Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2014 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CYANUA TỔNG TRONG SẮN VÀ Bà SẮN DETERMINATION OF TOTAL CYANIDE CONTENT IN CASSAVA AND CASSAVA RESIDUE Hồ Diễm Thúy 1, Phạm Thị Mai 2, Nguyễn Minh Trí Ngày nhận bài: 15/5/2013; Ngày phản biện thơng qua: 03/7/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014 TĨM TẮT Sắn nguồn thực phẩm cung cấp lượng chủ yếu 80 quốc gia vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, sắn lương thực đóng vai trị kinh tế xã hội quan trọng đứng sau lúa ngô Trong sắn bã sắn tồn hợp chất gây độc cho thể có tên gọi cyanua, gồm cyanua tự hợp chất chứa cyanua chủ yếu dạng linamarin Do vậy, cần phải xác định hàm lượng cyanua tổng sắn bã sắn cách sử dụng linamarase để thủy phân linamarin giải phóng cyanua tự Linamarase từ nhựa sắn non có hoạt độ 1,87 U/ml Hàm lượng cyanua tổng 40 mẫu sắn tươi, bã sắn tươi bã sắn khô xác định cách thủy phân mẫu sử dụng linamarase lớn 1,5 đơn vị/10 g bã sắn tươi (1,7 g khô) 30 ± oC 15 phút Acid cyanhydric xác định theo 10 TCN 604:2004 Kết cho thấy, sắn tươi hàm lượng HCN tổng 331mg/kg khối lượng khô Hàm lượng HCN tổng bã sắn tươi từ nhà máy 241 mg/kg khối lượng khô Hàm lượng HCN tổng bã sắn tươi từ hộ chế biến thủ công 270,18 mg/kg khối lượng khô Hàm lượng HCN tổng bã sắn khô 77,9 mg/kg khối lượng khô Hàm lượng HCN tổng sắn tươi bã sắn tươi vượt quy định sử dụng làm thức ăn chăn ni gia súc Từ khóa: sắn, bã sắn, linamarase, cyanua, cyanua tổng ABSTRACT Cassava is a primary food source rich of calories in more than 80 tropical countries In Vietnam, cassava is a food crop which plays a socio-economically important role after rice and maize In cassava and cassava residue exists a compound toxic to human which is called cyanide, including free cyanide and cyanide compounds mainly linamarin It is therefore important to determine total cyanide content of cassava and cassava residue by using linamarase to hydrolyse linamarin and release free cyanide Linamarase from young cassava leaves latex has activity of 1.87 U/ml Total cyanide contents in 40 samples of fresh cassava, fresh cassava residue and dry cassava residue were determined by hydrolysing the materials at 30 ± 2°C during 15 minutes using linamarase of more than 1.5 units/10 g fresh weight (1.7 g dry weight, following an quantification of free cyanhydric acid according to 10 TCN 604:2004 The results showed that the total HCN contents in fresh cassava residue, fresh cassava residue from factory, fresh cassava from household process and in dry cassava residue were respectively 331 mg/kg dry weight; 241 mg/kg dry weight; 270.18 mg/kg dry weight and 77.9 mg/kg dry weight These contents in fresh cassava and fresh cassava residue were over the limit for breeding Keywords: cassava, cassava residue, linamarase, cyanide, total cyanide I ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn lương thực góp phần đáng kể vào kinh tế quốc dân Việt Nam quốc gia khác vùng nhiệt đới [9] Tính đến đầu năm 2013 diện tích sắn nước 510 nghìn ha, sản lượng sắn 9,21 triệu tấn, kim ngạch xuất sắn sản phẩm sắn đạt 3,12 triệu tấn, giá trị đạt 131 triệu USD, tăng lượng 26,9% 71,6% giá trị so kỳ năm 2012 [2] Hiện nay, sắn sử dụng làm nguyên liệu cho nhà máy chế biến tinh bột, bột ngọt, bánh kẹo, phụ gia thực phẩm nguồn nguyên liệu làm thức ăn gia súc Bã sắn cơng nghiệp phụ phẩm q trình sản xuất Hồ Diễm Thúy: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 – Trường Đại học Nha Trang ThS Phạm Thị Mai: Viện Công nghệ sinh học Môi trường – Trường Đại học Nha Trang TS Nguyễn Minh Trí: Khoa Cơng nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 195 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản sản phẩm sắn, chiếm 45% so với khối lượng nguyên củ [3] Đây nguồn liệu dồi cho ngành chăn nuôi mà giá thành lại rẻ Tuy nhiên, việc tiêu thụ sắn sản phẩm sắn gắn liền với nguy ngộ độc thực phẩm diện cyanua tổng bao gồm cyanua tự hợp chất chứa cyanua Dạng tồn chủ yếu hợp chất chứa cyanua linamarin, chiếm lượng lớn từ 80 đến 96% [7] Sự thủy phân linamarin linamarase (β – glucosidase (một enzyme nội sinh sinh từ vi sinh vật ) giải phóng acid cyanhyric, hợp chất độc [7] (hình 1) Độc tính gây gốc cyanua (CN ¯) [14] Cyanua sinh nhanh chóng chuyển sang thiocyanate, phân phối rộng rãi thể người, với nồng độ cao gan thận Thiocyanate cản trở khả sử dụng iốt thể [17] Số 1/2014 Độc tính cao gốc cyanua liên kết chặt chẽ với hemoglobin, ức chế trình vận chuyển oxy làm cho thể thiếu oxy Việc bắt giữ CN ¯ hemoglobin phản ứng tự vệ thể nhằm ngăn chặn CN ¯đi vào bên tế bào, liên kết chặt chẽ với nhân Fe2+ Cu2+ hệ thống enzyme hô hấp cytochrome, thực chức vận chuyển điện tử chuỗi phản ứng hơ hấp tế bào Nhưng phản ứng tự vệ làm cho hemoglobin khả vận chuyển oxy, dẫn đến ngạt thở, da bầm tím, suy nhược thần kinh, tê liệt tồn hệ thống thần kinh gây chết nhanh bị ngộ độc Vấn đề lớn thực vật bậc cao vi sinh vật cyanua cản trở đường phosphoril hóa, oxy hóa cách kết hợp với cytochrome – oxidate ức chế vận chuyển điện tử, ức chế hình thành ATP [12] Hình Sơ đồ chuyển hóa linamarin acid cyanhydric thể người động vật [6], [17] Ngoài ra, thủy phân linamarin cịn diễn mơi trường acid môi trường kiềm, nên vào thể người linamarin nhanh chóng chuyển thành cyanua Mặt khác, linamarin vào thể người phần tiết qua nước tiểu [10] Linamarin cho yếu tố nguy gây suy yếu khả dung nạp glucose dẫn đến bệnh đái đường [19], gây bướu cổ, đần độn, liệt hai chi rối loạn hệ thần kinh [17] Do việc định lượng cyanua tổng (cyanua tự linamarin) sắn bã sắn cần thiết Để phản ánh nguy nhiễm độc sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi, tiến hành thực nghiên cứu 196 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Sắn tươi (giống sắn KM98-5) thu mua thời điểm thu hoạch năm từ huyện Cam Ranh, Diên Khánh, Khánh Vĩnh, Ninh Hòa (tỉnh Khánh Hòa) Sắn tươi rửa sạch, bổ dọc củ thành tám phần nhau, cắt lát mỏng, trộn cho vào hộp đựng mẫu có nắp đậy kín Bã sắn tươi bã sắn khơ lấy từ hộ chế biến sắn thủ công Nhà máy Chế biến sắn Ánh Tuyết, Cam Hải Tây, Cam Ranh (Khánh Hịa) Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Hóa chất sử dụng phân tích hóa chất chuẩn, tinh khiết Thu linamarin Linamarin sử dụng để xác định khả thủy phân enzyme linamarase g sắn non cắt nhỏ, giã với ml HCl 0,1 M cối chày thủy tinh, lọc thu dịch đục màu hồng Tiến hành li tâm, thu dịch lên Khoảng ml chất dịch lấy pipet Pasteur Dịch có chứa linamarin linamarase (bất hoạt HCl 0,1M), bảo quản - 20oC [15] Thu linamarase từ nhựa sắn Thu linamarase từ nhựa sắn (nhựa cây) Nhựa thu trực tiếp sắn cuối thân cuống sắn, sau trộn với nước cất sở 10 ml cho 0,1 g nhựa sắn, dịch lọc chứa enzyme thô, bảo quản nhiệt độ đông sâu [16] Xác định hoạt độ linamarase Hoạt độ linamarase xác định theo phương pháp Rezaul Haque M [16] Hoạt độ linamarase lượng linamarase xúc tác để thủy phân ml linamarin tạo thành 1µmol HCN thời gian phút Xác định hàm lượng ẩm sắn bã sắn Hàm lượng ẩm sắn tươi, bã sắn tươi bã sắn khô xác định theo tiêu chuẩn TCVN 4326:2001 [5] Xác định lượng linamarase thích hợp nhằm thủy phân hồn toàn linamarin Một lượng (0; 0,09; 0,37; 0,75; 1,12; 0,025; 1,31; 1,5 đơn vị) linamarase thu từ nhựa sắn non thêm vào bình kín chứa 10 g bã sắn tươi (ứng với 1,7g khối lượng khô), phản ứng thủy phân diễn 30 ± 2oC 15 phút Tiến hành xác định hàm lượng HCN giải phóng Số 1/2014 Xác định hàm lượng cyanua tổng số sắn bã sắn Acid cyanhydric tự sắn bã sắn định lượng cách ngâm 10 – 20g mẫu nước dùng nước chưng cất lôi chuyển acid cyanhydric vào dung dịch NaOH 2,5% Sau chuẩn độ dung dịch thu dung dịch AgNO3 0,02 N với có mặt KI 5% [1] Tuy nhiên, phương pháp định lượng linamarin tồn bên tế bào Do đó, sử dụng linamarase có nguồn gốc từ nhựa sắn non pH tự nhiên để thủy phân linamarin giải phóng acid cyanhydric, phản ứng diễn 30 ± 20C 15 phút, sau tiến hành định lượng acid Xử lý thống kê Số liệu báo cáo kết trung bình ba lần phân tích trình bày dạng trung bình ± SD Kết phân tích thống kê vẽ đồ thị phần mềm Excel Giá trị p < 0,05 coi có ý nghĩa mặt thống kê III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Xác định hoạt độ linamarase thu từ nhựa sắn non Việc xác định hoạt độ linamarase thu từ nhựa sắn non cho thấy: với 0,1 ml linamarase thêm vào ống chứa ml linamarin 30 ± 20C 15 phút giải phóng 75,6 µg cyanua tự giải phóng 156,2 µg cyanua tổng Như vậy, hoạt độ linamarinase thu từ nhựa sắn nghiên cứu 1,87 U/ml Giá trị lớn so với kết nghiên cứu Rezaul Haque (1999) (1,2 U/ml [16]) lớn báo cáo Ogbonnaya (2011) – hoạt độ linamarase thu từ vi sinh vật 1,41 U/ml [13] Xác định lượng linamarase thích hợp thủy phân hồn toàn linamarin chất Kết xác định lượng linamarase thủy phân linamarin có chất dư thể hình Hình Hàm lượng HCN giải phóng sử dụng linamarase TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 197 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Sử dụng linamarase thủy phân linamarin bã sắn tươi cho thấy: hàm lượng cyanua tự mẫu bã sắn tươi 103,18 mg/kg khối lượng khô Hàm lượng cyanua tổng giải phóng 249,92 mg/kg khối lượng khô Như vậy, lượng cyanua tổng gấp 2,4 lần so với lượng cyanua tự Kết trên 1,3 đơn vị hoạt độ linamarase cyanua tổng giải phóng q trình thủy phân khơng đổi Vì thế, nghiên cứu tiến hành chọn lượng linamarase lớn 1,5 đơn vị/10 g khối lượng tươi (1,7g khối lượng khô) để định lượng cyanua tổng sắn bã sắn Hàm lượng cyanua tổng sắn tươi tỉnh Khánh Hòa Hàm lượng cyanua tổng sắn tươi tỉnh Số 1/2014 Khánh Hịa thể hình Sắn tươi sử dụng làm thức ăn cho người gia súc có hàm lượng cyanua cao, điều dẫn đến khả ngộ độc cao dung nạp vào thể lượng lớn Sắn tươi trồng huyện E có hàm lượng cyanua tự cyanua tổng cao 137 mg/kg khối lượng khô 331 mg/kg khối lượng khô Sắn tươi trồng huyện A có hàm lượng cyanua tự cyanua tổng thấp 65 mg/kg khối lượng khô 161,1 mg/kg khối lượng khô Kết phù hợp với kết Cereda (1996), hàm lượng HCN sắn dao động từ 30 – 150 mg/kg khối lượng khô [7]; kết Eric Mantey Obilie (2004), hàm lượng HCN từ 63 – 110 mg/kg khối lượng khô [8]; kết Trần Thị Hoan (2012), hàm lượng HCN từ 30 – 400 mg/kg khối lượng khô [6] Hình Hàm lượng cyanua sắn tươi huyện tỉnh Khánh Hịa Nhìn vào biểu đồ cho ta thấy, hàm lượng cyanua tự dao động từ 41 – 50% lượng cyanua tổng/trọng lượng khô Kết phù hợp với báo cáo Kobawila (2005), hàm lượng cyanua tự chiếm 43% lượng cyanua tổng/trọng lượng khơ [10] Điều chứng tỏ ngâm mẫu có mặt cyanua nước dùng nhiệt để lơi HCN theo nước xác định cyanua dạng tự mà xác định cyanua dạng hợp chất Do đó, khơng thể xác định hàm lượng cyanua tổng Hàm lượng cyanua tổng bã sắn tươi Hình Hàm lượng cyanua bã sắn tươi từ nhà máy chế biến sắn 198 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hình Hàm lượng cyanua bã sắn tươi từ hộ chế biến sắn thủ công Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Để sử dụng bã sắn tươi qua trình chế biến tinh bột sắn làm thức ăn chăn ni hàm lượng acid cyanhydric phải nằm tiêu chuẩn cho phép 100 mg/kg khối lượng khơ [4] Nhìn vào biểu đồ ta thấy: có hàm lượng cyanua tự bã sắn tươi từ nhà máy chế biến từ hai hộ chế biến sắn thủ công thấp 100 mg/kg khối lượng khô Bã sắn tươi từ nhà máy chế biến sắn có hàm lượng cyanua tự HCN cao 100 mg/kg khối lượng khô, thấp 57 mg/kg khối lượng khô Bã sắn tươi từ hộ chế biến sắn thủ cơng có hàm lượng HCN tự cao 111,9 mg/kg khối lượng khô, thấp 61,3 mg/kg khối lượng khô hàm lượng cyanua Hàm lượng cyanua tổng bã sắn tươi từ nhà máy chế biến sắn cao 241 mg/kg khối lượng khô, thấp 126 mg/kg khối lượng khô Hàm lượng cyanua tổng bã sắn tươi từ hộ chế biến sắn thủ công cao 270,18 mg/kg khối lượng khô, thấp 142,6 mg/kg khối lượng khô Số 1/2014 Kết lớn kết báo cáo Bùi Quang Tuấn (2008), hàm lượng HCN bã sắn tươi 200,35 mg/kg [18] Nhìn chung, bã sắn tươi từ nhà máy có hàm lượng cyanua tổng thấp so với bã sắn tươi từ hộ chế biến thủ công khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Nguyên nhân dẫn đến khác biệt trình sản xuất tinh bột sắn nhà máy xử lí qua nhiều cơng đoạn như: băm, mài, nghiền, tẩy màu, ép tách bã, cô đặc, li tâm tách nước, sấy khô nên hàm lượng HCN tổng loại bỏ cơng đoạn Như vậy, hàm lượng cyanua tổng bã sắn tươi từ nhà máy chế biến sắn hay từ hộ chế biến thủ công vượt giới hạn cho phép sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Hàm lượng cyanua tổng bã sắn khô Kết định lượng cyanua tổng bã sắn khô từ nhà máy chế biến sắn thể hình Hình Hàm lượng cyanua bã sắn khơ từ nhà máy chế biến sắn Do trình phơi nắng dài ngày, hàm lượng cyanua tổng cyanua tự bã sắn khô giảm đáng kể độc tố cyanua tồn bên bã sắn Cụ thể là, hàm lượng cyanua tổng cao 77,9 mg/kg khối lượng khô, thấp 40,44 mg/kg khối lượng khô Hàm lượng cyanua tự cao 38,6 mg/kg khối lượng khô, thấp 26,3 mg/kg khối lượng khô Kết phù hợp với báo cáo Bùi Quang Tuấn (2008), hàm lượng cyanua bã sắn khô 78 mg/kg khối lượng khô [18] chứng minh Muzanila (1999) [11] IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Hoạt độ linamarase từ nhựa sắn non 1,87 U/ml Sử dụng lượng linamarase lớn 1,5 đơn vị/10 g khối lượng tươi (1,7 g khối lượng khô)/ 15 phút/30 ± 2oC để thủy phân sắn bã sắn Sắn tươi bã sắn tươi có hàm lượng cyanua vượt tiêu chuẩn cho phép Cụ thể là, hàm lượng cyanua sắn tươi, bã sắn tươi từ nhà máy, bã sắn tươi hộ chế biến sắn thủ công 331 ± 2,60 mg/kg khối lượng khô, 241 ± 9,7 mg/kg khối lượng khô 270,18 ± 32,943 mg /kg khối lượng khô Đối với bã sắn khơ có hàm lượng cyanua 77,9 ± 5,24 mg/kg khối lượng khô Kiến nghị Khi sử dụng sắn bã sắn tươi làm thực phẩm cho người thức ăn chăn nuôi cần lưu ý đến nguy nhiễm độc cyanua Nghiên cứu khử cyanua tổng sắn bã sắn để sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 199 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Báo cáo kết thực kế hoạch quý I năm 2013 ngành Nông nghiệp Phát triển nông thôn Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Trần Thị Hoan, 2012 Nghiên cứu trồng sắn thu sử dụng bột sắn chăn nuôi gà thịt gà đẻ bố mẹ lương phượng Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp Đại học Thái Nguyên Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả, Bùi Văn Lợi, 2008 Đánh giá giá trị dinh dưỡng bã sắn công nghiệp ủ chua với phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại Tạp chí Khoa học Đại học Huế Số 46 10 TCN 604:2004 Nông sản thực phẩm - Phương pháp xác định hàm lượng acid cyanhydric QCVN 01 - 78: 2011/BNNPTNT: TCVN 4326:2001 (ISO 6496:1999) Thức ăn chăn nuôi - Xác định độ ẩm hàm lượng chất bay khác Cereda, M.P., Mattos, M.C.Y., Venom Anim, J., 1996 Linamarin - The toxic compound of cassava Journal of Venomous Animals and Toxins, 2: 6-12 Eric, M.O., Kwaku, T.D., Amoa, A., Wisdom K., 2004 Souring and breakdown of cyanogenic glucosides during the processing of cassava into akyeke International Journal of Food Microbiology, 93: 115-121 Food outlook 2012 Tiếng Anh 10 Kobawila, S.C., Louembe, D.,Keleke, S., Hounhouigan J., Gamba, C., 2005 Reduction of the cyanide content during fermentation of cassava roots and leaves to produce bikedi and ntoba mbodi, two food products from Congo African Journal of Biotechnology, (7): 689-696 11 Muzanila, Y.C., Brennan, J.G and King., R.D., 1999 Residual cyanogens, chemical composition and aflatoxins in cassava four from Tanzanian villages Food Chemistry, 70: 45-49 12 Nartey, F., 1981 Cyanogenesis in tropical feeds and feedstuffs Cyanide in Biology London: Academic Press: 115-132 13 Ogbonnaya, N and Florence Onyebuchi, A., 2011 Linamarase Enzyme from Lactobacillus delbrueckii NRRL B-763: Purification and Some Properties of a β-Glucosidase J Mex Chem Soc 55 (4): 246-250 14 Oke, OL., 1969 The role of hydrocyanic acid in nutrition World Rev Nutr Dietetics, 11: 170-198 15 Rezaul Haque and Bradbury, M., Howard, J., 2004 Preparation of linamarin from cassava leaves for use in a cassava cyanide kit Food Chemistry, 85: 27-29 16 Rezaul Haque M., Bradbury, 1999 Preparation of linamarase solution from cassava latex for use in the cassava cyanide kit Food Chemistry, 67: 305-309 17 Tchango Tchango, J., Bikoï, A., Achard, R., Escalant, J.V., Ngalani, J A., 1999 Cassva: Post-harvest Operations Centre de Recherches Regionales sur Bananiers et Plantains Cameroon (CRBP): 1-126 18 Tuan Bui Quang, 2008 A study on cassava residue preservation for dairy cattle feeding Hanoi Agricultural University 19 Yessoufou, A., Ategbo, JM., Girard, A., Prost, J., Dramane, KL., Moutairou, K., Hichami, A., Han, NA., 2002 Cassava-enriched diet is not diabetogenic rather it aggravates diabetes in rat Fundam Clin Pharmacol, 20 (6): 579 - 586 200 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG