi RM24330 nằm nhiễm sắc thể số liên kết hai QTL quan trọng cho việc hình thành tính kháng mặn qSNK9 qRNK9 Đây hai QTL thể hấp thụ tích lũy K+ cao tỷ lệ K+/Na+ cao giống lúa Pokkali Hình 3.7 cho thấy có khác giống đối chứng chịu mặn (Pokkali) giống đối chứng nhiễm mặn (IR28) Với giống Pokkali cho khuếch đại band hình có kích thước 86 bp cịn IR28 cho band hình có kích thước 75 bp Như tổng số 40 giống có 21 giống [4 (MTL91), (MTL 259), 10 (MTL292), 11(MTL308), 12 (MTL309), 14 (MTL316), 24 (MTL604), 25 (MTL666), 26 (MTL667), 27 (MTL672), 29 (MTL678), 30 (MTL679), 31 (MTL688), 32 32 (MTL691), 34 (MTL703), 35 (MTL707), 38 (MTL769), 39 (MTL774), 40 (MTL867), 41 (MTL868) 42 (MTL891)] cho band hình đồng với giống Pokkali, điều chứng tỏ 21 giống có kiểu hình tương tự Pokkali có tỷ lệ K+/Na+ cao Cịn lại 20 giống có kiểu band tương tự với IR28 có tỷ lệ K+/Na+ thấp Và có giống số 36 (MTL734) mang kiểu gene dị hợp tử Hình 3.7: Phổ điện di với mồi RM24330 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Trên nhiễm sắc thể số 10 ứng với cặp mồi RM474 khuếch đại locus giống đối chứng IR28 vị trí 240 bp 280 bp khơng có locus khuếch đại giống Pokkali, cho thấy giống chống chịu giống mẫn cảm có khác biệt vùng gen nhiễm sắc thể số 10 dẫn đến khác biệt khả chịu mặn giống Phổ điện di RM474 (Hình 3.8) có 11 giống khơng khuếch đại locus tương tự với Pokkali 29 giống lại điều khuếch đại locus tương ứng với giống IR28 Hình 3.8: Phổ điện di với mồi RM474 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 10 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Cặp mồi RM286 nằm nhiễm sắc thể 11 liên kết với QTL qSNC11 thể khả đào thải Na+ chồi Việc đào thải tốt làm giảm nồng độ Na+ chồi, giúp có khả chịu mặn tốt (Wang et al., 2012) Dựa vào kết phổ điện di RM286, kích thước band hai giống đối chứng IR28 Pokkali vị trí 97 bp 110 bp (Hình 3.9) Điều theo kết Hình 5, có 12 giống mang kiểu gene tương đồng với giống Pokkali giống số (MTL250), (MTL259), (MTL277), 15 (MTL324), 18 (MTL429), 19 (MTL442), 21 (MTL451), 22 (MTL454), 27 (MTL672), 28 (MTL676), 36 (MTL734) tất giống mang kiểu gen có khả đào thải Na+ tốt giúp vượt qua điều kiện mặn 33 Hình 3.9: Phổ điện di với mồi RM286 nhận diện kiểu gen kháng mặn nhiễm sắc thể số 11 40 giống lúa cải tiến gel acrylamide 8% Qua kết phân tích sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYS pc 2.1 để tạo nên biểu đồ phân nhóm 40 giống lúa cải tiến giống đối chứng mặn 12 SSR liên kết với QTL chịu mặn 12 NST (Hình 3.10), giống lúa chia thành nhóm Nhóm I gồm có giống số (MTL259) giống số 11 (MTL308) có khoảng cách di truyền nằm khoảng 0.84 - 0.9 Do nằm nhóm với giống đối chứng Pokkali nên giống MTL259, MTL308 giống có khả kháng mặn giống giống đối chứng Pokkali Nhóm II giống cịn lại nằm nhóm với giống IR28 giống 0.67 – 1.00, giống nhóm có kiểu gen gần với giống mẫn cảm mặn IR28 Hình 3.10: Sơ đồ di truyền nhánh dựa dấu phân tử SSR 40 giống lúa cải tiến phân tích hệ số tương đồng Nei-Li phương pháp UPGMA 3.3.2.2 Thảo luận Kết đánh giá kiểu gene 40 giống lúa cải tiến 12 cặp mồi SSR liên kết với QTL chịu mặn nằm rải rác 12 NST, bước đầu chọn lọc giống MTL259 MTL308 mang kiểu gene tương đồng với giống đối chứng Pokkali Với 12 cặp mồi sử dụng có cặp mồi (RM211, RM286, RM474, RM6329, RM6369, RM24330) dùng để đánh giá kiểu gene kháng mặn Cần phải lọc mặn môi trường dinh dưỡng giống để xác định khả chịu mặn giống Phân tích thêm nhiều dấu phân tử SSR để đánh giá khả chống chịu mặn giống lúa nhiều QTL khác 34 35 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Kể từ phát triển, thị phân tử SSR liên tục khảo sát ứng dụng nhiều loại thực vật bao gồm ngũ cốc, loại đậu, rau, rừng, ăn quả, kim loại khác loài thực vật quan trọng kinh tế Các thị phân tử Microsatellite không liên quan đến đa dạng di truyền nghiên cứu, di truyền quần thể nghiên cứu tiến hóa, mà cịn sử dụng nghiên cứu phân tích gen, lập đồ gen, hỗ trợ đánh dấu lựa chọn, Bản đồ liên kết gene dựa SSR hứa hẹn để khai thác đa dạng di truyền, đặc trưng cho biến đổi kiểu hình tích lũy, liên kết điểm đánh dấu với tính trạng tế bào mầm thực vật Tuy nhiên, phương pháp có số nhược điểm định trình bày phần Vì thế, thị phân tử SSR cần có phát triển ổn định cải tiến thêm thời gian tới để giúp cho hấp dẫn nhân giống dựa vào thị phân tử di truyền thực vật, giúp phần không nhỏ chọn giống trồng, cải thiện suất nông nghiệp 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdel-Mawgood A L., M.M.M Ahmed and B.A Ali, 2006 Application of molecular markers for hybrid maize identification J Food Agr Environ., 4: 176178 Beckmann J.S and J.L Weber, 1992 Survey of human and rat microsatellites Genomics, 12(4): 627–631 Chambers G.K and E.S MacAvoy, 2000 Microsatellites: consensus and controversy Comparative Biochemical and Physiology Part B, Biochemistry and Molecular Biology, 126(4): 455-476 Coenye, T and P Vandamme, 2005 Characterization of mononucleotide repeats in sequenced prokaryotic genomes DNA Research, 12(4): 221–233 Datta, S., S Mahfooz, P Singh, A.K Choudhary, F Singh and S Kumar, 2010 Cross-genera amplification of informative microsatellite markers from common bean and lentil for the assessment of genetic diversity in pigeonpea Physiology and Molecular Biology of Plants, 16(2): 123–134 Dintinger J A., S Salgon and B Reynaud, 2014 QTL mapping of a partial resistance to the corn delphacid-transmitted viruses in Lepidopteran-resistant maize line Mp705 Plant Breeding., 133(1): 19-27 Field D and C Wills, 1998 Abundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces cerevisiae, and the diferent distributions of microsatellites in eight prokaryotes and S cerevisiae, result from strong mutation pressures and a variety of selective forces Proceedings of National Academy of Sciences, 95(4): 1647–1652 Guo, X And J Mrázek, 2008 Long Simple Sequence Repeats in HostAdapted Pathogens Localize Near Genes Encoding Antigens, Housekeeping Genes, and Pseudogenes Journal of Molecular Evolution, 67(5): 497–509 Gur-Arie, R., C.J Cohen, Y Eitan, L Shelef, E.M Hallerman and Y Kashi, 2000 Simple sequence repeats in Escherichia coli: abundance, distribution, composition, and polymorphism Genom Research, 10(1): 62–71 Hancock, J.M., 2002 Genome size and the accumulation of simple sequence repeats: implications of new data from genome sequencing projects Genetica 115(1): 93–103 Jarne, P and P.J.L Lagoda, 1996 Microsatellites, from molecules to populations and back Trends in Ecology and Evolution, 11(10): 424–429 Kalia, R.K., K.R Manoj, K Sanjay, S Rohtas and A.K Dhawan, 2011 Microsatellite markers: An overview of the recent progress in plants Euphytica, 177: 309–334 Kumar, P., V.K Gupta, A.K Misra, D.R Modi and B.K Pandey, 2009 Potential of molecular markers in plant biotechnology Plant Omics Journal, 2: 141–162 37 Litt M and J.A Luty, 1989 A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Journal of Human Genetics, 44(3): 397-401 Ma J Q., M.Z Yao, C.L Ma and X.C Wang, 2014 Construction of a SSR based genetic map and identification of QTLs for Catechins content in tea plant (Camellia sinensis) PLoS ONE, 9(3): e93131 Mahfooz, S., A Srivastava, M.C Yadav and A Tahoor, 2019 Comparative genomics in phytopathogenic prokaryotes reveals the higher relative abundance and density of long-SSRs in the smallest prokaryotic genome Biotech, 9(9): 340 McDonald, D B and W.K Potts, 1997 Microsatellite DNA as a genetic marker at several scales In Avian Molecular Evolution and Systematics (D Mindell, ed.) Academic Press, New York pp 29-49 Miah, G., M Rafii, M Ismail, A Puteh, H Rahim, K Islam and M Latif, 2013 A Review of Microsatellite Markers and Their Applications in Rice Breeding Programs to Improve Blast Disease Resistance International Journal of Molecular Sciences, 14(11): 22499–22528 Morgante M, M HanafeZ and W Powell, 2002 Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes Nature Genetics;30(2): 194–200 Moxon, E R., P.B Rainey, M.A Nowak and R.E Lenski, 1994 Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria Current Biology, 4(1): 24–33 Mrazek, J., X Guo and A Shah, 2007 Simple sequence repeats in prokaryotic genomes Proceedings of National Academy of Sciences, 104(20): 8472–8477 Nguyen Duc Thanh, Nguyen Thi Kim Lien, Pham Quang Chung, Tran Quoc Trong, Le Thi Bich Thuy, and Henry Nguyen, 2006 MappingQTLs associated with root traits related to drought resistance in Vietnamese upland rice Asean Journal on Sci & Tech for Development (AJSTD),23(4): 323-332 Nguyễn Văn Mạnh, Huỳnh Như Điền, Văn Quốc Giang, Nguyễn Châu Thanh Tùng, Nguyễn Lộc Hiền, Lê Thị Hồng Thanh Huỳnh Kỳ, 2020 Đánh giá kiểu gene chịu mặn dấu thị phân tử SSR 40 giống/dịng lúa cải tiến Tạp chí khoa học Trường Đại Học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thuỷ sản Công nghệ Sinh học Tập 56 số 4B (2020): 102-108 Provan J, W Powell and P.M Hollingsworth, 2001 Chloroplast microsatellites: new tools for studies in plant ecology and evolution Trends in Ecology and Evolution.;16(3): 142–147 Rajendrakumar P, A.K Biswal, S.M Balachandran and R.M Sundaram, 2007 Simple sequence repeats in organellar genomes of rice: frequency and distribution in genic and intergenic regions Bioinformatics.;23(1):1–4 38 Tautz D and M Renz, 1984 Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes Nucleic Acids Research., 12(10): 41274138 Tautz D., 1989 Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers Nucleic Acids Research, 17(16): 6463–6471 Treangen, T.J., A.L Abraham, M Touchon and E.P.C Rocha, 2009 Genesis, effects and fates of repeats in prokaryotic genomes FEMS Microbiology Reviews, 33(3): 539–571 Wang, M.L., N.A Barkley and T.M Jenkins, 2009 Microsatellite markers in plants and insects Part I Applications of biotechnology Genes Genomes Genomics, 3: 54–67 Weber, J.L., 1990 Informativeness polymorphisms Genomics, 7: 524–530 of human (dC-dA)n(dGdT)n Zane L, L Bargelloni and T Patarnello, 2002 Strategies for microsatellite isolation: a review Molecular Ecology.;11(1): 1–16 39 ... giống trồng ngẫu nhiên 10 liếp, kích thước liếp 1m x 3m, khoảng cách liếp 0,5 m, liếp trồng giống, giống (1 cây/ lặp lại) Các giống hoa hồng trồng, chăm sóc quản lý 18 tình trạng sinh trưởng cây, ... nằm nhóm với giống đối chứng Pokkali nên giống MTL259, MTL308 giống có khả kháng mặn giống giống đối chứng Pokkali Nhóm II giống cịn lại nằm nhóm với giống IR28 giống 0.67 – 1.00, giống nhóm có... thư viện làm giàu cDNA 1.2 Mục tiêu Báo cáo ? ?SSR chọn giống trồng? ?? thực nhằm mục tiêu: + Tìm hiểu kỹ thuật SSR + Phân tích số báo sử dụng kỹ thuật SSR số loài thực vật như: hoa hồng, đậu tương