(TIỂU LUẬN) trình bày pp sx 1 loại enz ứng dụng của enz đó trong CNTP

Trình bày pp sx loại enz & ứng dụng enz CNTP (khơng q 25 trang) quy trình sản xuất ứng dụng (sp nào) (vd quy trình A  B  C  D enz ứng dụng cơng đoạn nào) - vai trò chế hệ I.ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Viêt Nam trồng nơng nghiệp lúa (Oryza sativa) thuộc họ thân thảo (Graminae) loại lương thực quan trọng 1/2 dân số giới trồng phổ biến nhiều vùng đồng sơng Cửu Long tiềm lực ý nghĩa kinh tế lớn với gian sinh trưởng trung bình từ 75-250 ngày tùy theo chủng loại Ở nước ta phân thành hai loại lúa nếp lúa tẻ Việt Nam nước xuất lúa đứng hàng thứ hai giới Ngày nay, với phát triển vượt bật khoa học công nghệ, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều áp dụng hầu hết nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, y dược phục vụ cho việc dưỡng nhan đa số phái đẹp giới Một số phải kể đến enzyme amylase lợi ích mà amylase mang lại ngành thực phẩm ……………………………………………………………………………………… Vì vậy, đề tài “Tìm hiểu q trình trích ly enzyme amylase từ mầm lúa (Oryza sativa) ” thực nhằm xác định số hoạt tính điều kiện trích ly mầm lúa thu nhận enzyme amylase Qua đó, giúp mở rộng nhiều hướng mới, góp phần làm gia tăng tiềm lực kinh tế lúa nói chung nâng cao chất lượng nông sản Việt Nam nói riêng II.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 2.1 Giới thiệu lúa (Oryza sativa L) Cây lúa loại lương thực vô phổ biến giữ vai trò quan trọng đời sống người Việt Nam Nó gắn bó với người dân ta từ lâu đời, thực phẩm quan trọng thiếu bữa ăn ngày lương thực xuất hàng đầu nước nhà 2.2 Cấu trúc hạt lúa Vỏ trấu: bao gồm hợp chất cellulose silic cấu tạo thành thường cứng với mục đích bảo vệ hạt chống phá hoại côn trùng sâu bọ hay mầm bệnh khác điều kiện thời tiết bất lợi Màu sắc vỏ trấu (vàng nhạt -> vàng nâu) có thay đổi theo giống lúa Vỏ hạt: nội biểu bì đến tầng trung lớp bên ngồi lớp biểu bì, vỏ hạt có màu đỏ trắng đục bọc xung quanh hạt Nội nhũ: hạt lúa phần chiếm lớn nhất, chủ yếu glucid 90%, protein, vitamin Phôi: có chứa tử diệp nằm góc hạt ép sát vào bên nội nhũ quan để biến đổi chất dự trữ nội nhũ thành chất dinh dưỡng nhằm cung cấp cho phát triển mầm Phôi hạt có protein, lipid, vitamin, đường hay enzyme khác Màng lúa: chiều cao khoảng 1/3 vỏ hạt Tùy vào giống lúa điều kiện canh tác mà độ dài màng lúa có khác Vỏ trấu hồng so với màng lúa lại có màu vàng nhạt 2.3 Thành phần dinh dưỡng Tùy theo điều kiện canh tác, giống lúa hay điều kiện đất đai mà thành phần dinh dưỡng hạt lúa khác Bảng Thành phần dinh dưỡng hạt lúa Thành phần dinh dưỡng Protein Tinh bột Lipid ( tổng số) (Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2004) Nước: hạt thóc nước vừa dạng tự vừa dạng liên kết Chất lượng hạt lúa phụ thuộc vào lượng nước lượng nước giảm hạt lúa già Protein: chiếm 8-9% Lượng protein bị biến tính thối hóa dần lúc bảo quản Khi kết hợp với nước, protein trương nở thành thể keo Lipid: chiếm 2% hàm lượng hạt Glucid: amylose amylopectin hai thành phần có tinh bột.Tùy thuôc vào giống lúa mà amylose anylopectin có thay đổi Gạo tẻ khoảng 19,5% amylose 81,5% amylopectin; nếp khoảng 0,7% amylose amylopectin 99,3% Cellulose hemicellulose chủ yếu vỏ trấu vỏ hạt, polysaccharide tiêu hóa Vitamin: carotenoid, B6, PP, B1, B2, H, C, E Amino acid: sản phẩm trung gian dùng để tổng hợp thủy phân protein Enzym: enzym amylase: enzym oxy hóa khử, a-amylase β-amylase , protease số khác Trong trình nảy mầm enzym hoạt động mạnh tăng cao thúc đẩy cho phản ứng sinh-lý-hóa với sinh tổng hợp loại enzym Các trình gần giống đại mạch, khác mức độ tạo thành enzym tốc độ phản ứng III GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME AMYLASE 3.1 Định nghĩa Amylase nhóm thuộc enzyme tiêu hoá thuỷ phân liên kết glycosidic tinh bột thành glucose, maltos dextrin hạn chế Nhiều enzyme hoạt động tinh bột oligosaccharise có nguồn gốc từ chúng, xúc tác phân giải liên kết glucoside nội phân tử polysaccharide có tham gia nước Ở nước bọt người có loại enzyme amylase gọi ptyalin số loài động vật có vú khác chó, mèo, ngựa lại khơng có diện amylase Ptyalin bắt đầu thuỷ phân tinh bột từ vùng miệng trình ruột non hồn tất nhờ amylase tuyến tuỵ gọi amylopsin Amylase malt thủy phân tinh bột lúa mạch để tạo thành disaccharide làm chất trình lên men nấm men Để cải thiện suất tiềm enzyme amylase, gen sinh vật phải đổi theo hai cách khác nhau: cải thiện dòng cổ điển cách đột biến có chọn lọc, hai sử dụng enzyme amylase tái tổ hợp tạo vi sinh vật sử dụng trình lên men chìm lên men trạng thái rắn Enzyme amylase có ứng dụng tiềm đa dạng chiếm khoảng 30% sản lượng enzyme giới Một khảo sát toàn diện tài liệu α-amylase, ß-amylase γ-amylase, cấu trúc chúng, đặc điểm chính, nguồn gốc khác thực vật, nấm, động vật vi sinh vật khía cạnh sản xuất khác nhau: lên men, bánh mì, dệt, giấy dược phẩm, amylase từ nấm cịn sử dụng rộng rãi cho ứng dụng thương mại hay ngành công nghiệp chế biến thực phẩm việc làm rõ khói mù nước trái cây, đồ uống có cồn, sản xuất xi-rô glucose maltose, sản phẩm thực phẩm khác, bên cạnh ứng dụng quan trọng amylase công nghiệp tinh bột sản xuất đường từ tinh bột 3.2 Phân loại enzyme amylase Amylase có sáu loại có ba loại phổ biến: α-amylase, γ-amylase βamylase, dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase oligodextrin6-glucanhydrolase (hay dextrinase) Amylase chia thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) hoạt động phần bên phân tử chất, exoamylase (enzyme ngoại bào) ngược lại hoạt động đầu tận khơng có tính khử Do đó, gốc glucose đầu tận liên kết α-1, bị phân cắt α- amylase Endoamylase: α-amylase nhóm enzyme khử nhánh Có hai loại thuộc nhóm enzyme khử nhánh nhánh khử trực tiếp (pullulanase hay α-dextrin 6gluccanohydrolase), nhánh khử gián tiếp (amylo-1,6-glucosidase transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase)) Các loại enzyme thủy phân liên kết bên chuỗi polysaccharide Exonuclease: β-amylase γ-amylase Đó loại enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử chuỗi polysaccharide Vẽ sơ đồ AMYLASE Ở nguồn khác đặc tính thủy phân, thành phần, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu tính chất ổn định với nhiệt khác Amylase dễ tan nước dung dịch hay rượu loãng Protein α-amylase có tính chất globulin acid yếu Có điểm đẳng điện thường nằm vùng có độ pH 4,2 – 5,7 3.3 Đặc tính chế hoạt động enzyme amylase 3.3.1 α-amylase α -amylase enzyme hydrolase xúc tác cho trình thuỷ phân liên kết α -1, 4glycosidic chất tinh bột cách ngẫu nhiên tạo glucose maltose endoenzym (enzym nội bào) Như canxi metalloenzyme, tức phụ thuộc vào diện yếu tố đồng kim loại cho hoạt động Bên cạnh α -amylase có khả phân hủy hồ tinh bột khả phân hủy hạt tinh bột nguyên vẹn α-amylase enzym có tầm quan trọng thiết yếu hoạt động thủy phân tinh bột hoạt động thực nhờ trình thủy phân Một hoạt động sản xuất xi-rô glucose fructose từ tinh bột (α-amylase xúc tác bước trình này) Trước đây, tinh bột thủy phân thành glucozơ phương pháp thủy phân axit Tuy nhiên có hạn chế điều kiện nhiệt độ cao hoạt động có tính axit cao Những hạn chế khắc phục cách thủy phân tinh bột enzyme để thu xi-rô fructose cao Enzyme an tồn với mơi trường tăng cường khả tẩy rửa để loại bỏ vết bẩn khó giặt Chúng phân hủy sinh học hoạt động điều kiện nhẹ so với chất xúc tác hóa học ưa chuộng chất xúc tác sau α-amylase có nhiều ứng dụng vào ngành cơng nghiệp Việt nam động lực thúc đẩy cho việc nghiên cứu sản xuất enzyme cách tối ưu tính an tồn tiện lợi Đặc tính: Trọng lượng phân tử α -amylase malt 59.0OdkDa Điểm đảng điện vùng pH 4,2-5,7 - Dễ tan nước, dung dịch muối rượu loãng - Protein amylase có tính chất globuline có tính acid yếu - Mỗi phân tử α-amylase chứa 1-30 ngun tử gam Ca/mol, khơng 16 ngun tử gam/mol Ca góp phần tạo nên ổn định hình thành cấu trúc bậc enzym Khi bị tác động enzym phân giải protein tác nhân gây biến tính khác, Ca cịn có cơng dụng trì tồn cho enzyme Trường hợp Ca bị loại khỏi phân tử α-amylase hoàn toàn bị hết khả thủy phân chất Các amylase khác chịu nhiệt so với α-amylase Đặc tính có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca phân tử Kim loại nặng Cu : Ag, Hg kìm hãm tất amylase - Tùy vào nguồn khác mà khả hoạt động điều kiện hoạt động aamylase khác Ví dụ: pH tối thích cho hoạt động α-amylase từ đại mạch nảy mầm thóc nảy mầm 5,3 (hoạt động tốt khoảng pH 4,7-5,4) Cũng độ bền α -amylase nấm mốc tốt so với acid α-amylase malt Từ thấy pH tối thích α -amylase từ vi sinh vật khác so với α -amylase từ malt - Tuy nhiên pH nhiệt độ hai yếu tố ảnh hưởng đến độ bền α -amylase Ví dụ: Ở điều kiệu nhiệt độ 0°C pH=3,6, a-amylase malt bị hoạt tính hồn tồn Tuy nhiên nhiệt độ 58-60°C a-amylase mầm thóc malt hoạt động tốt Chính người ta thường đường hóa chất malt khoảng nhiệt độ từ 60-65°C để sản xuất rượu Bảng độ bền với nhiệt α-amylase từ malt Nhiệt độ (0C) 65 70 75 Cơ chế: hình chế tác động a-amylase lên tinh bột ( Nguyễn Đức Lượng t156) α-amylase trình thủy phân tinh bột bao gồm nhiều giai đoạn: - Trong tinh bột, enzym phân cắt số liên kết tạo lượng lớn dextrin (phân tử thấp), dextrin tiếp tục bị thủy phân cho maltose glucose - Amylose bị phân cắt thành polyglucose (6-7 gốc glucose) tác dụng aamylase, sau polyglucose (6-7 gốc glucose) tiếp tục phân cắt thành chuỗi ngắn dần tạo thành maltose, maltotriose, maltotetrose Nếu thời gian tác dụng dài hơn, amylose 13% glucose 87% maltose sản phẩm trình thủy phân Tương tự cho a-amylase tác dụng lên amylopectin sản phẩm tạo 19% glucose, 72% maltose, bên cạnh cịn có dextrin (phân tử thấp) 8% isomaltose lí a-amylase khơng cắt liên kết 1,6-glucoside mạch nhánh phân tử amylopectin Các giai đoạn trình thủy phân tinh bột a-amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Sơ đồ 156 α -amylase có khả dextrin hóa cao nên gọi α-amylase là: amylase dịch hóa amylase dextrin hóa 3.3.2 β-amylase β-amylase enzyme exohydrolase hoạt động từ đầu không nhân tạo cách thủy phân liên kết α-1, 4-glucan tinh bột , polysaccharide glucogen để tạo đơn vị maltose liên tiếp xúc tác b-amylase có cấu hình β Vì khơng thể phân cắt liên kết nhánh polysaccharide phân nhánh glycogen amylopectin, nên thủy phân khơng hồn tồn đơn vị dextrin β-amylase diện phổ biến thực vật bậc cao, đặc biệt hạt nảy mầm vd: hạt ngũ cốc nảy mầm - Ở ngũ cốc, b-amylase tham gia vào phân giải tinh bột trình nảy mầm hạt - Ở lúa, b-amylase tổng hợp hạt suốt trình nảy mầm hạt nhiên hạt khơ khơng tổng hợp - Ở lúa mạch, hạt khô enzym tích lũy suốt q trình phát triển hạt, chủ yếu liên kết với tinh bột hạt Khi dạng liên kết, enzym phân tử có trọng lượng phân tử 64kDa bị phân cắt protease phóng thích dạng tự có trọng lượng phân tử 59kDa Maltose nguyên nhân tạo vị trái q trình β-Amylase phân giải tinh bột (pH tối ưu khoảng 4,0 đến 5,5) β- Amylase sử dụng cho ứng dụng khác nghiên cứu công nghiệp Nó sử dụng để nghiên cứu cấu trúc phân tử tinh bột glycogen sản xuất nhiều phương pháp khác Trong cơng nghiệp, sử dụng để lên men, sản xuất bia chưng cất Ngồi cịn sử dụng để sản xuất xi-rơ có hàm lượng maltose cao Đặc tính: - Mầm lúa mạch có a-amylase B-amylase - B-amylase bền với acid chịu nhiệt a-amylase B-amylase nhiệt độ 70°C bị bất hoạt (nhiệt độ hoạt động tối thích 55°C, pH 5,15,5) - B-amylase khơng bền có Ca2+, b-amylase bị kìm hãm Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iodin, ozon - B-amylase albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm -COOH vòng imidazol gốc histidine enzym ngoại bào (exoenzym) Cơ chế: b-amylase exoamylase (enzyme ngoại bào) Các nhánh chất tiến trình phân giải đầu khơng khử B-amylase phân cắt liên kết a-1,4 glucoside gặp liên kết a-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết (a-1,6 glucoside ngừng tác dụng Phần polysaccharide lại gọi B-dextrin dextrin phân tử lớn có chứa nhiều liên kết a-1,6 glucoside hình chế tác động B-amylase lên tinh bột ( Nguyễn Đức Lượng t159) Tác dụng B-amylase lên tinh bột sau: Tinh bột -> maltose (54-58%) + B-dextrin (42-46%) (glucogen) Tinh bột bị thủy phân đến 95% trường hợp a b-amylase thuỷ phân đồng thời B-amylase trình thuỷ phân tinh bột: - B-amylase phân giải 100% amylose thành maltose - B-amylase phân giải 54-58% amylopectin thành maltose - B-amylase phân huỷ mạnh hồ tinh bột ngược lại không thủy phân hạt tinh bột nguyên vẹn 3.3.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) γ-amylase phân cắt liên kết glycosidic α (1-6), ngồi cịn phân cắt liên kết glycosidic tận α (1-4) đầu không nhân tạo amylose amylopectin, không giống dạng amylase khác, tạo glucose γ-amylase hoạt động mạnh mơi trường axit có độ pH tối ưu Tên gọi khác: a-1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka-amylase B; γ -amylase; maltulase, glucoamylase enzym ngoại bào Glucoamylase có khả thủy phân liên kết a-1,4 lẫn a-1,6 glucoside, ngồi thủy phân liên kết a-1,2 a-1,3 glucoside Khi thủy phân liên kết a-1,4-glucan chuỗi polysaccharide, tách phân tử glucose khỏi đầu không khử mạch để tạo glucose Ở nhiệt độ 50°C pH 3,5-5,5 glucoamylase có hoạt lực cao nhất, bền rượu acetone không bảo vệ Ca2+ lại bền với acid a-amylase Tinh bột, panose, glucogen, dextrin, isomaltose, maltose amylopectin hoàn toàn bị thuỷ phân glucoamylase thành glucose mà khơng cần có góp mặt khác enzyme khác Glucoamylase thủy giải polysaccharide có phân tử lớn nhanh so với chất có phân tử nhỏ Các polysaccharide có nhánh amylopectin, glucogen, B-dextrin bị gluoamylase thủy phân nhanh d Oligo-1,6-glucosidase hay dextrinage tới hạn Trong isomaltose, panose dextrin tới hạn, Oligo-1,6-glucosidase thuỷ phân liên kết a-1,6-glucoside thành đường lên men Hoạt động dextrinase mạnh điều kiện tốt thích 40°C độ pH tối ưu 5,1 Hệ dextrinase hạt ngũ cốc nảy mầm đại mạch, thóc nảy mầm có amylopectin 1,6-glucosidase hay R-enzym dextrin-1,6-glucosidase hay amylo-1,6glucosidase hay dextrin- 6-glucanhydrolase Trong trình thuỷ phân dịch thuỷ phân có nhiều maltose enzym thủy phân dextrin triệt để so với a b-amylase 3.4 Cơ chất enzyme amylase 3.4.1 Tinh bột Tinh bột thực vật xem chất dự trữ lượng quan trọng có chủ yếu loại củ khoai lang, khoai tây, khoai mì, loại ngũ cốc, loại hạt Tinh bột polysaccharide bao gồm hai loại: amylose amylopectin Amylose chiếm 20-25% phân tử tinh bột chuỗi tuyến tính gồm đơn vị glucose kết nối với liên kết α-1, 4-glycosidic tạo thành mạch xoăn dài không phân nhánh Amylopectin chiếm 75-80% tinh bột, đặc trưng chuỗi phân nhánh từ đơn vị glucose liên kết liên kết α- 1, 4-glycosidic α-1, glycosidic tạo thành mạch có nhiều nhánh Tùy vào nhiệt độ, nguồn gốc, điều kiện thuỷ phân mà thành phần dịch thuỷ phân thu sau thuỷ phân tinh bột có thay đổi pH tối ưu cho hoạt động tìm thấy 7,0 Hiện tượng hồ tinh bột tinh bột không tan nước lạnh hỗn dịch tinh bột đun 60-85°C Sự phân cắt liên kết glucoside làm xuất hiện tượng tinh bột bị thủy phân tác động enzyme amylase xảy theo hai mức độ: dịch hóa đường hóa Sản phẩm trung gian dịch hóa dextrin tiếp tục đường hóa sản phẩm maltose glucose 3.4.2 Đường (glycogen) Là loại carbohydrate dự trữ thể động vật chuyển hóa thành lượng để phục vụ cho nhu cầu thể Ở tế bào vi sinh vật động vật, amylase khơng thể thiếu giúp chuyển hóa glucid Ở người động vật, glycogen tập trung chủ yếu gan dễ tan nước, carbohydrate nạp nhiều thể chuyển hóa chúng thành chất béo để dự trữ 3.4 Phương pháp thu nhận enzyme amylase Alpha-amylase, dạng amylase với vị trí liên kết carbohydrate thứ cấp, loại enzyme quan trọng suốt thời kỳ sinh trưởng vịng đời hạt kín Trong lúa, isozyme alpha-amylase quan trọng hình thành hạt tinh bột dự trữ trình trưởng thành thúc đẩy tinh bột dự trữ để nuôi dưỡng phát triển trình nảy mầm, điều ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển suất Alpha-amylase chưa nghiên cứu nhiều để hiểu phân loại, cấu trúc, đặc điểm biểu quy định biểu lúa trồng khác Trong số 10 alpha-amylase lúa, hầu hết biểu độc quyền phôi hạt phát triển gây trình nảy mầm hạt Trong trình nảy mầm hạt lúa, biểu gen alpha-amylase biết điều chỉnh tiêu cực đường phơi, nhiên lại tích cực gibberellin (GA) nội nhũ thông qua liên kết cạnh tranh với vùng promoter cụ thể; bên cạnh đó, cịn kiểm sốt loạt yếu tố phi sinh học sinh học khác, chẳng hạn độ mặn Trong đánh giá này, giới thiệu tổng quan tiến độ nghiên cứu alpha-amylase, tập trung vào nảy mầm hạt phản ánh cách thức hoạt động chuyên sâu làm sáng tỏ quy định tạo điều kiện cho việc nhân giống trồng dấu ấn sinh học hiệu 1 Sự trưởng thành hạt lúa bảo quản tinh bột Gạo lương thực nửa dân số giới (www.fao.org) Hạt gạo làm giàu với tinh bột, protein lipid Trong trình trưởng thành hạt lúa, thụ tinh kép tạo phôi lưỡng bội nội nhũ tam bội nhiều tinh bột, phôi gồm trục phôi bao quanh mầm gọi mầm Mơ phân sinh đỉnh chồi phơi phân hóa ba ngày sau thụ tinh (DAF) nguyên sinh xuất 5–8 DAF; đó, thành tế bào nội nhũ hình thành 3–4 DAF, q trình phân hóa tế bào nội nhũ q trình sinh sản hồn thành khoảng 6–10 DAF; quan hạt to trưởng thành 11–20 DAF nội nhũ tích lũy chất dự trữ sau hạt kích hoạt q trình hút ẩm khoảng 30 DAF (Hình 1A) Kết có phơi aleurone cịn sống hạt trưởng thành Hạt gạo hấp thụ khoảng 30% cacbohydrat từ cacbohydrat khơng cấu trúc bẹ thân trước nhóm thay cacbon đồng hóa quang sau nhóm [2,3] Một mối quan hệ rõ ràng tìm thấy hoạt động enzym alpha-amylase (EC 3.2.1.1) hàm lượng tinh bột bẹ sau xử lý với hoạt tính phù hợp với mức độ phân giải tinh bột [2] Hoạt tính biểu alpha-amylase cao phát hạt phấn có kích thích nhiệt độ cao [4] Tinh bột tích tụ nội nhũ dạng hai đồng phân d-glucose bao gồm amylose có α-1,4-glucan mạch thẳng amylopectin với nhánh liên kết α-1,6 glucan [5,6] Một số enzym tham gia vào trình tổng hợp tinh bột hạt gạo, bao gồm sucrose ADPglucose pyrophosphorylase, phosphoglumutase, tinh bột tổng hợp, enzym phân nhánh tinh bột enzym phân nhánh tinh bột Tinh bột xuất dạng tinh bột hòa tan, sucrose dẫn xuất sucrose fructosyl-oligosaccharides (fructan), tinh bột không hòa tan Trong giai đoạn đầu phát triển hạt, tinh bột cacbohydrat hịa tan nước lưu trữ [7] Trong loài ngũ cốc nhiệt đới thiếu enzym tích tụ fructan [8], tích tụ tinh bột xảy dạng hạt tinh bột khơng hịa tan Hạt tinh bột có chất suốt phân loại hạt tinh bột đơn giản phức hợp Hạt tinh bột hình thành amyloplast, bào quan có màng kép liên kết với tham gia vào trình tổng hợp lưu trữ tinh bột [9] Các hạt tinh bột phức hợp tập hợp hạt tinh bột nhỏ thành hạt 10–20 µm [10,11] Tinh bột tích lũy hạt chín trang bị cho chúng chất đủ để hạt nảy mầm Sự nảy mầm hạt Sự nảy mầm hạt trình quan trọng đảm bảo liên tục sống thực vật phụ thuộc vào phương thức nhân giống độc quyền [12] Sự nảy mầm hạt giống hiệu dẫn đến phát triển mạnh mẽ khỏe mạnh, với có khả chống chọi với áp lực sinh học phi sinh học phát triển thành trồng suất cao [13] Sự nảy mầm hạt (Hình 1B) địi hỏi điều kiện mơi trường thuận lợi, bao gồm nước, oxy nhiệt độ [14], kết hợp nhiều trình tế bào, chẳng hạn tổng hợp, vận chuyển, tín hiệu, cảm nhận thủy phân Sự nảy mầm bắt đầu xâm nhập nước kết thúc nhô lớp xơ mềm mầm [12] Sự xâm nhập hạt giống lúa trình ba pha với giai đoạn (I) đặc trưng hấp thụ nước nhanh chóng sửa chữa DNA (khoảng 0–24 sau xâm nhập, HAI) [15,16], giai đoạn cố định (II) đặc trưng cách tổng hợp ty thể [17] dịch mã mRNA dự trữ (24–48 HAI) [18], gia tăng hấp thu nước cuối cùng, xảy sau trục phôi khỏi cấu trúc xung quanh (48–72 HAI, giai đoạn III ) [12,19] (Hình A) Hạt khơ n tĩnh nhanh chóng tiếp tục hoạt động trao đổi chất bị xâm nhập, dẫn đến suy thoái đại phân tử lưu trữ nội nhũ, đó, cung cấp lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho phơi để hình thành Trong trình nảy mầm hạt lúa, sucrose nhanh chóng tiêu thụ trục phơi phát triển Phôi khô dự trữ carbohydrate dạng đường sucrose mơ chồi tiêu thụ lượng đường sucrose có phơi lớn [22] Phơi khơ chứa hạt tinh bột đường phôi hấp thụ chuyển đổi tạm thời thành tinh bột Khoảng 24–36 sau xâm nhập, nhiều hạt lớn tích tụ xung quanh mô mạch, lớp vỏ biểu mô [22], làm cho giai đoạn II có lẽ giai đoạn quan trọng trình nảy mầm hạt lúa Cơ chế mà đường hòa tan vận chuyển đến phôi từ nguồn dự trữ bị phân hủy nội nhũ chưa biết rõ, nhiên cần phải có liên lạc, vận chuyển tín hiệu thường xun phơi nội nhũ, tất nhằm mục đích thiết lập nảy mầm thành công Ở đại mạch, chất vận chuyển peptit đề xuất thuộc tính tương tác hai chiều [23,24] Nguồn lượng cho nảy mầm hạt hình thành phân hủy tinh bột dự trữ nội nhũ Q trình thủy phân hồn tồn tinh bột đạt nhờ hoạt động kết hợp α-amylase, β-amylase, enzyme khử nhánh αglucosidase Alpha-amylase (1,4-α-d-glucan maltohydrolase) canxi metalloenzyme hoạt động vị trí ngẫu nhiên dọc theo chuỗi tinh bột tạo α-maltose α-glucose [25], β- amylase (1, 4-α-d-glucan maltohydrolase) hoạt động từ đầu không khử tinh bột thủy phân liên kết α-1,4 glycosidic thứ hai phân cắt đơn vị maltose [26] Alpha-amylase tổng hợp de novo trình nảy mầm hạt với diện GA nội sinh (gibberellic acid) từ phôi [27] Ngược lại, β-amylase diện trước nảy mầm dạng khơng hoạt động mà khơng có kiểm sốt GA [26], kích hoạt hoạt động protease phân cắt đầu tận cacboxyl [6,27,28] Tổng hợp β-amylase xảy lớp aleurone, alpha- amylase xảy lớp aleurone lớp biểu mô Trong nghiên cứu trước chúng tôi, phát alphaamylase (amylase1A) phôi hạt lúa chứng minh mức độ protein mRNA tăng đáng kể đạt đỉnh 48 HAI trình nảy mầm [29], ngồi đáp ứng với phytohormone, xác định biến đổi hạt tinh bột hạt lúa nảy mầm 3.4.1 Phương pháp thu nhận malt malt đại mạch malt thóc 3.4.2 Phương pháp tinh a Tinh enzyme amylase bắng phương pháp sắc ký Hạt lúa cho hút ẩm ủ tối 30°C ngày Hạt nảy mầm đồng hóa máy trộn polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCI 50mM (pH 8,5) (dung dịch đệm A) Sản phẩm đồng hóa ép qua hai lớp lưới nylon dịch lọc thô đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng 20 phút Phần xem nhu dịch enzym thô Dịch enzym thô cho kết tủa với (NH.)SO (25- 60%) Phần kết tủa thu đem hòa tan 10ml dung dịch đệm A ly tâm với tốc độ 15.000 vòng 20 phút Sau sử dụng phương pháp thẩm tích phần dung dịch đệm A thi cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 (Whatman) cân dung dịch đệm A; enzyme tách NaCI nồng độ 0-0,5M Dung dịch thẩm tích lơi qua cột CHA (ancyclodextrin), cột đặc biệt sử dụng để lôi amylase Các phân đoạn qua cột thu chuyển qua 12 sắc ký cột superose b.Thu nhận enyme amylase phương pháp điện di gel polyacrylamide Hạt lúa ngâm nước ủ cho nảy mầm Sau 14 ngày, mầm xay nhuyễn với đệm Tris -HCl 0,005M (pH 8,0) Tỷ lệ mô đệm 1:2 (trọng lượng/ thể tích) Hỗn hợp sau đồng hóa ly tâm với tốc độ 10.000ppm 15 phút nhiệt độ độ C Phần chuyển sang ống ly tâm khác xem dịch enzyme Gel chuẩn bị sẵn sàng đưa vào điện di với cường độ dịng điện 70V Sau hồn tất việc chạy điện di, gel đưa nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định diện amylase 3.4.3 Lên men trạng thái rắn 3.4.4 Lên men chìm 3.5 Các yếu tố ảnh hưởng 3.5.1 pH môi trường 3.5.2 Nhiệt độ ion kim loại 3.5.3 Độ ẩm 3.6 Ứng dụng enzyme amylase Là hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xác tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nước, thường sử dụng để thủy phân tinh bột - Enzyme amylase phát góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Chế phẩm amylase dùng phổ biến số lãnh vực cơng nghiệp thực phẩm sản xuất bánh mì, glucose, rượu, bia,… - Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase làm thay đổi hoàn toàn chất lượng bánh mì hương vị, màu sắc, độ xốp,… chế phẩm amylase cho chất lượng bánh mì tốt dạng phức hợp với protease - Trong sản xuất bánh kẹo, maltose sản phẩm thủy phân tinh bột amylase glucose glucoamylase Chính glucoamylase yếu tố làm tăng hiệu suất alpha amylase - Trong sản xuất rượu, bia việc sử dụng amylase có hạt nẩy mầm thay malt góp phần đáng kể việc giảm giá thành - Enzyme amylase tìm thấy nhiều nguồn khác amylase từ thực vật động vật, mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắm nảy mầm hay từ nấm mốc,… nguyên liệu cho sản xuất gạo, bắp, khoai mì… ngun liệu dễ tìm, rẻ dễ dàng tìm thấy Việt Nam Do đó, lợi hướng phát triển mạnh làm sở cho nhiều ngành khác phát triển 3.6.1 Quá trình thuỷ phân tinh bột +Trong ngành cơng nghiệp tinh bột: Amylase chuyển hóa tinh bột thành glucose loại siro khác Amylase enzyme quan trọng để tiêu hóa hấp thụ tinh bột Thêm amylase vào thức ăn cải thiện q trình tiêu hóa hấp thụ tinh bột động vật, cải thiện hiệu suất sản xuất tăng khả sử dụng thức ăn 3.6.2 Enzyme amylase sản xuất bia cồn Trong ngành công nghiệp sản xuất rượu bia (tham gia vào giai đoạn đường hóa tinh bột): Amylase sử dụng q trình đường hóa tinh bột thành maltose, glucose, dùng làm chất cần thiết cho tiến trình lên men bia; Trong sản xuất bia, việc sử dụng amylase có hạt nảy mầm thay malt góp phần đáng kể việc giảm giá thành 6.3 Enzyme amylase sản xuất bánh mì + Trong sản suất bánh kẹo, bánh mỳ,… Quá trình sản xuất bánh kẹo sử dụng nhiều nguyên liệu có chứa enzyme amylase Trong nướng bánh, chúng xúc tác phân hủy tinh bột bột thành đường đặc biệt sản xuất bột bánh quy nhờ enzyme amylase mà bánh quy có mùi, vị, màu hấp dẫn Nguyên liệu amylase thường bổ sung trình làm bánh mì để giúp bánh có kết cấu tốt hơn, màu sắc hương vị hấp dẫn Các nghiên cứu thực tế cho thấy sản phẩm cải thiện rõ rệt cấu trúc, thể tích độ cứng bổ sung thêm nguyên liệu phụ gia có chứa amylase 3.6.4 Enzyme amylase chế biến bột 3.6.5 Một số ứng dụng khác Trong ngành công nghiệp sản xuất rượu bia: Amylase sử dụng q trình đường hóa tinh bột thành maltose, glucose, dùng làm chất cần thiết cho tiến trình lên men bia Trong sản xuất tương, mạch nha, mật, đường glucose Amylase thủy phân tinh bột ứng dụng sản xuất cơm rượu, làm thức ăn cho gia súc để bổ sung chất dinh dưỡng Ứng dụng sản xuất bánh mì, làm cho bánh nở xốp, thơm ngon Trong ngành dệt may, enzyme amylase dùng để rũ hồ vải, tẩy lớp hồ bột bề mặt vã, giúp vải mềm mịn, dễ tẩy trắng, dễ bắt màu q trình nhuộm Ứng dụng cơng nghiệp sản xuất dược phẩm Ứng dụng ngành chế biến bột Đóng vai trị chất xúc tác, giúp cho q trình tiêu hóa hấp thu tinh bột ruột non diễn dễ dàng Tài liệu tham khảo Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương Phan Thị Huyền Công nghệ enzyme, (2004) NXB Đại học Quốc gia Thành phố Cần Thơ Hồ Chí Minh Ứng dụng enzyme amylase công nghiệp Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh H Taniguchi, Y Honnda, in Encyclopedia of Microbiology (Third Edition), (2009) P Williams, in Encyclopedia of Analytical Science (Second Edition), 200 Ajita Sundarram, and Thirupathihalli Pandurangappa Krishna Murthy, “α-Amylase Production and Applications: A Review.” Journal of Applied & Environmental Microbiology, vol 2, no (2014): 166-175 Ritu Saini, Harnek Singh Saini and Anjali Dahiya, “Amylase: Characteristics and industrial applications” Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2017;6(4): 18651871 ... protein Enzym: enzym amylase: enzym oxy hóa khử, a-amylase β-amylase , protease số khác Trong trình nảy mầm enzym hoạt động mạnh tăng cao thúc đẩy cho phản ứng sinh-lý-hóa với sinh tổng hợp loại enzym... chọn lọc, hai sử dụng enzyme amylase tái tổ hợp tạo vi sinh vật sử dụng trình lên men chìm lên men trạng thái rắn Enzyme amylase có ứng dụng tiềm đa dạng chiếm khoảng 30% sản lượng enzyme giới Một... Các yếu tố ảnh hưởng 3.5 .1 pH môi trường 3.5.2 Nhiệt độ ion kim loại 3.5.3 Độ ẩm 3.6 Ứng dụng enzyme amylase Là hệ enzyme phổ biến giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xác tác