BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤTBÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT
SỞ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG THCS – THPT ĐINH THIỆN LÝ BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM TRỊ MỤN CHIẾT XUẤT TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT Lĩnh vực nghiên cứu Hóa – sinh Người thực hiện: Phạm Phương Thảo Đỗ Lê Hoàng Người hướng dẫn khoa học: Nguyễn Hoài Phương THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG NĂM 2018 LỜI CẢM ƠN Thầy Nguyễn Hồi Phương, giáo viên mơn hỗ trợ suốt trình thực dự án Thầy Lê Thành Vĩnh giáo viên tổ Hóa - Sinh trường Đinh Thiện Lí hướng dẫn đề tài có đường đắn Chân thành cám ơn Tiến sĩ Bùi lan Anh, giảng viên trưởng Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, thầy Trần Quốc Tân - nghiên cứu viên Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, nhiệt tình hỗ trợ nhóm dụng cụ giúp đỡ hướng dẫn thực thao tác nuôi cấy vi khuẩn thử hoạt tính cao Xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP.HCM hỗ trợ hóa chất, thiết bị phịng thí nghiệm để nhóm thực đề tài MỤC LỤC Chương 1: Mở đầu 1.1 Mục đích nghiên cứu 1.2 Nhiệm vụ đề tài 1.3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 4 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Giả thuyết khoa học Chương 2: Tổng quan nghiên cứu 2.1 Cơ sở thực tiễn 2.1.1 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học vỏ măng cụt 2.1.2 Sáp ong 2.1.3 Vaselin 2.2 Cơ sở lý luận Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 3.1 Nguyên liệu dụng cụ 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp chiết cao 3.2.2 Khảo sát diện α-mangostin cao phân đoạn 3.2.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn mụn 3.3 Điều chế sản phẩm 7 7 Chương 4: Kết nghiên cứu thảo luận 10 Chương 5: Kết luận kiến nghị 13 Phụ lục - Tài liệu tham khảo 14 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Mục đích nghiên cứu Măng cụt loại trái nhiệt đới phổ biến Đông Nam Á Việt Nam Phần ruột măng cụt loại thực phẩm giàu dinh dưỡng với hương vị thơm ngọt, phần vỏ măng cụt với nhiều hoạt tính sinh học thường bị bỏ phí Các nghiên cứu cho thấy vỏ măng cụt chứa nhiều xanthone mà đặc biệt α-mangostin có khả kháng khuẩn, hoạt tính kháng sinh, kháng dị ứng, kháng oxy hóa, kháng nấm, Hiện có Thái Lan có sản phẩm kem trị mụn chiết xuất từ măng cụt, Việt Nam chưa có sản phẩm cơng trình nghiên cứu ứng dụng chiết xuất từ vỏ măng cụt điều trị mụn Các chế phẩm kem bôi đặc trị mụn chủ yếu có nguồn gốc hóa học với thành phần lưu huỳnh, benzoyl peroxide Các hoạt tính kháng khuẩn, kháng sinh, chốn oxy hóa kháng viêm vỏ măng cụt có tiềm việc điều trị mụn Do đó, nhóm thực đề tài đề nghị hướng nghiên cứu sử dụng vỏ măng cụt cách hiệu để làm chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên giúp hỗ trợ điều trị mụn tận dụng nguồn vỏ măng cụt bị bỏ phí 1.2 Nhiệm vụ đề tài Nhiệm vụ 1: Điều chế cao thô cao phân đoạn từ măng cụt khô Nhiệm vụ : Thử nghiệm khả kháng khuẩn cao chiết Nhiệm vụ : Tạo chế phẩm cuối - kem bôi trị mụn 1.3 Đối tượng nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm trị mụn chiết xuất từ vỏ măng cụt 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Chiết xuất thô từ vỏ măng cụt Cách điều chế chế phẩm trị mụn từ vỏ măng cụt Khả diệt khuẩn mụn 1.4 Giả thuyết khoa học Cao chiết từ vỏ măng cụt có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi nguồn nguyên liệu tiềm để điều chế chế phẩm trị mụn hiệu an tồn lành tính với da CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở thực tiễn 2.1.1 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học chuối 2.2 Cơ sở lý luận Các xanthone vỏ có khả chống oxy hóa tốt, giúp cho da khỏe đẹp Khả kháng vi khuẩn xanthone giúp tiêu diệt vi khuẩn gây mụn Ngồi ra, xanthone chất có từ thiên nhiên, chất nhân tạo hay kháng sinh, sản phẩm gây mụn người tiêu dùng tin tưởng hơn, đặc biệt khách hàng châu Á lịch sử sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên lâu đời Sáp ong lựa chọn phù hợp để tạo sản phẩm cuối cơng dụng hữu ích, dễ tiếp cận phù hợp với thời gian làm đề tài Vaseline giữ cho hỗn hợp cao sáp ong không bị khô, khơng ảnh hưởng tới q trình thử hoạt tính khơng có khả kháng khuẩn CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu dụng cụ 3.1.1 Thu mẫu, xử lý mẫu Măng cụt mua chợ (có nguồn gốc từ Long Khánh, Việt Nam) chọn trái nhỏ, chín, vỏ màu tím Vỏ lấy sau tiêu thụ phần ruột (2,5 Kg vỏ quả) Vỏ sau thu thập miếng nhỏ vỏ quả, 2- cm phơi bóng râm vài ngày (03 - 05 ngày) , đến vỏ trở nên khơ hồn tồn cứng Sau xay thành bột (1 kg) Hình Quả măng cụt 3.1.2 Hóa chất Các hóa chất chiết sử dụng dung môi tinh khiết hãng Chemsol Sắc ký lớp mỏng dùng bảng mỏng Silica gel Merck Môi trường ni vi khuẩn Lysogeny Broth Chuẩn định tính α-mangostin cung cấp Phịng thí nghiệm hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp chiết cao (Cao thô, cao phân đoạn) Bột vỏ măng cụt ngâm dầm với ethanol Sau 24 dịch chiết lọc tiến hành đuổi dung môi áp suất giảm, thu cao ethanol thơ Sau đó, cao ethanol thô phần tán vào nước chiết lỏng lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần (n-hexane ethyl acetate) Đuổi dung môi thu cao tương ứng Chiết lỏng lỏng cách cho cao thô phân tán nước vào chai thủy tinh (khoảng 250 mL), cho tiếp dung môi cần chiết (mỗi lần khoảng 50mL), khuấy từ với tốc độ 100 rpm 15 phút để hỗn hợp khuấy trộn Sau ngừng khuấy, để yên cho chất lỏng tách lớp, hút lấy phần dung môi hữu 3.2.2 Khảo sát diện α-mangostin cao phân đoạn Tiến hành sắc ký lớp mỏng: chấm đồng thời cao phân đoạn chất chuẩn αmangostin để tìm phân đoạn có chứa nhiều α-mangostin với hệ dung môi giải li hexane ethyl acetate 70:30 Cao chiết phân đoạn chất chuẩn hoàn tan methanol Chấm 10 µL dung dịch lên lớp mỏng Sau dung dịch lên vạch mốc, lấy để bay dung môi Hiện vết với dung dung dịch axit sunfuric 10% ethanol, sấy 110 oC đến vết (1) (2) (3) (4) Hình (5) (1) Quá trình chiết lỏng lỏng (2) Dịch hexane sau chiết lỏng lỏng (3) Dịch ethyl acetate sau chiết lỏng lỏng (4) Cao hexane (5) Cao ethyl acetate 3.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn mụn cao phân đoạn Propionibacterium acnes, hay P.Acnes hay Cutibacterium acnes, sống da đóng vai trò lớn việc giúp cho da khỏe mạnh Mặc dù vậy, P.Acnes mầm bệnh tiềm gây mụn 3.2.3.1 Nuôi cấy Nhân mụn lấy từ tình nguyện viên (da mặt làm với nước, lau bên vùng da lấy mụn cồn 70 o, dụng cụ lấy nhân mụn sát khuẩn ồn 70o hơ nóng) sau pha loãng với nước muối sinh lý (dung dịch NaCl 0,9 %) Dùng pipet lấy mL dịch vi sinh vật độ pha loãng 1/100 vào ống nghiệm 10 mL nước muối vô trùng, lắc tay, dung dịch có độ pha lỗng 1/1000 Tiếp tục làm với ống ta dịch có nồng độ thấp dần Bỏ dịch vào lọ chứa môi trường LB lỏng Vi khuẩn sau hoạt hóa cấy trải lên đĩa petri chứa mơi trường LBagar trải mỏng 3.2.3.2 Thử hoạt tính với vi khuẩn ni Hịa tan cao chiết methanol với nồng độ 10mg/50µL: Cao Ethyl Acetate: 2.045g/1mL methanol Cao Hexane: 2.013g/1mL methanol Chứng dương: Kanamycin Thực mẫu chứng âm gồm mẫu nước mẫu methanol Mẫu thử cao ethyl acetat cao hexan Các dung dịch nhỏ vào giếng 50 µL tương đương 10 mg hoạt chất (Kanamycin/ cao ethyl acetat khô/ cao hexan khô) 3.2.3 Điều chế sản phẩm trị mụn Chiết xuất phân đoạn có hàm lượng cao α-mangostin sấy khơ nghiền mịn sau trộn với sáp ong vaselin Khảo sát tỉ lệ vaselin sáp ong để thu hỗn hợp có độ mềm mịn phù hợp CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát cao phân đoạn chứa α-mangostin Kết sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn ethyl acetat, cao hexan mẫu chuẩn với hệ dung môi Acetone - Ete dầu hỏa tỉ lệ 3:7 cho thấy: - Trong cao hexane xuất số vết phân cực mà không diện sắc - ký đồ cao ethyl acetate Vết α-mangostin diện cao hexan cao ethyl acetate Kết cho thấy cao ethyl acetate diện α-mangostin có cao hexane, trình khuấy chưa chiết kiệt hết α-mangostin Mặc dù vậy, nhóm nhận thấy chất phân cực khác cao Hexane lại không diện cao ethyl acetate, chứng tỏ chất ɑ-mangostin khó tan khơng thể chiết kiệt Vì vậy, nhóm định thử hoạt tính hai cao để tìm cao tốt α-mangostin (1) (2) (3) (1) cao ethyl acetate (2) cao hexane (3) α-mangostin Hình Sắc ký lớp mỏng cao chiết từ vỏ măng cụt 4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết Kết thử kháng khuẩn trình bày bảng sau Cao chiết Chứng âm Nước Methanol Chứng dương kanamycin Cao hexane Cao ethyl acetate Vòng kháng khuẩn (mm) Trung bình 0 11,5 6,0 4,5 5,0 5,0 6,0 12,5 9,5 12,5 9,5 10,0 11,5 5,3 ± 0,8 10,8 ± 1,7 Hình Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết E: cao ethyl acetate H: Cao hexane N: Nước M: methanol (+) chứng dương 4.3 Khảo sát tỉ lệ sáp ong vaselin Sau điều chế cao trộn với sáp ong (tỉ lệ 1:10 sáp ong:cao), đun cách thủy hỗn hợp để sáp ong tan tạo hỗn hợp đồng Hỗn hợp sau khô lại đông rắn khó sử dụng Do đó, chúng tơi tiến hành thêm vào vaselin để tạo hỗn hợp mềm mịn Khảo sát khảo sát cao-sáp ong vaselin trình bày bảng sau: Tỉ lệ cao – sáp ong vaselin 1:1 1:2 1:3 1:5 1:8 : 10 Cảm quan Hỗn hợp màu vàng, khô cứng Hỗn hợp màu vàng, khô cứng Hỗn hợp màu vàng, khô cứng, mềm, khó bơi Hỗn hợp màu vàng, khơ cứng, mềm hơn, khó bơi Hỗn hợp màu vàng, mềm mịn, dễ bơi, khơng rít tay Hỗn hợp màu vàng, mềm, ướt, dễ bơi, khơng rít tay Từ Kết khảo sát định chọn tỉ lệ cao-sáp ong vaselin : để điều chế sản phẩm CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN Kết luận Đề tài nghiên cứu khảo sát trình chiết cao phân đoạn vỏ quà măng cụt Kết cho thấy α-mangostin nên cao hexan cao ethyl acetat có diện α-mangostin chất phân cực khác chiết kiệt với hexan Kết khảo sát khả kháng khuẩn gây mụn cho thấy cao chiết có khả diệt khuẩn mụn tốt đặc biệt cao ethyl acetat Sản phẩm thu trộn cao ethyl acetat – sáp ong (1 : 10) vaselin theo tỉ lệ : thu dạng kem mềm mịn, màu vàng, không bết dính rít tay dễ bơi sử dung Hướng nghiên cứu phát triển Khảo sát phương pháp SPE để chiết cao phân đoạn: thay đổi quy trình chiết để tăng nồng độ xanthone đặc biệt α-mangostin cách chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction): cao thô methanol hấp phụ với silica gel sau cho vào phễu Buchner, có hút chân khơng; giải ly với hexan để loại bỏ chất phân cực sau ethyl acetat hỗn hợp hexan - ethyl acetat để thu phân đoạn chứa nồng độ αmangostin cao Phân lập vi khuẩn định danh cụ thể để thu vi khuẩn P acnes vi khuẩn từ nhân mụn Khảo sát khả diệt khuẩn mụn sản phẩm thu để tìm tỉ lệ cao chết – sáp ong thích hợp Khảo sát điều kiện bảo quản tính an tồn với da sản phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Fabiola Gutierrez-Orozco, Mark L Failla (2013), biological Activities and Bioavailability of Mangosteen Xanthones: A Critical Review of the Current Evidence, Nutrients, 5, 31633183 Guoqing Chen, Yong Li, Wei Wang, Liping Deng (2018), Bioactivity and pharmacological Properties of α-mangostin from the mangosteen fruit: a review, Expert Opinion on Therapeutic Patents , 415 - 427 Human Metabolome Database (HMDB), sổ: Hexane, số HMDB0029600 (Cập nhật lần cuối: 20/5/2018) Ghi EPA Air Toxics hexane, (9/2016) Human Metabolome Database (HMDB), sổ: Ethyle Acetate, số HMBD0031217 (Cập nhật lần cuối: 20/5/2018) 04/2017 sapong.com.vn - Công ty SP Việt Nam sáp ong tự nhiên, sáp ong nguyên chất 10