Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu gama-aminobutyric axit (GABA) bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe đã trở thành một lĩnh vực rất triển vọng và nhận được sự quan tâm đặc biệt từ nhiều doanh nghiệp và tổ chức nghiên cứu. Nhiều hoạt chất sinh học từ nguồn thực vật, động vật và vi sinh vật đã được tìm hiểu, khai thác để tạo ra các sản phẩm không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh tật. Gama-Aminobutyric Axit (GABA) là một trong những hoạt chất sinh học nói trên. Các nhà khoa học đã phát hiện được vai trò và chức năng sinh lý của chất này trong điều tiết các chức năng tim mạch và tuần hoàn mạch máu não, ức chế dẫn truyền thần kinh, tăng cường trí nhớ, làm giảm các rối loạn tâm trạng và chống mất ngủ [14,22,23,30,39,107]. GABA tồn tại khá phổ biến trong tự nhiên kể cả thực vật, động vật và vi sinh vật, nhưng phong phú và đáng kể nhất là trong các thực phẩm lên men và trong một số loại cây trồng, bao gồm cả lá chè xanh [19,21,23,24,28,32]. Cơ chế hình thành GABA trong thực vật và vi sinh vật lên men đã được phát hiện và điều kiện môi trường là nguyên nhân làm cho sinh vật tăng cường sinh tổng hợp GABA [79,83,105]. Đây chính là ý tưởng để nghiên cứu sản xuất ra các loại sản phẩm giàu GABA từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn thiếu ô xy trong quá trình ngâm hạt nảy mầm, lên men chìm vi sinh vật trong môi trường yếm khí. Mặc dù GABA đã được tổng hợp bằng con đường hóa học, nhưng có nhiều hạn chế đáng kể, cho nên những sản phẩm GABA thương mại trên Thế giới hiện nay chỉ là những sản phẩm của công nghệ lên men vi sinh vật sau khi được tinh chế để có độ tinh khiết cao [143]. Các sản phẩm GABA thương mại phổ biến nhất chính là các thực phẩm và đồ uống giàu GABA được con người tạora do tác dụng của enzym có mặt trong vi sinh vật lên men hay hệ enzym có sẵn trong nông sản thực phẩm [144]. Các sản phẩm chè như chè xanh, chè đen, chè ô long, v.v đều được chế biến từ lá và búp của cây chè Camellia sinensis. Cây chè được trồng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam và người Việt rất ưa chuộng thưởng thức chè. Hiện nay Việt Nam chế biến và xuất khẩu chủ yếu là chè đen, trong khi ở trong nước người dân thích dùng chè xanh hơn. Chè chứa nhiều hợp chất hóa học chẳng hạn catechin, alkaloid, polysaccharid, axit amin, vitamin, khoáng, tinh dầu. Trong số đó, axit amin có vai trò đặc biệt quan trọng vì không những tạo ra hương vị của nước chè mà còn có rất nhiều lợi ích cho sức khỏe [1,5,9,17,22,23,34,35]. GABA chính là một axit amin tự do 4 carbon được tìm thấy đáng kể trong lá chè tươi và tất cả các sản phẩm chè [107]. GABA được tạo ra bởi quá trình decarboxy hóa axit L-glutamic được xúc tác bởi enzym glutamate decarboxylase (GAD). Tất cả các loại chè đều có chứa GABA với hàm lượng khác nhau và thường ở mức cao hơn một số nông sản thực phẩm khác, nhưng GABA cao hơn nhiều ở sản phẩm gọi là chè GABA hay chè Gabaron [107,121,127]. Sản phẩm này do Nhật Bản sản xuất bằng một kỹ thuật đặc biệt là lên men lá chè tươi trong khí nitơ. Sản phẩm chè này rất dễ uống như tất cả những sản phẩm chè truyền thống khác, rất có lợi cho sức khỏe và hoàn toàn không có tác dụng phụ [121]. Rất gần đây, các nhà khoa học chủ yếu ở Trung Quốc đã phát triển kỹ thuật tạo chè GABA bằng phương pháp lên men vi sinh vật. Nếu như các chủng nấm mốc Aspergillus là chủ đạo trong lên men sản xuất chè lên men Phổ Nhĩ thì các nhà khoa học Trung Quốc cho biết các chủng vi khuẩn Lactobacillus lên men lactic có khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp GABA trên chè [92,93,94,100,106,141]. Nhiều nghiên cứu sản xuất chè và nước chè giàu GABA theo hướng này với cơ chất bổ sung natri glutamat (SMG) đã được tiếnhành, tạo ra một xu hướng rất mới để làm tăng hàm lượng GABA trong chè [78,79,80,100]. Tại Việt Nam, trong thời gian qua đã có một số nghiên cứu và sản xuất thực phẩm giàu GABA như hạt nảy mầm, thực phẩm lên men giàu GABA [4,10,13,102]. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm GABA tinh khiết cao bằng phương pháp lên men cũng đã được tiến hành thăm dò [3]. Tuy nhiên, các nghiên cứu và sản xuất chè lên men và chè giàu GABA còn rất hạn chế, nhất là nghiên cứu về chè giàu GABA [5,6]. Nghiên cứu duy nhất do chính tác giả luận án chủ trì cũng mang tính chất thăm dò và chủ yếu có kết quả về chủng giống vi khuẩn và nguyên liệu chè [12]. Nhiệm vụ nghiên cứu sản xuất chè giàu GABA ở Việt Nam là vấn đề rất mới, còn nhiều lý luận và thực tiễn cần tìm tòi và thực hiện, nhưng sẽ có giá trị rất đáng kể vì khai thác được tiềm năng nguyên liệu, sở thích tiêu dùng, trong khi tạo ra được sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu ẩm thực và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Trên cơ sở những dẫn liệu đã nêu ở trên, nghiên cứu sinh đã xác định nhiệm vụ của luận án là “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu gamaaminobutyric axit (GABA) bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam”. 2. Mục tiêu luận án Xác định và thiết lập được một số thông số của quá trình cải tiến hệ thống chế biến chè đen Việt Nam thành chè đen giàu GABA, bao gồm các chủng giống vi khuẩn Lactobacillus thúc đẩy sinh tổng hợp GABA, các giống chè thích hợp, xác định và tối ưu hóa các thông số về qui trình lên men yếm khí có và không có bổ sung vi khuẩn, sản xuất thử thành công ở quy mô thực nghiệm tạo chè đen giàu GABA có chất lượng cảm quan tốt và thương mại hóa được.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH NGUYỄN VIỆT TẤN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ ĐEN GIÀU GAMA AMINOBUTYRIC ACID BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN TỪ MỘT SỐ GIỐNG CHÈ VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÀ NỘI - 10/2022 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt viii Danh mục bảng xii Danh mục hình xv MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chè, thành phần, hoạt tính sinh học sản phẩm 1.1.1 Giới thiệu chung chè 1.1.2 Thành phần hóa học chè tươi 1.1.3 Hoạt tính sinh học tác dụng chè sức khỏe 11 1.1.4 Các sản phẩm chè khác biệt cơng nghệ tính chất 13 1.2 Tổng quan gama-aminobutyric axit (GABA) 15 1.2.1 Giới thiệu chung GABA 15 1.2.2 Hóa học, phân bố tự nhiên chuyển hóa GABA 16 1.2.3 Vai trò ứng dụng GABA 18 1.2.4 Sản xuất sản phẩm GABA thương mại 21 1.2.5 Tình trạng pháp lý GABA liều lượng sử dụng 22 1.3 Chế biến chè giàu GABA lên men vi sinh vật 24 1.3.1 Thực phẩm giàu GABA lên men vi sinh vật 24 1.3.2 Chè lên men vi sinh vật 27 1.3.3 Chè giàu GABA lên men vi sinh vật 30 1.4 Chế biến chè giàu GABA lên men yếm khí 32 1.4.1 Sự chuyển hóa GABA thực vật chè 32 1.4.2 Cơng nghệ lên men yếm khí đặc điểm chè giàu GABA 33 iii 1.4.3 Lợi ích chè giàu GABA 37 1.5 Một số nghiên cứu thực phẩm chè giàu GABA Việt Nam 38 1.5.1 Thực phẩm giàu GABA lên men vi sinh vật 38 1.5.2 Thực phẩm giàu GABA từ hạt nảy mầm 39 1.5.3 Chế biến chè lên men chè giàu GABA Việt Nam 40 1.6 Kết luận từ tổng quan giả thuyết nghiên cứu 41 1.6.1 Những kết luận rút từ tổng quan 41 1.6.2 Những định hướng giả thuyết nghiên cứu luận án 43 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 45 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 45 2.1.2 Hóa chất môi trường nuôi cấy vi sinh vật 45 2.1.3 Thiết bị phân tích thiết bị công nghệ 47 2.2 Kỹ thuật công nghệ để nghiên cứu chế biến chè 47 2.2.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ để nghiên cứu lên men chè 47 2.2.2 Kỹ thuật làm héo, vò sấy chè 47 2.2.3 Kỹ thuật tạo mơi trường yếm khí 48 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 49 2.3.1 Các thí nghiệm lựa chọn chủng giống vi sinh vật chè thích hợp 49 2.3.2 Các thí nghiệm xác định tác dụng lên men yếm khí 51 2.3.3 Các thí nghiệm xác định tác dụng lên men yếm khí kết hợp lên men lactic 53 2.3.4 Các thử nghiệm hoàn thiện công nghệ sản xuất quy mô pilot 53 2.3.5 Thí nghiệm bảo quản chè đen giàu GABA 53 2.4 Phương pháp phân tích 53 2.4.1 Phương pháp phân tích hàm lượng GABA 53 2.4.2 Phương pháp xác định enzym glutamate decarboxylase 55 iv 2.4.3 Phương pháp phân tích tiêu chất lượng chè 55 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 Nghiên cứu lựa chọn vi khuẩn lactic nguyên liệu chè thích hợp cho sản xuất chè giàu GABA phương pháp lên men 57 3.1.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp enzym glutamate decarboxylase cao 57 3.1.2 Thẩm định đặc điểm hình thái phân loại chủng vi khuẩn lactic 58 3.1.3 Thử nghiệm khả lên men tạo GABA chè 63 3.1.4 Xác định chế độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic để lên men chè giàu GABA 64 3.1.5 Tối ưu hóa q trình ni cấy vi khuẩn lactic 72 3.1.6 Phân tích số chất lượng số giống chè Việt Nam 77 3.1.8 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.1 83 3.2 Tác dụng lên men yếm khí tới hiệu tích lũy GABA chất lượng chè đen giàu GABA 83 3.2.1 Thăm dị khả tích lũy GABA q trình lên men yếm khí 83 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng q trình lên men yếm khí 84 3.2.3 Tối ưu hóa q trình lên men yếm khí 86 3.2.4 So sánh chất lượng chè đen lên men yếm khí với chè đen sản xuất theo quy trình truyền thống 89 3.2.5 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.2 90 3.3 Tác dụng lên men yếm khí kết hợp lên men vi khuẩn lactic tới hiệu tích lũy GABA chất lượng chè đen giàu GABA 91 v 3.3.1 Xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa cơng nghệ yếu tố ảnh hưởng đến lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 91 3.3.2 Tối ưu hóa q trình lên men yếm khí kết hợp lên men lactic 95 3.3.3 So sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm từ phương án lên men yếm khí khơng có sử dụng chế phẩm vi khuẩn 97 3.3.4 Tối ưu hóa lên men yếm khí chè đen phương pháp thang điểm có sử dụng hệ số quan trọng cho tiêu chất lượng 99 3.3.5 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.3 106 3.4 Thực nghiệm sản xuất chè giàu GABA quy mô Pilot 106 3.4.1 Sản xuất chè quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ 106 3.4.2 Hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất chè đen giàu GABA quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ 111 3.4.3 Áp dụng quy trình hồn thiện để sản xuất chè đen giàu GABA quy mô pilot với số giống chè Việt Nam 119 3.4.4 Sự biến đổi chất lượng cảm quan chè đen giàu GABA giống Phúc Vân Tiên Kim Tuyên trình bảo quản 121 3.4.5 Tóm tắt kết kết luận nội dung mục 3.4 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO CỦA LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 PHỤ LỤC 145 PHỤ LỤC ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN LACTIC 146 PHỤ LỤC THU HỒI, LÀM KHÔ VÀ BẢO QUẢN SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG 150 PHỤ LỤC QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG VI KHUẨN 154 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM VÀ SẢN PHẨM 158 vi vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AABA alpha-aminobutyric acid alpha-aminobutyric axit ABALDH 4-aminobutyraldehyde enzy 4- dehydrogenase aminobutyraldehyde dehydrogenaza BABA beta-aminobutyric acid beta-aminobutyric axit CACA cis-aminocrotonic acid cis-aminocrotonic axit CFSAN center for food safety and trung tâm an toàn thực applied nutrition phẩm dinh dưỡng ứng dụng CAS chemical abstract services dịch vụ tóm tắt hóa chất CNS central nervous system hệ thần kinh trung ương CFU colony forming unit đơn vị hình thành khuẩn lạc CTC crushing tearing and curling - chè đen công nghệ CTC black tea OTD orthodox -black tea chè đen công nghệ OTD DAO diamineoxidase enzym diamineoxidase DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl DS dietary supplements chất bổ sung dinh dưỡng DSHEA dietary supplement health and đạo luật giáo dục sức education act khỏe bổ sung chế độ dinh dưỡng ETC electron transport chain chuỗi vận chuyển điện tử DNA deoxynucleic acid deoxynucleic axit DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl EC epicatechin epicatechin ECG epicatechin gallate epicatechin gallat viii EGC epigallocatechin epigallocatechin EGCG epigallocatechin gallate epigallocatechin gallat EFSA european food safety authority cục an toàn thực phẩm châu âu EMA european medicines agency cục quản lý thuốc châu âu EPA U.S environmental protection cục bảo vệ môi trường Mỹ agency FDA FMG U.S food and drug cục quản lý thực phẩm administration dược phẩm Mỹ fermented milk containing sữa lên men chứa GABA GABA GC gallocatechin gallocatechin GH immunofunctional growth hocmon tăng trưởng có hormone chức miễn dịch immunoreactive growth hocmon tăng trưởng có hormone hoạt tính miễn dịch GABA gamma-aminobutyric acid gamma-aminobutyric axit GABA-T GABA transaminase enzym GABA irGH transaminaza GAD glutamate decarboxylase enzym glutamat decacboxylaza GBR germinated brown rice gạo lứt nảy mầm GHB gamma-hydroxybutyrate gamma-hydroxybutyrat GHBDH GHB dehydrogenase enzym GHB dehydrogenaza GLRs glutamate receptor-like proteins protein giống chất nhận glutamat GC gas chromatography sắc kí khí GTE green tea extract dịch chiết chè xanh ix SSF solid state fermentation lên men môi trường rắn HDL high-density lipoprotein lipoprotein tỷ trọng cao HGH human growth hormone hocmon tăng trưởng người HPLC high performance liquid sắc kí lỏng hiệu cao chromatography JECFA joint FAO/WHO expert ủy ban chuyên gia committee on food additives FAO/WHO hỗn hợp phụ gia thực phẩm LAB lactic acid bacteria vi khuẩn lên men axit lactic LDH lactate dehydrogenase enzym lactat dehydrogenaza NIH national institutes of health viện sức khỏe quốc gia Mỹ NHPD natural and non-prescription tổng cục quản lý sản health products directorate phẩm sức khỏe tự nhiên Canada PCR polymerase Chaine Reaction phản ứng chuỗi polymeraza PSP pyridoxal phosphate pyridoxal phosphat ppm part per million đơn vị phần triệu SCN suprachiasmatic nuclei tế bào não có nhiệm vụ phản ứng với tín hiệu sáng - tối SSA succinic semialdehyde succinic semialdehid SSADH succinic semialdehyde enzym succinic dehydrogenase semialdehyd dehydrogenaza TCA tricarboxylic acid cycle chu trình axit tricacboxylic hay chu trình Krebs x TCVN tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam TGA therapeutic goods administration cục quản lý hàng hóa trị liệu TLC thin layer chromatography TSTBNM-M tổng số tế bào nấm mốc - men TSVKHK tổng số vi khuẩn hiếu khí TSVKYK tổng số vi khuẩn yếm khí VTCC-B-439 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarium VTCC-B-439 VTCC-B-411 Chủng vi khuẩn Lactobacillus casei VTCC-B-411 66 Chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis 66 67 Chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis 67 xi sắc kí mỏng Phụ lục ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN LACTIC Đặc điểm hình thái vi khuẩn axit lactic 1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc Các chủng vi khuẩn lactic khiết cấy ria ba pha môi trường thạch MRS 72 h 37oC Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo tiêu chí như: màu sắc, độ bóng, mức độ trơn nhẵn, trạng thái bề mặt 1.2 Hình thái tế bào Các chủng tinh cấy ria ba pha môi trường đĩa thạch MRS 48 h 37oC Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào Phân loại vi khuẩn dựa phân tích trình tự rDNA 2.1 Tách chiết ADN từ vi khuẩn Thực theo phương pháp: - Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào - Hoà sinh khối tế bào 100 l TE - Thêm 0,4 mg lysozyme, trộn đều, ủ 37oC h Trộn ph - Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn 2-3 ph trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 ph - Thêm thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn Ly tâm 15.000v/p, 15 ph Chuyển lớp dịch phía sang ống Eppendoft khác - Thêm l RNAse mg/ml, trộn đều, ủ 37oC 30 ph - Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 ph 56oC - Thêm thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph Chuyển lớp dịch phía sang ống Eppendoft khác - Thêm thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000 v/p, 15 ph Chuyển lớp dịch phía sang ống Eppendoft khác - Thêm 1/10 V Natri acetat M 1ml ethanol 100%, đảo trộn Đặt đá 30 ph - Ly tâm 15.000v/p 15 ph Bỏ lớp dịch - Rửa tủa ethanol 70% - Làm khô DNA máy quay chân khơng 146 - Hồ tan DNA 50-100 l nước TE - Kiểm tra sản phẩm PCR điện di Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội đặt gel vào máy điện di, ngập 300ml dung dịch X TAE Trộn l dung dịch 6X loading buffer với l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di dòng điện chiều với điện 100 V, cưòng độ dòng điện 80 mA 30 ph, bỏ ngâm dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 ph vớt Quan sát máy soi gel 2.2 Phản ứng khuếch đại ADN Thành phần phản ứng sau: Thành phần Thể tích (l) 10X buffer 10 dNTP 2.0 Mm 10 Mồi xuôi (10 pmol/l) Mồi ngược (10 pmol/l) Taq polymerase (5u/l) ADN khuôn (50-100 g/l) 1-2 H2 O đủ 100 Chu trình nhiệt: 95oC - ph 95oC - 30 s 30 chu kì 56oC - 15 s 72oC - ph 72oC - ph 40oC -  2.3 Mồi: Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' Kiểm tra sản phẩm PCR điện di: Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội đặt gel vào máy điện di, ngập 300ml dung dịch 1X TAE Trộn l 147 dung dịch 6X loading buffer với l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng Chạy điện di dòng điện chiều với điện 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA 30 ph, bỏ ngâm dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 ph vớt Quan sát máy soi gel 2.4 Tinh sản phẩm PCR Sử dụng kit QIAgen theo dẫn nhà sản xuất Các bước sau đây: - Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 Trộn - Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p ph - Đổ bỏ dịch phía cột - Bổ sung 750 l PE buffer lên cột Ly tâm 10.000 v/p ph - Đổ bỏ dịch cột - Ly tâm tiếp 10.000 v/p ph - Chuyển cột sang ống Eppendoft - Thêm 30l nước Để nhiệt độ phòng ph - Ly tâm 10.000 v/p ph - Lấy dịch phía Kiểm tra độ tinh mẫu: Mẫu kiểm tra máy quang phổ bước sóng 260 280 Tính tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD 280 > 1,7 2.5 Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự Terminator Ready Reaction Mix (Termix): l - Buffer 5X - Bigdye Ready Reaction premix 18 l l - H2 O Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự: - Termix l - Mồi (*) l - ADN khuôn l (nồng độ ADN 40-60 g/ml) - H2 O 10 l (*) Các loại mồi sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' 148 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3' 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3' 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3' Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen: 96oC - ph 96oC - 10 s 50oC - s 25 chu kỳ 60oC - ph 2.6 Tinh sản phẩm PCR cho đọc trình tự - Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft - Thêm l EDTA 125 mM 60 l ethanol 100% Để khoảng 15 ph nhiệt độ phòng - Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph - Bỏ dịch, thêm 60 l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 ph - Làm khô - Thêm 10 l HiDi Formamide, để 96oC ph - Cho mẫu vào nước đá lạnh - Chuyển toàn mẫu vào giếng khay dùng cho đọc trình tự - Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant 2.7 Phân tích trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Trình tự ADNr 16S phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 Thompson cộng (1997) Các trình tự tham khảo dùng nghiên cứu phát sinh chủng loại lấy từ liệu DDBJ, EMBL, GenBank Cây phát sinh xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp Saitou Nei (1987) ****** 149 Phụ lục THU HỒI, LÀM KHÔ VÀ BẢO QUẢN SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG Lựa chọn tốc độ ly tâm tách sinh khối Canh trường vi khuẩn ly tâm 10 ph với tốc độ khác nhau, kết thể bảng 3.8 Bảng PL-1 Lựa chọn tốc độ ly tâm theo mẻ STT Tốc độ ly tâm (vòng/ph) Số lượng tế bào sót dịch sau ly tâm (CFU/ml) VTCC-B-439 VTCC-B-411 2000 6x108 6x108 3000 5x105 5x105 5000 2x104 2x104 8000 2x104 2x104 Kết Bảng PL-1 cho thấy tốc độ ly tâm từ 5000 trở lên thu hồn tồn sinh khối Dịch sau ly tâm có màu mơi trường số lượng tế bào vi khuẩn khơng cịn nhiều 104 CFU/ml mật độ tế bào ban đầu 1010CFU/ml Chúng tiến hành kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm trình thao tác (bằng kỹ thuật nhuộm soi cấy kiểm tra môi trường thạch đĩa MRS LB) khơng phát vi sinh vật tạp nhiễm ngồi chủng ni cấy Như nói, với kỹ thuật ly tâm tốc độ 5000 v/ph 10 ph thu hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn dịch sau lên men Việc tăng tốc độ ly tâm (8000 v/ph) hay kéo dài thời gian ly tâm 15-20 ph không tăng hiệu thu sinh khối tế bào ngược lại phần kết tủa tế bào trở nên bám vào đáy ống ly tâm không tiện cho thu sinh khối cho bước Khi sử dụng thiết bị ly tâm liên tục, sử dụng kết ly tâm theo mẻ với tốc độ ly tâm liên tục 5000 v/ph Kết phân tích lượng tế bào sót dịch sau ly tâm độ nhiễm trình bày Bảng PL-2 150 Bảng PL.2 Kết ly tâm liên tục STT Chủng vi khuẩn Lượng tế bào sót Độ nhiễm dịch sau ly tâm (CFU/ml) (CFU/ml) VTCC-B-439 5x108 5x103 VTCC-B-411 6x108 6x103 Sử dụng thiết bị ly tâm alphalaval tốc độ 5000 v/ph tốc độ dịng chảy 200 lit/h, chúng tơi thu sinh khối đánh giá lượng tế bào sót tạp nhiễm dịch sau ly tâm Kết trình bày bảng cho thấy hầu hết sinh khối vi khuẩn (90%) tách sau ly tâm, với mật độ tế bào ban đầu 109CFU/ml dịch sau ly tâm 108CFU/ml Tuy nhiên chúng tơi phát nhiễm tạp q trình ly tâm (trong sinh khối dịch sau ly tâm) với lượng nhỏ (10 CFU/ml) Sự có mặt vi sinh vật nhiễm (Bacillus) với tỷ lệ thấp cao tiêu chuẩn Việt Nam (≤1x103) cho thấy phương pháp ly tâm liên tục không đảm bảo mặt an toàn sản phẩm Nghiên cứu ảnh hưởng chất mang tỷ lệ phối trộn chất mang đến khả sống vi khuẩn Các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu: Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411 khơng có bào tử nên việc làm khơ hình thức phun sấy hay đông khô dẫn đến chết bất hoạt tế bào dinh dưỡng tỷ lệ khác Trong nghiên cứu này, chọn kỹ thuật đơng khơ q trình làm khơ lạnh sinh khối vi khuẩn thu sau lên men Dịch sinh khối thu sau bước lọc tiếp tuyến dạng past, việc bổ sung chất mang đạt độ khơ 55-60% có tác dụng bảo vệ tế bào, giảm tỷ lệ chết q trình đơng khơ Trong nghiên cứu với tỷ lệ chất mang dịch vi khuẩn 1:1 theo lượng chất khô 60% Kết q trình đơng khơ mẫu vi khuẩn trình bày bảng 3.10 sau: Kết Bảng PL-3 cho thấy thời gian đông khô không phụ thuộc vào chất mang mà phụ thuộc vào chủng vi khuẩn dao động từ 12-14 h Việc so sánh công thức chất mang tiến hành đồng thời cho chủng với công thức từ 16 cho thấy công thức công thức tốt cho chủng vi khuẩn nghiên cứu 151 Với mật độ vi khuẩn dịch ban đầu dao động 109 CFU/ml lượng tế bào chết sau đơng khô dao động từ 10 -50 lần Chọn chất mang xem khâu quan trọng cho trình phát triển sản phẩm sinh khối đông khô dạng bột Vai trò chất mang bảo vệ hoạt động sống tế bào q trình đơng khơ nhiệt độ âm 30 đến âm 50oC.Thông thường số đường lactose, maltose sữa gầy dùng cho mục đích Trong nghiên cứu này, chúng tơi chọn loại chất mang dextrin, sữa gầy lactose với công thức khác nhau: riêng rẽ (công thức 4, 6) phối trộn (1, 3) Bảng PL-3 Số lượng vi khuẩn sản phẩm sau đông khô với công thức chất mang khác Công Chủng VTCC-B-439 Chủng VTCC-B-411 Đánh Thời gian Mật độ Thời gian Mật độ (h) CFU/g (h) CFU/g 13 8x108 12 1x109 Khá 13 5x1010 12 6x1010 Tốt 13 2x109 12 1x109 Khá 13 3x108 12 6x108 Kém 13 7x108 12 1x109 Khá 13 1x108 12 6x108 Kém thức giá Kết cho thấy việc phối trộn chất mang nguồn cacbon nitơ (công thức 1, 2, 5) cho kết tốt hẳn dùng nguồn cacbon làm chất mang (4 6) Công thức công thức cho kết tốt với mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g (chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) dùng cho nghiên cứu phát triển sản phẩm Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn lactic (dạng bột) Mẫu sau đông khô chia thành phần nhỏ (khoảng 50 g), dán kín giữ điều kiện nhiệt độ khác nhau: -20oC, 4oC nhiệt độ phòng (25-30oC) Kết thể Bảng PL-4 152 Bảng PL-4 Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản điều kiện khác Chủng VTCCB-439 VTCCB-411 ĐK bảo quản (oC) -20 25-30 -20 25-30 Số lượng vi khuẩn (CFU/g) sau thời gian bảo quản (tháng) 7x1010 7x1010 7x1010 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 7x1010 6x1010 5x1010 3x1010 2x1010 9x109 6x1010 7x1010 4x1010 3x108 8x107 7x109 2x109 8x108 6x1010 6x1010 6x1010 5x1010 5x1010 5x1010 5x1010 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 3x1010 1x1010 8x109 6x1010 5x1010 2x1010 1x108 8x109 3x1010 7x108 Kết bảng PL-4 cho thấy điều kiện bảo quản ảnh hưởng lớn đến khả sống sót chủng vi khuẩn chế phẩm Trong tất chủng, điều kiện bảo quản -20oC tốt sau 4oC Trong điều kiện này, số lượng tế bào sống giảm (so với ban đầu) không 10-30 lần Lượng vi sinh vật sống giảm mạnh bảo quản điều kiện nhiệt độ thường, số lượng vi khuẩn sống sót giảm 50100 lần có trường hợp (Lactobacillus plantarum VTCCB439) giảm 1000 lần Vì vậy, chủng Lactobacillus casei VTCC-B-411 lựa chọn cho nghiên cứu Tóm lại: Thu hồi sinh khối sử dụng phương pháp ly tâm theo mẻ tốc độ 5000 v/ph 10 ph thu hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn dịch sau lên men, thích hợp cho nghiên cứu nhỏ ban đầu phịng thí nghiệm Sử dụng kỹ thuật lọc tiếp tuyến cho hiệu suất thu hồi sinh khối cao từ thể tích lớn dịch sau lên men hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm so với phương pháp ly tâm liên tục Sử dụng chất mang lactose sữa gầy theo tỷ lệ 1:1 mang lại hiệu cao đông khô sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu, mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g Điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn tại-20oC cho kết tốt nhất, số lượng tế bào sống đạt 1010CFU/g sau tháng bảo quản./ ******* 153 Phụ lục QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG VI KHUẨN Tóm tắt quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn (Hình PL-1) 1.1 Thuyết minh quy trình (a) Chủng vi khuẩn: - Chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B411 có khả sinh enzym glutamate decarboxylasetạo GABA chè - Các chủng vi khuẩn nghiên cứu, phân loại lưu giữ Bảo tàng giống Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội - Ngồi ra, chủng cịn chủng vi sinh vật an toàn (GRAS) sản phẩm chúng liệt kê vào danh mục chất an toàn dùng thực phẩm Cơ quan quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) cho phép sử dụng (b) Hoạt hóa chủng sản xuất: Các chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 vàLactobacillus casei VTCC-B-411) giữ glycerol 20% lạnh -80oC hoạt hóa kiểm tra lại độ chủng cách cấy ria đĩa thạch môi trường MRS, thời gian 48 h 35oC Chọn khuẩn lạc riêng rẽ, kiểm tra tế bào kính hiển vi (tế bào chủng Lactobacillusplantarum VTCC-B-439 có hình que tế bào Lactobacillus casei VTCC-B-411 có hình que ngắn xếp cặp) đồng thời cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MRS, thời gian 48 h 35oC (c) Nhân giống cấp 1: Chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) từ ống nghiệm cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 150 ml môi trường MT2 dịch thể (pH6) với glutamate 1%, nuôi tĩnh 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MT2 Sau 20- 24 h, lấy ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm Mật độ tế bào đạt OD600 ≥ 2.5(≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch cấy (d) Nhân giống cấp II thiết bị lên men lít Cấy 5% giống cấp (ni 20-24 h) chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 154 lít chứa lít mơi trường MT2(pH6), ni khuấy 30 vịng/ph 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MT2 Sau 20-24 h, lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch MT2 cấy Hình PL-1 Sơ đồ quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng lên men chè giàu GABA 155 (e) Nhân giống cấp III thiết bị lên men 30 lít: Cấy 5% giống cấp (nuôi 20-24 h) chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarumVTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 30 lít chứa 20 lít mơi trường MT2 (pH6), ni khuấy 30 vòng/ph, 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MT2 Lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm sau 20-24 h Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch MT2 cấy (g) Lên men thiết bị 300 lít: Cấy 5% giống cấp (ni 20-24 h) chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarumVTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 300 lít chứa 200 lít mơi trường MT2(pH6), ni khuấy 50 vịng/ph 35oC Sau 8-12 h, kiểm tra độ tinh cách cấy ria vào môi trường thạch MRS Lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào máy đo quang phổ bước sóng 600 nm sau 24 h Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml) Đồng thời quan sát khuẩn lạc đĩa thạch MT2 cấy (h) Cô đặc tế bào: Dịch nuôi chủng vi khuẩn từ thiết bị lên men 300 lít lọc qua thiết bị lọc tiếp tuyến xuống 1/20 để thu tế bào thời gian 125-160 ph, thu khoảng 8-10 lít dịch tế bào (i) Trộn chất mang đông khô: Mẫu sau trộn tủ vô trùng, sử dụng chất mang lactose sữa gầy theo tỷ lệ 1:1, đưa vào thiết bị đông khô từ 12-14 h, đến độ ẩm 6-8% Sản phẩm sau làm khô đem nghiền nhỏ thành dạng bột mịn Lấy mẫu để kiểm tra mật độ vi sinh vật sống (đạt > 1010 CFU/g với hai chủng LactobacillusplantarumVTCC-B-439 Lactobacillus casei VTCC-B-411) mức độ vi sinh vật tạp nhiễm dựa theo TCVN (k) Đóng gói bảo quản: Sản phẩm dạng bột chủng VTCC-B-439 chủng VTCC-B-411 đạt mật độ yêu cầu, đóng gói bao tráng nhơm bao plastic kín, tránh ánh sáng Tùy vào mục đích sử dụng, đóng túi 100 - 500g Chế phẩm bảo quản tủ - 20oC Chế phẩm bảo quản 06 tháng, số lượng vi sinh vật đạt ≥ 3x1010 CFU/g 156 Sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng lên men chè giàu GABA Từ quy trình sản xuất sinh khối, tiến hành lên men sản xuất 10 mẻ thu sinh khối vi khuẩn Sau mẻ sản xuất, kiểm tra số lượng tế bào chủng vi khuẩn lactic độ mẻ lên men Kết thể Bảng PL5 Kết bảng PL-5 cho thấy quy trình sản xuất sinh khối chủng vi khuẩn lactic có tính khả thi có độ ổn định cao mẻ Dựa vào khối lượng sinh khối thu mẻ độ mẻ thu hồi cho thấy quy trình mà chúng tơi xây dựng phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam Bảng PL-5 Kết lên men vi khuẩn lactic Mẻ sản xuất Khối lượng sinh khối (g) Độ (%) Mật độ CFU/ml trước thu sinh khối Mẻ 148.5 98.9 4.1010 Mẻ 149.4 99.2 2,1.1010 Mẻ 152.7 98.7 5.1010 Mẻ 153.3 98.6 7.1010 Mẻ 151.8 98.2 4.1010 Mẻ 144.3 98.7 1,9.1010 Mẻ 151.2 98.8 4.1010 Mẻ 148.2 99.2 5.1010 Mẻ 152.4 98.6 6.1010 Mẻ 10 154.2 98.6 6.1010 ******* 157 Phụ lục MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM VÀ SẢN PHẨM Keo Am Tích Phúc Vân Tiên Kim Tuyên Trung Du Hình PL4.1 Chè nguyên liệu dùng nghiên cứu luận án Hình PL4.2 Phịng chế biến chè (trái) thiết bị chè (phải) 158 Hình PL4.3 Phun trộn chè với dịch thể chủng giống vi khuẩn để lên men Hình PL4.4 Chè sau lên men yếm khí kết hợp lên men vi khuẩn lactic 159 Hình PL4.5 Hoạt động chuẩn bị mẫu nước chè để đánh giá cảm quan chất lượng Hình PL4.6 Chè thành phẩm thí nghiệm bảo quản túi PE Hình PL4.7 Sản phẩm chè giàu GABAthành phẩm Hình PL4.8 Sản phẩm chè giàu GABA tham gia hội chợ 160 ... axit (GABA) kỹ thuật lên men từ số giống chè Việt Nam? ?? Mục tiêu luận án Xác định thiết lập số thông số trình cải tiến hệ thống chế biến chè đen Việt Nam thành chè đen giàu GABA, bao gồm chủng giống. .. bị công nghệ 47 2.2 Kỹ thuật công nghệ để nghiên cứu chế biến chè 47 2.2.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ để nghiên cứu lên men chè 47 2.2.2 Kỹ thuật làm héo, vò sấy chè 47 2.2.3 Kỹ. .. 1.3.2 Chè lên men vi sinh vật 1.3.2.1 Giới thiệu chè lên men Chè lên men (còn gọi chè sau lên men hay chè đậm) loại chè trải qua trình lên men vi sinh, từ vài tháng đến nhiều năm Sự tiếp xúc chè