Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật polymerase chain reaction trong chẩn đoán viêm âm đạo cổ tử cung do chlamydia trachomatis tại bệnh viện đại học y thái bình

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Trần Thị Hòa NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM ÂM ĐẠO - CỔ TỬ CUNG DO Chlammydia trachomatis TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LƯƠNG XUÂN HIẾN Hà Nội, Năm 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis .3 1.2 Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis .6 1.2.1 Nuôi cấy 1.2.2 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs) 1.2.3 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody - DFA) 1.2.4 Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) 1.3 Các nghiên cứu Chlamydia trachomatis giới nƣớc .10 1.3.1 Các nghiên cứu giới 10 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc 18 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .23 2.1.1 Đối tƣơ ̣ng nghiên cƣ́u 23 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 23 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U .23 2.2.1 Phƣơng pháp chọn mẫu cỡ mẫu 23 2.2.2 Kỹ thuật xét nghiệm .24 2.2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu .24 2.2.2.2 Xử lý mẫu 24 2.2.2.3 Tách chiết ADN .25 2.2.2.4 Tối ƣu hóa phản ứng PCR 25 2.2.2.5 Xác định độ nhạy phản ứng PCR 29 2.2.2.6 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng 30 2.2.2.7 Xác đinh ̣ tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo , cổ tƣ̉ cung đến khám bệnh viện Đại học Y Thái Bình t tháng đến tháng 10 năm 2011 .31 2.2.2.8 Điê ̣n di, phân tích kế t quả 31 2.2.3 Xƣ̉ lý số liê ̣u 32 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .33 3.1 Tố i ƣu hóa phản ƣ́ng PCR phát hiê ̣n Chlamydia trachomatis .33 3.1.1 Nồng độ MgCl2 33 3.1.2 Nồng độ mồi 35 3.1.3 Thời gian nhiệt độ gắn mồi .37 3.1.4 Số chu kỳ 40 3.2 Độ nhạy kỹ thuật PCR 43 3.3 Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR .44 3.4 Kết xét nghiệm kỹ thuật PCR 44 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis…………………… Hình 1.2 Chu kỳ vịng đời vi khuẩn C.trachomatis……………………………… Hình 1.3 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis số nƣớc Châu Âu……………………10 Hình 3.1 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL1/KL2…….34 Hình 3.2 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6…….35 Hình 3.3 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ mồi KL5/KL6…………………… 36 Hình 3.4 Ảnh điện di kết tối ƣu nồng độ mồi KL1/KL2…………………… 36 Hình 3.5 Ảnh diện di kết tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2……………… 38 Hình 3.6 Ảnh diện di kết tối ƣu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6……………… 38 Hình 3.7 Ảnh diện di kết tối ƣu thời gian gắn mồi KL5/KL6……………….39 Hình 3.8 Ảnh diện di kết tối ƣu thời gian gắn mồi KL1/KL2…………….….40 Hình 3.9 Ảnh diện di kết tối ƣu chu kỳ phản ứng……………………………40 Hình 3.10 Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai lần vi khuẩn C trachomatis……43 Hình 3.11 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm………………………… …45 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR lần thứ nhất…………………………… …41 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR lần thứ nhất…………………….….42 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR lần 2…………………………………….…42 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR lần 2……………………………….43 Bảng 3.5 Kết xét nghiệm C.trachomatis…………………………………….45 Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi……………………………… 46 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực……………………………….47 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BẢNG CHỮ VIẾT TẮT C trachomatis Chlamydia trachomatis DFA Direct Fluorescent Antibody EIAs Enzyme Immuno Assays LPS Lipopolysaccharide MOMP Major Outer Membrane Protein NAATs Nucleic Acid Amplication Tests PCR Polymerase Chain Reaction TPHA Treponema Pallidum Hemagglutination Assay 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề nóng bỏng chăm sóc sức khỏe sinh sản mà nƣớc giới đối mặt bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục Viêm đƣờng sinh dục Chlamydia trachomatis đƣợc coi bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục đứng đầu giới Nhiễm Chlamydia trachomatis thƣờng gây viêm niệu đạo, viêm cổ tử cung Tuy nhiên nế u không điề u tri ̣có thể dẫn đế n các biế n chƣ́ng nhƣ viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn tính, thai ngồi tử cung, vơ sinh tổn thƣơng ống dẫn trứng, viêm mào tinh đòi hỏi phải chăm sóc y tế với phí tổn cao Tổ chức Y tế giới ƣớc tính hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis đƣợc phát [34] Bệnh Chlamydia trachomatis hay gặp ngƣời trẻ tuổi, độ tuổi sinh đẻ Các nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên Tại Châu Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nhân nhiễm Chlamydia trachomatis tăng gấp đôi, Hoa Kỳ số tăng 14% giai đoạn 2000-2005 [15, 18] Ở Việt Nam khoảng vài năm gần vấn đề nhiễm khuẩn Chlamydia trachomatis đƣợc ý Một vài nghiên cứu đƣa tỷ lệ khoảng 30% trƣờng hợp đến khám phụ khoa có tiết dịch đƣờng âm đạo bất thƣờng Chlamydia trachomatis Nguy hiểm nhiễm Chlamydia trachomatis qua đƣờng sinh dục có tới 75% nữ giới 50% nam giới mắc bệnh mà khơng có triệu chứng, ngƣời bệnh hồn tồn khơng biết nhiễm vi khuẩn [2,9] Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis ngƣời ta thƣờng dùng xét nghiệm nuôi cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định nhiễm Chlamydia trachomatis Tuy nhiên xét nghiệm có hạn chế phải bảo đảm vi khuẩn cịn sống q trình vận chuyển đến phịng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng rộng rãi y học để phát tồn vi sinh vật mẫu bệnh phẩm Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction– PCR) NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiều nghiên cứu xem PCR tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị xét nghiệm chẩn đoán LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khác Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm cho phép xác định tồn vi khuẩn dịch âm đạo, tử cung bệnh nhân Với mong muốn đóng góp vào cơng tác chăm sóc sức khỏe nói chung cơng tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu ứ ng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung Chlamydia trachomatis Bệnh viện Đại học Y Thái Bình” với mục tiêu: - Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis - Xác ̣nh tỷ lê ̣ nhiễm Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo, cổ tử cung LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9] Về hình thái quan sát dƣới kính hiển vi quang học, vi khuẩn có hình cầu hình bầu dục, kích thƣớc khác nhau, vi khuẩn Gram âm có màng lipopolisaccharide Vì thiếu số enzyme tổng hợp hợp chất cao sử dụng cho tế bào, vi khuẩn phải ký sinh nội bào bắt buộc, khơng có khả sống sót bên ngồi tế bào Hệ gen Chlamydia trachomatis gồm phân tử DNA dài 1.042.519 nucleotide với 894 trình tự mã hóa cho protein Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis ( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol 15.(9)) Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa đến 10 plasmid có kích thƣớc 7.5 kb Trình tự nucleotide plasmid trình tự bảo thủ cao (có dƣới 1% nucleotide thay thế), chứa khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá gen kháng nguyên Mặc dù chức plasmid cịn chƣa xác định hết nhƣng trình LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tự nucleotide có mặt plasmid tế bào chứng tỏ có vai trị quan trọng vi khuẩn C.trachomatis C.trachomatis đƣợc chia thành 15 loại tuýp huyết khác bao gồm: Tuýp huyết (A-K), L1, L2, L3, Ba, Da, Ia L2a Trong tuýp A, B, Ba C gây bệnh mắt hột Tuýp D, E, F, G, H, I, J K gây bệnh viêm đƣờng sinh dục Tuýp L1, L2 L3 gây bệnh lympho hạt, bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu bẹn [2,9] Chu kỳ phát triển C.trachomatis bào tƣơng tế bào kéo dài 48-72 [34] Vòng đời C.trachomatis gồm giai đoạn: Thể thể lƣới - Thể (Elementary Body- EB) tế bào trịn có đƣờng kính khoảng 0.3m, nhân đậm Thể xâm nhập vào tế bào theo kiểu thực bào - Thể lƣới (Reticulate Body- RB): Sau xâm nhập vào tế bào C.trachomatis chuyển hóa nhờ tế bào tạo thành thể lƣới (đƣờng kính 1m), sinh sản theo hình thức phân đơi kiểu trực phân khoảng 2-3 lần Sau thể lƣới lại chuyển thành thể giải phóng khỏi tế bào thông qua hình thƣ́c ngoại tiế t bào (exocytosis) Thơng thƣờng thể lƣới giải phóng 100-1000 thể tiếp tục xâm nhập vào tế bào Hình 1.2 Chu kỳ vịng đời vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đường truyền bệnh: Vi khuẩn C.trachomatis vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, khơng có khả sống sót ngồi tế bào nên đƣờng truyền chủ yếu đƣờng tình dục lây từ mẹ sang ngƣời mẹ mang thai bị nhiễm C.trachomatis Khả gây bệnh: C.trachomatis có khả gây nên bệnh ngƣời: Bệnh mắt hột bệnh nhiễm trùng sinh dục tiết niệu, bệnh sinh dục tiết niệu nhiều tuýp (D, E, F, G, H, I, J K) gây ra, tăng nhanh số lƣợng ngƣời mắc Trẻ sơ sinh bị mắc bệnh viêm kết mạc viêm phổi C.trachomatis bị lây từ mẹ Ở phụ nữ Có tới 75% phụ nữ khơng có biểu triệu chứng lâm sàng triệu chứng có khơng điển hình [3], nên việc chẩn đốn sàng lọc nhiễm C.trachomatis đơn dựa vào triệu chứng lâm sàng hoàn tồn khơng khả thi Cho đến có biểu viêm vùng chậu bệnh nhân khám vô sinh phát có tổn thƣơng ống dẫn trứng C.trachomatis gây biến chứng khó phục hồi Vì cần thiết phải có phƣơng pháp chẩn đốn xác phù hợp giúp phát C.trachomatis nhằm ngăn chặn hậu mà gây Ở nữ giới, vi khuẩn C.trachomatis gây viêm âm đao, cổ tử cung niệu đạo Các biến chứng thƣờng gặp bệnh nhân nhiễm C.trachomatis mạn tính bao gồm: - Tắc vòi trứng phụ nữ: Một nguyên nhân gây tắc vòi trứng viễm nhiễm vòi trứng, buồng trứng, dây chằng quanh tử cung vòi trứng C.trachomatis - Chửa tử cung: Nguyên nhân viêm nhiễm vịi trứng C.trachomatis khiến phơi thai tắc điểm hẹp Phôi thai lớn dần lên, đến mức phá vỡ mạch máu nơi đậu lại vịi trứng, gây chảy máu dội ổ bụng, làm thai phụ tử vong nhanh chóng Nhiều thống kê cho thấy có tới 9% phụ nữ nhiễm C.trachomatis bị chửa tử cung LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thời gian gắn mồi Thời gian gắn mồi đƣợc chuẩn hóa phản ứng PCR Với cặp mồi KL5/KL6 thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s 50s 60s, phản ứng đƣợc chuẩn bị khối lƣợng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu trình nhiệt : 37°C 15 phút, biến tính ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC; 20s, 30s, 40s 50s 60s 590C; phút 72°C) 35 chu kỳ, bƣớc kéo dài 20 phút 72°C giữ 4°C Kết điện di cho thấy hiệu gắn mồi tốt 60s (hình 3.7) M NC 20s 30s 40s 50s 60s Hình 3.7 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6 Với cặp mồi KL1/KL2 tiến hành thử nghiệm với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20, 30, 40, 50 60s, kết khơng có khác biệt lớn băng điện di 50 60s Do kiểm tra lại thử nghiệm thời gian 20s, 30s, 40s Phản ứng đƣợc chuẩn bị khối lƣợng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu trình nhiệt: 37°C 15 phút, biến tính ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC, 20s, 30s, 40s 550C, phút 72°C) 35 chu kỳ bƣớc kéo dài phút 72°C Kết cho thấy hiệu gắn mồi 40s nét (hình 3.8) Do vậy, chọn thời gian gắn mồi cho KL1/KL2 40s phản ứng PCR thứ 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NC 20s 30s 40s M NC: Chứng âm, khơng có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Hình 3.8 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2 3.1.4 Số chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, số chu kỳ với cặp mồi đƣợc thay đổi để thu đƣợc kết tốt thời gian ngắn Phản ứng PCR vòng đƣợc tiến hành với số chu kỳ 20, 25 30 chu kỳ Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng đƣợc chuẩn bị khối lƣợng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu trình nhiệt: 37°C 15 phút biến tính ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC; phút 59ºC; phút 72°C) 20, 25, 30 chu kỳ, bƣớc kéo dài 20 phút 72°C giữ 4°C Sau tiến hành phản ứng PCR vịng 2, phản ứng đƣợc chuẩn bị khối lƣợng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, µl sản phẩm phản ứng PCR vòng 1,0.05 U UNG theo chu kỳ Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC, 40s 55ºC, phút 72°C) 20, 25, 30 chu kỳ bƣớc kéo dài phút 72°C Quan sát kết điện di hình 3.9 M Hình 3.9 Ảnh diện di kết tối ưu chu kỳ phản ứng 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Giếng số đến giếng số 3: 20 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Giếng số đến giếng số 6: 25 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Giếng số đến giếng số 9: 30 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Kết thấy giếng số 3, số số 7, với tổng số 50 chu kỳ phản ứng PCR kết khếch đại tốt giếng số (25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 25 chu kỳ PCR lần với cặp mồi KL1/KL2) Giếng số số hiệu khuếch đại thấp, không sử dụng Các giếng khác cho băng điện di rõ nét nhƣng chúng tơi khơng sử dụng thời gian xét nghiệm dài Giếng số cho băng nhỏ giếng số thành phần nguyên liệu phản ứng cạn kiệt dẫn đến đứt gãy DNA chu kỳ biến tính cịn lại Kết tƣơng tự với giếng số số Vì chúng tơi lựa chọn 25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 25 chu kỳ PCR lần với cặp mồi KL1/KL2 để thực phản ứng PCR phát vi khuẩn C trachomatis Với kết rút ngắn thời gian tiến hành hai phản ứng PCR xuống Từ kết trên, chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2 số chu kỳ tối ƣu cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis Điều kiện tối ƣu kỹ thuật PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2 nồng độ mồi đƣợc thể qua bảng sau: Bảng 3.1: Thành phần phản ứng PCR vòng Thành phần phản ứng PCR Thể tích Mastermix 2X 12.5µl H2O khử ion vơ trùng 4.4µl MgCl2 (mM) 2.1µl 2.1mM Mồi KL5/KL6 1µl 0.4 pmol UNG 0.05 µl 0.05 U DNA template 5µl Tổng Nồng độ 25µl 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng Nhiệt độ Thời gian (phút : giây) Số chu kỳ 37ºC 15:00 95ºC 10:00 94ºC 01:00 59ºC 01:00 72ºC 01:00 72ºC 20:00 4ºC ∞ 25 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR vòng Thành phần phản ứng PCR Thể tích Mastermix 2x 12.5µl H2O khử ion vơ trùng 9µl Nờ ng ̣ MgCl2 (mM) 1.5µl 1.5mM Nồng độ mồi 1µl 0.4 pmol PCR product 1µl Tổng Nồng độ 25µl 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng Nhiệt độ Thời gian (phút : giây) Số chu kỳ 95ºC 10:00 94ºC 01:00 55ºC 00:40 72ºC 01:00 72ºC 20:00 4ºC ∞ 25 3.2 Độ nhạy kỹ thuật PCR Phản ứng PCR gồm hai lần chạy đƣợc thực với mẫu chứng dƣơng plasmid có nồng độ khác nhau: 101, 102, 103, 104 sao/µl sử dụng 10 µl để điện di gel agarose 1% M Hình 3.10 Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai vòng vi khuẩn C.trachomatis Kết điện di (hình 3.10) cho thấy phản ứng dƣơng tính (quan sát đƣợc băng DNA sau nhuộm ethidium bromide) mẫu có từ 10 plasmid trở lên Dựa kết đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR, lựa chọn nồng độ DNA chuẩn để làm chứng dƣơng cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis mẫu bệnh phẩm 101 Sử dụng chứng dƣơng nồng độ 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com làm giảm nguy ngoại nhiễm khuếch tán sản phẩm PCR lần trình chuyển sản phẩm khuếch đại lần sang tuýp thứ hai Độ nhạy thuận lợi cho thực tế phát bệnh số lƣợng vi khuẩn mẫu bệnh phẩm thấp Tuy so với nghiên cứu Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini Esteban Serra, phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 KL1/KL2) làm mồi phát 10 EB phản ứng mẫu sinh học khác nhau, độ nhạy phản ứng chƣa cao Do đề xuất thử nghiệm PCR điều kiện nghiêm ngặt nhằm tăng giá trị độ nhạy 3.3 Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi KL1, KL2 đƣợc thực với mẫu DNA vi khuẩn Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci mẫu DNA có sẵn phịng thí nghiệm nhƣ: mẫu DNA ngƣời, Escherichia Coli, Mycobacteria Tuberculosis, Hepatitis B virus, Human Papilloma virus Các phản ứng sau thực đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% cho kết âm tính Điều chứng tỏ độ đặc hiệu cao 100% phản ứng PCR, không khuếch đại sản phẩm đối tƣợng khác kể loài Chlamydia khác 3.4 Kết xét nghiệm kỹ thuật PCR Phản ứng hai vịng NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên khả ngoại nhiễm lớn Để giảm thiểu nguy ngoại nhiễm, chúng tơi sử dụng bốn phịng riêng biệt, để pha mix, để chuẩn bị mẫu PCR lần 1, tạo phản ứng PCR lần phòng điện di Trong phản ứng sử dụng dUTP thay cho dCTP đồng thời sử dụng enzyme Uracyl-N-Glycosylase (UNG) nồng độ 0,05U Enzyme có tác dụng phân cắt liên kết N- glycosylic Uracyl glucose sản phẩm ngoại nhiễm có chứa dUTP phản ứng thành dUTP tự do, vơ hiệu hố amplicon nhiễm từ đợt PCR trƣớc tránh đƣợc kết dƣơng tính giả Do vậy, trƣớc thực chu kỳ khuếch đại chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm 37ºC 15 phút với enzyme UNG để phá trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ đợt trƣớc Các chu trình khuếch đại làm bất hoạt hoạt tính UNG với nhiệt độ 55ºC Sau chạy xong chu 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kỳ khuếch đại, ủ mẫu 72ºC thời gian 20 phút để bất hoạt hồn tồn hoạt tính UNG, khơng gây cản trở cho việc đọc kết PCR Kết dƣơng tính giả cịn đƣợc loại trừ chứng âm thực đồng thời với xét nghiệm mẫu nhƣng thay DNA khuôn nƣớc khử ion vô trùng Kết âm tính giả đƣợc hạn chế đến mức thấp phản ứng có độ nhạy cao, phát đƣợc kết dƣơng tính có mặt 10 EB Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm đƣợc thể hình 3.11 NC M Hình 3.11 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm NC: Chứng âm, khơng có sản phẩm DNA (2 µl nướckhử ion) Giếng số 1,3,4: Mẫu bệnh phẩm dương tính Giếng số 2: Mẫu bệnh phẩm âm tính Giếng số 5: Chứng dương M: Thang DNA 100 bp Fermentas với kích thước vạch 100 bp Tỷ lệ dƣơng tính C.trachomatis số bệnh nhân đến khám phòng khám Sản phụ khoa, bệnh viện Đại học Y Thái Bình thể bảng 3.5 PCR Số lượng Tỷ lệ phần trăm Dƣơng tính 80 36.9 % Âm tính 137 63.1 % Tổng 217 100% Bảng 3.5 Kết xét nghiệm C.trachomatis 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong số 217 bệnh nhân có biểu viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám bệnh viện Đại học Y Thái Bình từ tháng đến tháng 10 năm 2011 có 80 ngƣời có kết dƣơng tính với C.trachomatis chiếm tỷ lệ 36.9% Kết cao nghiên cứu Trần Thị Lợi đối tƣợng viêm âm đạo, cổ tử cung năm 1999 có tỷ lệ 32.5% [8]; bệnh viện da liễu thành phố Hồ Chí Minh năm 2008 với xét nghiệm PCR tỷ lệ 35.7% [6]; bệnh viên phong da liễu Quy Hòa 12.1% [5] Trong nghiên cứu tỷ lệ thấp bệnh viên phong da liễu Quy Hịa cỡ mẫu cịn Kết cao nhiều so với nghiên cƣ́u của Farhad B Hashemi và cô ̣ng sƣ̣ Iran năm 2006 [16] Tuy nhiên nghiên cứu Sóc Trăng đối tƣợng phụ nữ mại dâm tỷ lệ dƣơng tính với C.trachomatis 48.4% [3], cao nghiên cứu Kết xét nghiệm chƣa phản ánh đƣợc tồn quần thể cịn có đối tƣợng nhiễm bệnh nhƣng khơng có biểu viêm nhiễm nên không khám, xét nghiệm lần đƣợc áp dụng Thái Bình Vì vậy, với kết dƣơng tính cao nhƣ trên, chúng tơi đề xuất việc triển khai xét nghiệm vi khuẩn C.trachomatis bệnh viện Đại học Y Thái Bình đối tƣợng nữ có khơng có biểu viêm nhiễm sinh dục nhằm kiểm soát lây nhiễm vi khuẩn qua đƣờng tình dục Đồng thời chúng tơi đề nghị tiến hành nghiên cứu thêm cỡ mẫu lớn để khẳng định kết Tiếp chúng tơi tiến hành thống kê số bệnh nhân theo nhóm tuổi Kết thu đƣợc thể bảng 3.6 Bệnh nhân theo nhóm Sớ mẫu dương tuổi tính 35 (n=88) 32 36.4% Tỷ lệ Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tuổi 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết cho thấy nhóm dƣới 25 tuổi có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6% Nghiên cứu tác giả Bulhak Koziol V cộng [33] tỉnh Balan cho thấy tỷ lệ dƣơng tính với vi khuẩn 39.5%, gần tƣơng đƣơng với kết Sự khác biệt tỷ lệ dƣơng tính nhóm dƣới 25 tuổi 35 tuổi có ý nghĩa thống kê với p