1. Trang chủ
  2. » Giáo Dục - Đào Tạo

Nhập môn Công nghệ sinh học - Công nghệ sinh học động vật

42 1 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 42
Dung lượng 1,66 MB

Nội dung

Chương Công nghệ sinh học động vật I Mở đầu Tế bào động vật sinh trư ng loại môi trư ng dinh dưỡng tổng hợp bên ngồi thể, chúng ni cấy cho mục đích sau: - Nghiên c u tế bào ung thư, phân loại kh i u ác tính, xác định tương hợp c a mô cấy ghép, nghiên c u tế bào đặc biệt tương tác c a chúng, sản xuất tế bào g c… - ng dụng để sản xuất hợp chất hóa sinh quan trọng dùng chẩn đoán hormone sinh trư ng c a ngư i, interferon, hoạt t plasminogen mô, viral vaccine kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) Theo phương pháp truyền th ng hợp chất hóa sinh sản xuất cách sử dụng động vật s ng tách chiết từ xác ngư i chết Chẳng hạn, kháng thể đơn dịng sản xuất cách nuôi cấy tế bào hybridoma khoang màng bụng (peritoneal cavity) c a chuột, hormone sinh trư ng dùng để chữa bệnh cịi (dwarfism) tách chiết từ xác ngư i chết Tuy nhiên, s lượng thu từ phương pháp hạn chế việc ng dụng rộng rãi chúng điều trị gặp nhiều khó khăn Chuyển gen vào động vật để tạo nguồn thực phẩm có giá trị ng dụng có ý nghĩa c a cơng nghệ sinh học động vật Tuy nhiên, hướng nghiên c u cịn vài hạn chế động vật có vú lớn chúng sinh sản lần tr ng, việc cấy phôi tr vào mẹ mang ph c tạp, mẹ mang nhận phôi, tr ng c a đa s động vật nuôi có tế bào chất đục nên khó nhìn thấy tiền nhân để chuyển gen vào… Mục tiêu c a chuyển gen nhằm đưa vào vật ni tính trạng có hiệu kinh tế cao sử dụng triệt để th c ăn, nhiều thịt mỡ, sinh trư ng nhanh, kháng bệnh… Mặc dù, gặp s khó khăn thất bại ngư i ta có vài thành cơng bước đầu tạo loại gà kháng bệnh avian leukosis virus gây hay cừu cho nhiều lông… Các kết cho phép hy vọng đạt bước tiến tương lai Nhập môn Công nghệ sinh học 140 Nhân vơ tính (tạo dịng) đ i với vật ni có suất cao hệ c a lại khơng có vài thành cơng định, kỹ thuật cho phép tái tạo vật ni có đầy đ phẩm chất ban đầu phương th c vơ tính Thành cơng vang dội lĩnh vực kết c a Wilmut cộng (1996) cho đ i cừu Dolly Cừu Dolly khơng có b mẹ hiểu theo nghĩa thông thư ng mà tạo cách y cừu trư ng thành Ngoài ra, kỹ thuật áp dụng nhân gi ng động vật chuyển gen, động vật sinh sản hữu tính hệ khơng nhận gen đích, can thiệp c a nhân vơ tính trư ng hợp cần thiết Bên cạnh ng dụng sản xuất, việc ng dụng nhân vô tính để bảo tồn nguồn gen động vật quý trọng đặc biệt II Ni cấy tế bào động vật có vú Các ưu điểm hạn chế c a nuôi cấy tế bào động vật 1.1 Các ưu điểm c a nuôi cấy tế bào động vật - Hệ th ng tế bào động vật “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất phân tử ph c tạp kháng thể dùng làm thu c phòng bệnh, điều trị chẩn đoán (Bảng 5.1) - Các tế bào động vật đáp ng trình hậu dịch mã xác đ i với sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) Chuyển gen c a động vật có vú sản xuất b i hệ th ng vi khuẩn cách dùng công nghệ DNA tái tổ hợp T c độ sinh trư ng nhanh, thành phần môi trư ng đơn giản rẻ tiền c a nuôi cấy tế bào vi khuẩn khiến chúng có nhiều ưu điểm so với ni cấy tế bào động vật có vú Tuy nhiên, vi khuẩn thiếu khả biến đổi hậu dịch mã (posttranslational modifications) bao gồm việc phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), nhiều phản ng kết hợp khác glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành cầu n i disulfide phosphorylation g c amino acid Những sửa đổi quan trọng ảnh hư ng đến hoạt tính sinh học c a sản phẩm Ví dụ q trình glycosylation giúp bảo vệ protein ch ng lại phân giải chúng, trì khả ổn định cấu trúc biến đổi kháng nguyên Nhập môn Công nghệ sinh học 141 Bảng 5.1 Các sản phẩm quan trọng nuôi cấy tế bào động vật Nhóm I Enzyme Urokinase, hoạt t plasminogen mơ Hormone Hormone sinh trư ng (GH) Các nhân t trư ng Nhóm II sinh Các cytokine khác Vaccine Bệnh dại, bệnh quai bị, bệnh s i ngư i… Veterinary-FMD vaccine, New Cattle’s Disease Nhóm III Kháng thể đơn dịng Các cơng cụ chẩn đốn Nhóm IV Virus trùng Thu c trừ sâu sinh học cho Baculovirus Nhóm V Các chất điều hịa Interferon interleukin miễn dịch Nhóm VI Các tế bào nguyên Thử nghiệm độc chất học vẹn - Sản xuất viral vector dùng liệu pháp gen (biến nạp gen bình thư ng vào tế bào soma mang gen tương ng bị khiếm khuyết để chữa bệnh khiếm khuyết gây ra) Các mục đích c a liệu pháp bệnh ung thư, HIV, ch ng viêm khớp, bệnh tim mạch xơ hóa u nang - Sản xuất tế bào động vật để dùng chất in vitro nghiên c u độc chất học dược học - Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn: + Da nhân tạo để chửa b ng + Mô gan để chữa bệnh viêm gan + Đảo Langerhans để chữa bệnh tiểu đư ng Nhập môn Công nghệ sinh học 142 1.2 Một s hạn chế c a nuôi cấy tế bào động vật Mặc dù tiềm ng dụng c a nuôi cấy tế bào động vật lớn, việc nuôi cấy s lượng lớn tế bào động vật thư ng gặp khó khăn sau: - Các tế bào động vật có kích thước lớn cấu trúc ph c tạp tế bào vi sinh vật - T c độ sinh trư ng c a tế bào động vật chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượng c a chúng thấp việc trì điều kiện ni cấy vơ trùng th i gian dài thư ng gặp nhiều khó khăn - Các tế bào động vật bao bọc b i màng huyết tương, m ng nhiều so với thành tế bào dày thư ng thấy vi sinh vật tế bào thực vật, kết chúng dễ bị vỡ - Nhu cầu dinh dưỡng c a tế bào động vật chưa xác định cách đầy đ , môi trư ng nuôi cấy thư ng đòi h i bổ sung huyết máu đắt tiền - Tế bào động vật phần c a mô tổ ch c (phân hóa) thể đơn bào riêng biệt vi sinh vật - Hầu hết tế bào động vật sinh trư ng gắn bề mặt Các dòng tế bào động vật có vú đặc điểm c a Các tế bào động vật có vú tế bào eukaryote, chúng liên kết với b i nguyên liệu gian bào để tạo thành mô Mô động vật thư ng phân chia theo b n nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô (muscle) mô thần kinh (nerve) Biểu mô tạo thành lớp ph lớp lót bề mặt tự c a thể, bên bên ngồi mơ liên kết, tế bào thư ng bao bọc thể gian bào rộng (kéo dài), chất l ng, rắn rắn Các tế bào mô thư ng thon dài gắn với thành phiến bó b i mô liên kết Mô chịu trách nhiệm cho hầu hết chuyển động động vật bậc cao Các tế bào mơ thần kinh gồm có thân bào ch a nhân nhiều phần m rộng dài mảnh gọi sợi Các tế bào thần kinh kích thích dễ dàng truyền xung động nhanh Nhập môn Công nghệ sinh học 143 2.1 Các tế bào dịch huyền phù Tế bào hồng cầu (blood) bạch huyết (lymph) mô liên kết khơng điển hình dạng thể l ng Các tế bào máu dịch bạch huyết tế bào dịch huyền phù (suspension cells), khơng dính bám chúng sinh trư ng nuôi cấy in vitro Các tế bào khơng dính bám khơng địi h i bề mặt để sinh trư ng Chẳng hạn, tế bào bạch huyết (lymphocytes) bắt nguồn từ mô bạch huyết tế bào khơng dính bám có hình cầu đư ng kính từ 1020 m Chúng ni cấy môi trư ng dịch l ng theo phương th c tương tự vi khuẩn 2.2 Các tế bào dính bám Hầu hết tế bào động vật bình thư ng tế bào dính bám, chúng cần có bề mặt để gắn vào sinh trư ng Trong ng dụng, ngư i ta sử dụng rộng rãi loại tế bào dính bám tế bào biểu mô nguyên bào sợi (fibroblast) Các tế bào dính bám cần có bề mặt ẩm để sinh trư ng th y tinh plastic Đĩa petri chai trục lăn loại sử dụng rộng rãi Các chai đặt nằm trục lăn quay tròn chậm t ấm Chai có dung tích lít ch a khoảng 100 mL mơi trư ng thích hợp cho tế bào vừa sinh trư ng thành chai vừa tiếp xúc với mơi trư ng khơng khí Tuy nhiên, chai trục lăn dùng cho quy mô phịng thí nghiệm diện tích bề mặt đơn vị thể tích c a chai ni cấy nh (500 cm2/L) Tỷ lệ diện tích/thể tích tăng lên tế bào sinh trư ng giá thể polymer bọt biển (spongy), thể g m (ceramic), sợi rỗng, microcapsule, hạt nh có kích thước hiển vi gọi microcarrier Các sản phẩm thương mại c a nuôi cấy tế bào động vật có vú Các sản phẩm sinh học sản xuất tế bào động vật có vú ch yếu glycoprotein Bảng 5.2 giới thiệu s sản phẩm tiêu biểu Sự ph c tạp chi phí cao c a q trình ni cấy tế bào động vật cho thấy sản xuất protein tế bào động vật có vú thật kinh tế đ i với sản phẩm có giá trị cao (>USD 106/kg) Vì thế, sản phẩm protein c a tế Nhập môn Công nghệ sinh học 144 bào động vật có vú sản phẩm ch yếu dùng làm dược phẩm Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-Mabs) sản phẩm nuôi cấy tế bào động vật có vú có giá trị Các tính chất liên kết đặc hiệu cao c a Mabs dùng chẩn đoán (cả y học lẫn thú y), phân tích hình ảnh (ung thư bệnh tim), tinh sản phẩm (sắc ký lực) nhân t trị liệu Các protein có đặc tính dược liệu khác sản xuất ni cấy tế bào động vật có vú hướng tới sử dụng điều trị ung thư, bệnh tim, bệnh máu r i loạn hormone - Quá trình glycosyl hóa phân tử protein (hậu dịch mã) xảy mạng lưới nội sinh chất (endoplasmic reticulum-ER) ph c hợp Golgi c a tế bào eukaryote, phụ thuộc vào diện c a enzyme đặc hiệu: glycosyltransferase glycosidase - Vi khuẩn không ch a quan tử không ch a enzyme khơng thể thực biến đổi hậu dịch mã - Nấm men nấm sợi (eukaryote) glycosyl hóa protein từ tế bào động vật có vú thực khó khăn - Một s protein dùng làm dược phẩm khơng glycosyl hóa khơng cần glycosyl hóa cho ch c thích hợp insulin hormone sinh trư ng ngư i, albumin huyết ngư i haemoglobin, sản xuất với giá thành thấp nhiều nh vi khuẩn, nấm men nấm sợi Glycosyl hóa protein (glycosylation) - Trong trình tổng hợp protein hướng dẫn b i khn mẫu DNA RNA, việc bổ sung đư ng vào protein q trình khơng cần khn mẫu Vì thế, tìm thấy nhiều biến thể cấu trúc oligosaccharide c a glycoprotein (các protein glycosyl hóa) - Các glycoprotein có trình tự amino acid gi ng nhau, cấu trúc oligosaccharide khác gọi glycoform Các cấu trúc oligosaccharide liên kết đồng hóa trị với protein nguyên tử nitrogen (N-glycosylation) nguyên tử oxygen (O-glycosylation) Hai dạng glycosylation khác khơng vị trí gắn vào c a đư ng mà loại đư ng s lượng đư ng bổ sung Nhập môn Công nghệ sinh học 145 Bảng 5.2 Một số protein dùng làm dược phẩm sản xuất nuôi cấy tế bào động vật có vú Protein dược liệu Chức Loại glycosylation Hoạt t plasminogen Tác nhân phân giải fibrino-gen Liên kết N mô (tPA) (chất tạo tơ huyết) Erythropoietin (EPO) Tác nhân ch ng thiếu máu Nhân t X Các tác nhân gây cục máu, bệnh Liên kết N O máu lỗng khó đơng VII, VIII, IX Hormone kích thích Điều trị vơ sinh nang nỗn (FSH), kích dục t màng đệm ngư i (hCG) Liên kết N O Liên kết N O Interleukin-2 Ch ng ung thư, điều hòa miễn Liên kết O dịch, điều trị HIV Interferon-alpha (IFN- ) Ch ng ung thư, điều hòa miễn Liên kết N O dịch Interferon-beta (IFN- ) Ch ng ung thư, tác nhân ch ng Liên kết N virus Interferon-gamma (IFN- ) Tác nhân ch ng ung thư, điều Liên kết N hòa miễn dịch Nhân t kích thích Ch ng ung thư khuẩn lạc bạch cầu hạt (G-CSF) Liên kết O Kháng thể đơn dòng Liên kết N Trị liệu chẩn đoán - Hầu hết protein diện bề mặt tế bào, virus, máu c a động vật glycosyl hóa, xem gi ng Nhập môn Công nghệ sinh học 146 s dược phẩm sinh học glycosyl hóa để có ch c tự nhiên c a chúng - Vi khuẩn khơng glycosyl hóa protein c a chúng (hoặc có loại liên kết peptide-đư ng hồn tồn khác với động vật), kỹ thuật c a công nghệ di truyền phát triển cho nấm men tế bào eukaryote loại có glycosyl hóa Dĩ nhiên, chúng khơng ln ln glycosyl hóa phương th c xác tế bào ngư i thực - Đư ng liên kết với protein thơng qua nhóm amide c a asparagine (Asn) chuỗi peptide ngắn Asn-X-Ser/Thr (trong X đại diện cho amino acid ngoại trừ proline), hơn, thơng qua nhóm hydroxyl c a serine (Ser) threonine (Thr) - Glycosyl hóa dạng c a biến đổi hậu dịch mã, t c biến đổi hóa học c a protein sau protein dịch mã từ RNA Một kiểu glycosyl hóa protein khác theo phương th c hóa học, xảy bất c protein nằm dung dịch đư ng th i gian lâu Phương th c gọi glycosylation - Một tế bào thu hỗn hợp glycoform khác Các glycoform khác có tính chất ch c khác nhiều trư ng hợp, nhận biết hệ th ng miễn dịch Các tế bào ung thư thư ng sản xuất glycoform khác từ tế bào bình thư ng glycosyl hóa protein bề mặt c a chúng Nhiều thị kh i u thực tế dấu hiệu phân biệt glycoprotein đặc trưng cho tế bào ung thư, phương th c có nhiều tiềm chẩn đoán ung thư sản xuất dược phẩm đích cho Mơi trường ni cấy tế bào động vật có vú Nhu cầu dinh dưỡng c a tế bào động vật có vú lớn vi sinh vật do, không gi ng vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vơ Vì thế, nhiều amino acid vitamin cần phải bổ sung vào môi trư ng Môi trư ng đặc trưng dùng nuôi cấy tế bào động vật bao gồm amino acid, vitamin, hormone, nhân t sinh trư ng, mu i khoáng glucose Ngồi ra, mơi trư ng cần cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết c a động vật có vú Mặc dù huyết có thành phần chưa xác định đầy đ , nhiều nghiên c u cho thấy cần Nhập mơn Công nghệ sinh học 147 thiết cho phát triển tồn c a tế bào nuôi cấy Bảng 5.3 trình bày thành phần hàm lượng c a chất môi trư ng Eagle (Eagle 1959), môi trư ng sử dụng phổ biến Bảng 5.3 Thành phần môi trường Eagle (1959) Thành phần Nồng độ (mg/L) L-Amino acid Thành phần Nồng độ (mg/L) Vitamin Arginine 105 Choline Cystine 24 Folic acid Glutamine 292 Inositol Histidine 31 Nicotinamide Isoleucine 52 Pantothenate Leucine 52 Pyridoxal Lysine 58 Riboflavin 0,1 Methionine 15 Thiamine Phenylalanine 32 Threonine 48 Muối Tryptophan 10 NaCl 6800 Tyrosine 36 KCl 400 Valine 46 CaCl2 200 MgCl2.6H2O 200 NaH2PO4 2H2O 150 NaHCO3 2000 Carbohydrate Glucose Serum 1000 5-10% Huyết dùng môi trư ng nuôi cấy không đắt tiền mà nguồn nhiễm bẩn virus mycoplasma Do chất hóa học c a huyết chưa xác định đầy đ nên s trư ng hợp ảnh hư ng xấu đến kết nuôi cấy Sự diện c a nhiều protein khác Nhập môn Công nghệ sinh học 148 huyết làm ph c tạp trình phân tách tinh đầu (downstream processing) Vì lý đó, nhiều nghiên c u thực để xây dựng công th c mơi trư ng khơng có huyết Những cơng th c ch a hormone nhân t sinh trư ng tinh để thay cho huyết Nuôi cấy tế bào động vật có vú quy mơ lớn 6.1 Các điều kiện chung Hệ th ng lên men (fermenter) sử dụng nuôi cấy vi khuẩn nấm men từ lâu Đầu tiên, lên men (fermentation) thuật ngữ dùng cho sản xuất ethanol Sau đó, nhà vi sinh vật học ng dụng nguyên tắc để tách chiết vitamin, acid hữu kháng sinh… Kết dẫn đến phát triển nhanh chóng phương pháp hệ th ng lên men khác Các nguyên lý tương tự sau ng dụng cho ni cấy sinh kh i tế bào động vật thực vật Tuy nhiên, nuôi cấy tế bào động vật thực vật khó khăn nhiều so với vi sinh vật, trình trao đổi chất loại tế bào diễn chậm, điều phản ánh t c độ sinh trư ng chậm c a tế bào Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng ph c tạp so với vi khuẩn nấm men, chúng khơng có thành tế bào vi khuẩn chúng dễ biến dạng vỡ Do đó, hệ th ng khuấy sục khí thiết kế khác với ni cấy vi khuẩn Mật độ tế bào thấp cho nồng độ sản phẩm thấp Mặc dù có s điểm khơng thuận lợi, hệ th ng lên men sử dụng để ni cấy tế bào động vật vài chục năm (Hình 5.1) Các dịng tế bào khác BHK-21, LS, tế bào Namalwa… sinh trư ng hệ lên men theo phương th c ni cấy chìm ngập mơi trư ng để sản xuất viral vaccine sản phẩm khác - Đặc điểm dễ biến dạng dễ vỡ c a tế bào động vật khắc phục cách: + Sử dụng hệ lên men có cánh khuấy hình mái chèo + Cung cấp khí trực tiếp tạo bọt khí dễ làm vỡ tế bào, cần cung cấp khí cách khuếch tán thông qua ng silicone Nhập môn Công nghệ sinh học 149 Các điều kiện thực nghiệm tối ưu Các nhân t cần thiết để t i ưu thực nghiệm bao gồm s lượng tế bào, nồng độ DNA, điều hòa biểu gen tế bào nhận, chọn lựa hệ th ng phân tích Có thể xác định đặc trưng điều hịa c a gen môi trư ng tế bào khác cách phân tích biểu tạm th i CAT, B-GAT, GFP Để phân tích biểu ổn định bền vững sử dụng gen thị β-gal, gen đánh dấu chọn lọc neo Chi tiết c a thí nghiệm phân tích trình bày kit chuẩn hướng dẫn cặn kẽ để chọn lựa ưu điểm nhược điểm c a phương pháp Các plasmid mang gen thị không chọn lọc biểu LUC GFP hữu ích làm việc mơi trư ng khơng có áp lực chọn lọc Gen mã hóa GFP (gfp) tạo dịng từ loài s a phát sáng sinh học (Aequorea victoria) Đặc tính hấp dẫn đơn giản c a phương pháp phát cần kính hiển vi huỳnh quang chuẩn không cần chất cofactor khác Các phân tích hóa miễn dịch miễn dịch huỳnh quang cho phép phát tế bào nhận mắt thư ng quan sát chặt chẽ hợp c a cấu trúc tế bào GFP gen s gen thị phát kính hiển vi huỳnh quang tế bào, theo dõi sử dụng biểu c a protein thị phân chia tế bào giai đoạn phân loại tế bào biểu cách sử dụng thiết bị sàng lọc tế bào có hoạt tính phát huỳnh quang Gen gfp tạo dịng tr lại retrovirus vector mang đoạn lặp lại tận dài (long terminal repeat-LTR) c a virus, vị trí tạo dịng, gen kháng neo ngược hướng c a LTR mang đầu tận 3’ Chuyển vector GFP vào tế bào COS-7 biểu m c độ huỳnh quang c a protein phát 24-48 gi mà không cần c định Các retrovirus vector mang GFP cho phép chuyển nhiễm dòng đóng gói sau 24 gi tế bào phân lập thiết bị phân loại tế bào có phát huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS) tiến hành nuôi cấy Thiết bị đếm phương pháp nhuộm propidium iodide phát tế bào chết tách chúng kh i tế bào s ng biểu GFP q trình phân tích FACS Đồng chuyển nạp gen thị gen thử nghiệm Chuyển nạp gen cách dùng hai plasmid, mang DNA quan tâm mang gen thị, neo, -gal, luc gfp, vào tế Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 167 bào động vật có vú thư ng đánh dấu tế bào biểu DNA ngoại lai Thí nghiệm đồng chuyển nạp bắt đầu năm 1979 với gen globin tk c a herpes virus Tiếp đó, nhiều q trình tái tổ hợp gen chọn lọc không chọn lọc sử dụng nhiều phương pháp chuyển gen thu nhiều thành công khác Nếu gen thị gen chọn lọc biểu tế bào nhận, gen th hai (gen quan tâm) biểu Khi gen chọn lọc sử dụng để phân lập quần thể tế bào biểu gen đánh dấu trội, tế bào tương tự theo dõi cho kiểu hình c a gen th hai Chẳng hạn, gen thị trội pSVneo cho phép chọn lọc tế bào môi trư ng G418 gen quan tâm th hai theo dõi cho kiểu hình đặc trưng Vi tiêm pSVneo vào tế bào NIH3T3 sản xuất 35% khuẩn lạc kháng neo Vi tiêm gen ras (một loại oncogene) tạo dịng, có nguồn g c từ ung thư bàng quang ngư i, có từ 10-20% tế bào biểu kiểu hình chuyển nạp Vi tiêm tế bào NIH3T3 với hai gen ras neo cho phép chọn lọc tế bào kháng neo, 50% c a chúng có kiểu hình oncogene Hệ th ng chọn lọc kép với hai gen chọn lọc sử dụng hygromycin neomycin, đòi h i xác định cẩn thận điều kiện thí nghiệm Độc tính kết hợp với chọn lọc G418 hygromycin giới hạn khả s ng sót c a tế bào, đặc biệt dịng tế bào sơ cấp phân hóa Phương pháp vi tiêm mẫn cảm 100 lần so với phương pháp chuyển nhiễm chuyển gen ras vào nguyên bào sợi dị bội c a ngư i b i kháng nguyên SV40T Một tế bào, c-rasSVneo-HAL, hình thành kỹ thuật vi tiêm pSV2neoT24 sau không thành công với kỹ thuật lipofection, chuyển nhiễm xung điện Tần s biểu ras p21 10% thử nghiệm tạm th i 1% cho biểu ổn định Vi tiêm trực tiếp vào 100-200 tế bào cho hội quan sát phản ng nội bào riêng rẽ tới đại phân tử Antisense oligodeoxynucleotide (ODN) peptide nucleic acid (PNA) cung cấp phương th c cho liệu pháp gen tương lai Đánh giá phản ng trả l i sợi đ i nghĩa (antisense) c a gen đích (target gene) thực cách dùng phương pháp vi tiêm hệ th ng mơ hình Mơ hình xây dựng để phân tích hiệu ODN PNA thiết kế đặc biệt Gen đích đơn vị phiên mã sớm c a DNA SV40 mã hóa cho kháng nguyên T lớn Các tế bào ch a hợp đơn c a DNA SV40 với kháng nguyên T lớn mẫn cảm nhiệt độ (tsA8) dùng để Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 168 đánh giá kìm hãm c a kháng nguyên SV40 sau vi tiêm cấu trúc PNA ODN c a sợi nghĩa (missense) sợi đ i nghĩa Đồng vi tiêm với -gal cho phép phát tế bào vi tiêm riêng rẽ nh phân tích miễn dịch huỳnh quang kép cho kháng nguyên T -gal Hai chrome huỳnh quang (fluorochromes) riêng biệt cho phép xác định s phần trăm tế bào biểu -gal có không biểu kháng nguyên T kết c a c chế sợi đ i nghĩa Vi tiêm PNA có từ 15-20 b vào nhân c chế hoàn toàn biểu c a kháng nguyên T SV40 Sự c chế đặc hiệu ch ng minh s khơng có khử gen -galactosidase đồng vi tiêm PNA c a sợi khơng có nghĩa khơng khử kháng ngun T SV40 mà không biểu -gallactosidase Tiếp đến tế bào thận thích nghi c a khỉ (CV-1) vi tiêm plasmid biểu kháng nguyên T c a SV40 plasmid phân chia ch a -gal điều hòa b i promoter CMV Phương pháp miễn dịch huỳnh quang kép dùng để xác định s lượng biểu c a -gal nhân t thị c a tế bào vi tiêm có mặt vắng mặt kháng nguyên T xem đơn vị đo s lượng c a hiệu suất c chế gen b i sợi đ i nghĩa ODN PNA Một hệ th ng thí nghiệm điều khiển cao cho phép so sánh trực tiếp hiệu c a tính đặc hiệu chuỗi oligonucleotide, biến đổi chiều dài nồng độ, so sánh với peptide nucleic acid lớp phân chia oligomer antisense Kỹ thuật tế bào mầm phôi, chuyển gen tái tổ hợp tương đồng Một phương th c khác hữu hiệu chuyển gen đưa DNA ngoại lai vào tế bào mầm phôi (embryonic stem-ES) cịn gọi tế bào g c (Hình 5.7a) Thiết lập dòng tế bào ES, tế bào cấy chuyển từ kh i tế bào bên c a túi phôi (blastocyt) phát triển lên tầng ni dưỡng vào mơi trư ng có hoạt tính c chế phân hóa (differentiation inhibiting activity-DIA), để trì trạng thái khơng phân hóa c a chúng DNA ngoại lai đưa vào tế bào ES s phương th c sau: xung điện, chuyển nhiễm vi tiêm Sau đó, tế bào chọn lọc đưa tr lại vào túi phơi dính vào mang thai giả cho phép phát triển tới kỳ hạn sinh đẻ Sự khác biệt quan trọng c a s động vật thu theo phương th c so với vật thu kỹ thuật vi tiêm vào phôi Nhập môn Công nghệ sinh học 169 tế bào (one-cell embryo) chúng tạo thể khảm tế bào mang gen biến nạp chiếm tỷ lệ định c a sinh kh i tế bào bên c a túi phôi Tuy nhiên, phương th c cung cấp tế bào chuyển gen đóng góp vào dịng tế bào mầm (germline), sau phương th c chọn gi ng thích hợp cho phép thiết lập dòng chuyển gen Phân lập số tế bào nội sinh từ túi phơi Các dịng tế bào ES (a) (b) Chuyển tế bào ES vào túi phơi nhận X Chuyển DNA đích Chọn lọc và/hoặc sàng lọc PCR Gây giống thể khảm Nhận dạng chuyển gen Hình 5.7 Chuyển gen động vật (a) Sinh sản c a động vật chuyển gen phương th c thao tác tế bào ES (b) Tiếp theo việc chuyển DNA, tế bào ES mang thể tái tổ hợp tương đồng chọn lọc trước đưa vào túi phôi Việc đưa DNA ngoại lai vào tế bào ES có ý nghĩa phương pháp vi tiêm vào phôi tế bào nh ưu điểm thực tế DNA ngoại lai thiết kế để tái tổ hợp tương đồng với nội sinh c a (Hình 5.7b) Sự chọn lọc tiếp theo, dịng đích xác nhận diện, Southern blot phân tích PCR, đưa tr lại vào Nhập môn Công nghệ sinh học 170 túi phôi vật ch để sinh sản thể khảm chuyển gen mong mu n Một s phương th c phát minh cho chọn lọc dương tính thể tái tổ hợp tương đồng ph i hợp với chọn lọc âm tính dựa theo hợp ngẫu nhiên Chọn lọc dương tính hướng tới cách ngắt quãng chuỗi tương đồng vector đích với marker chọn lọc, gen neo kháng neomycine c a vi khuẩn Nếu vector hợp genome kiểu tương đồng, sau gen neor kết hợp chặt chẽ germline Mọi chuỗi bổ sung c a vector mà khơng có vùng tương đồng bị Bằng cách đặt gen HIV-1-tk vùng không tương đồng c a vector đích, tế bào trì gen thơng qua trư ng hợp hợp ngẫu nhiên bị giết chết diện c a nucleoside nhân tạo thích hợp IV Nuôi cấy tế bào mầm để sản xuất quan người Khả sử dụng tế bào ES nghiên c u y sinh học m lĩnh vực ng dụng “y học tái tạo” bắt nguồn từ tính đa c a c a ES chúng có khả tự phân chia đổi vơ hạn, phân hóa thành nhiều loại tế bào, không loại bắt nguồn từ ba quần thể tế bào sáng lập (ngoại bì, trung bì nội bì) phơi từ sinh tất tế bào c a thể, mà loại mơ chun hóa hỗ trợ phơi tử cung Năm 1981, Martin Evans lúc phát thấy tế bào ES c a chuột nuôi cấy điều kiện đặc biệt, bắt đầu phân chia nhân lên vơ hạn mà khơng phân hóa, c định giai đoạn phát triển phôi sớm Tuy nhiên, sau tạo nhiều hệ nuôi cấy, tế bào ES nhớ chúng chương trình hóa gì, giữ khả phân hóa thành bất c loại tế bào chuyên hóa c a thể Năm 1998, Thomson cộng phân lập tế bào ES từ phôi ngư i nhận thấy chúng khác với tế bào g c c a chuột nhiều điểm, chẳng hạn khó trì nhân lên nuôi cấy Năm 2000, Pera cộng ch ng minh tế bào ES ngư i phân hóa điều kiện in vitro thành loại tế bào trư ng thành khác Chẳng hạn, họ phân lập từ tế bào ES nuôi cấy in vitro quần thể tiền tế bào thần kinh khiết, s điều kiện chúng phân hóa thành tế bào thần kinh thành thục Nhập môn Công nghệ sinh học 171 Phôi sớm người giai đoạn blastocyst (tương đương phơi nang động vật có vú) Tế bào gan Tế bào mầm phôi HO C Tuỷ xương Tế bào thần kinh Nuôi cấy tế bào mầm Các điều kiện nuôi cấy khác Tế bào mầm trưởng thành Tế bào tim Các loại tế bào phân hóa khác Hình 5.8 Ni cấy tế bào mầm để sản xuất quan người Hai tính chất c a tế bào ES ngư i đa khả sinh sản vô hạn trạng thái phôi nguyên th y điều kiện in vitro, khả phân hóa thật thành loại tế bào trư ng thành Vì vậy, có nhiều lĩnh vực ng dụng chúng, có hướng sau: ng dụng tế bào mầm phơi nghiên c u Trên thực tế, tế bào ES công cụ quý giá để hiểu rõ phát triển c a phôi ngư i dị dạng khác làm r i loạn phát triển Các tế bào ES cung cấp phương tiện nghiên c u kiện ch yếu tăng sinh tế bào đa năng, tham gia c a chúng vào đư ng phân hóa đặc thù, nhân t điều khiển chúng Việc nghiên c u dòng tế bào ES mang ba nhiễm sắc thể thể ba 21 giúp nhà nghiên c u đánh giá hậu c a tai biến di truyền đến phát triển Ngoài ra, tế bào ES niềm hy vọng đấu tranh ch ng lại nhiều loại u trẻ em, u nguyên bào thận, bắt nguồn từ quần thể tế bào phơi, dấu hiệu sinh bệnh khó nghiên c u Tế bào ES giúp xác định tác dụng c a gen gây ung thư gen Nhập môn Công nghệ sinh học 172 ngăn chặn ung thư quần thể tế bào đích sinh kh i u phát triển Những tế bào ES cháu phân hóa c a chúng, tiền thân c a loại tế bào định, dùng để xác định tác dụng c a cytokine nhân t sinh trư ng khác đến tăng sinh quần thể tế bào phôi mà chưa tiếp cận để nghiên c u Về phương diện điều trị, tương tự nhân t xác định tác dụng kích thích sinh trư ng, tế bào ES máu có ng dụng lâm sàng trư ng hợp ghép t y, nhân t sinh trư ng phân hóa xác định nh ni cấy tế bào ES có ng dụng việc tái tạo mô khác Nghiên c u ch c gen Với thành tựu xác định gen c a ngư i, ngư i ta xét nghiệm nhanh ng nghiệm để xác định ch c c a gen Vì tế bào ES ni cấy dễ xử lý di truyền, chịu biến đổi định vị vị trí nhiễm sắc thể đặc thù nh cách tái tổ hợp nguồn, biết, tế bào phôi tế bào trư ng thành phân hóa Nghiên c u mơ hình bệnh lý Theo nguyên lý, tế bào ES nguồn in vitro đ i với loại tế bào c a thể, chúng có vai trị quan trọng nghiên c u độc chất học trình tìm loại thu c Khả sản xuất với s lượng lớn loại tế bào đặc biệt c a ngư i ng nghiệm, từ tế bào tiền thân mà ngư i ta biến đổi di truyền, giúp tạo mơ hình bệnh lý khuyết tật c a nhiều gen mô đặc biệt Những tế bào ngư i bắt nguồn từ tế bào ES biến đổi di truyền nguyên liệu lý tư ng để chọn lọc ng nghiệm phân tử điều trị Chúng ta không cần đến mô hình động vật, mà mơ hình thiếu đặc điểm định phát triển bệnh ngư i ng dụng y học tái tạo Mặc dù ng dụng tương lai c a tế bào ES nghiên c u quan trọng, ng dụng hấp dẫn dùng tế bào làm nguồn mô để ghép Nhiều bệnh làm ngư i suy yếu tượng tế bào chết, thối hóa q trình sinh lý-bệnh lý mãn tính tổn Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 173 thương nghiêm trọng Trong trư ng hợp vậy, việc thay mô tổn thương mô lành hy vọng chữa kh i Từ nhiều năm nay, dịch vụ cấy ghép phải đương đầu với tình trạng khơng đ mơ quan c ng hiến Cho nên nguyên tắc, tế bào ES quan tâm, chúng nguồn đổi vô hạn cho tất loại tế bào c a thể, bên cạnh “tế bào mầm trư ng thành” Trên thực tế, nhiều tình hu ng lâm sàng, việc ghép tế bào có khả tái tạo mơ có hiệu t t so với ghép quan trọn vẹn Nếu kết hợp công nghệ tế bào ES với công nghệ nhân động vật có vú, ngư i ta xem xét việc sản xuất tế bào ES bắt nguồn từ tế bào c a ngư i bệnh, nhằm vào loại “tự ghép”, để tránh tượng thải loại Chỉ cần dung hợp tế bào c a ngư i bệnh vào noãn bào tách nhân (như trư ng hợp nhân cừu Dolly), cho tr ng thu từ phát triển tới giai đoạn phôi bào để phân lập tế bào ES, kích thích tế bào phân hóa mơ cần ghép Phương pháp này, gọi là nhân điều trị, tạo mơ lành hồn tồn phù hợp, có thành phần di truyền c a ngư i bệnh, dấu chuẩn tương hợp mô Chẳng hạn, ngư i ta thành công sản xuất tế bào ES chuột từ phơi bào nhân bản, sau tế bào tiêm lại vào phôi chuột, phân hóa mong đợi, thành nhiều loại mơ Nhưng phải nhấn mạnh rằng, tất ng dụng tế bào ES ngư i, trước đ i, cần phải hiểu rõ trình sinh học kế cận, cải tiến hệ th ng nuôi cấy tế bào Hiện nay, hiểu biết c a tế bào ES đa hạn chế, kể chuột, nhiều điều phải biết tế bào ES ngư i trước ni cấy chúng với quy mơ lớn xử lý chúng mặt di truyền Cũng phải cần hiểu cách điều khiển phân hóa c a chúng thành tế bào tiền thân c a mô khác nhau, cách nuôi cấy tế bào Ví dụ: trư ng hợp tiền thân c a tế bào thần kinh, có hệ ni cấy t t giúp nhân chúng lên, để chúng biến đổi thành tế bào thần kinh thành thục Ngư i ta phân hóa đặc trưng tế bào ES chuột thành tế bào thần kinh có hoạt tính dopamin, mà thối hóa gây bệnh Parkinson Tiếc rằng, đ i với nhiều dòng tế bào khác, ngư i ta chưa làm ch giai đoạn Cu i cùng, trước nhân điều trị đạt tới giai đoạn ng dụng lâm sàng, nhiều việc phải làm để cải tiến hiệu c a giai đoạn nhân bản, ch ng minh phôi nhân sinh mơ hoạt động Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 174 bình thư ng Tuy có nhiều tr ngại hiểu biết c a ngư i phát triển phôi tiến nhanh năm gần Nếu cộng đồng khoa học ng hộ để c gắng nghiên c u đến cùng, tế bào g c ngư i đa đóng góp ch yếu vào y học kỷ 21 V Công nghệ phôi động vật có vú Cấy truyền hợp tử Cơng nghệ cấy truyền hợp tử hay cịn gọi cơng nghệ chuyển phôi (embryo transfer technology) kết c a bước tiến lớn sinh học phát triển sinh học phân tử Các vi thao tác phôi c a loại vật nuôi tiến hành điều kiện in vitro, sau lấy phôi từ động vật cho (donor) trước nuôi cấy phôi vào động vật nhận (recipient), bao gồm thao tác như: - Tách phôi thành hai hay nhiều phần - Ph i hợp hai hay nhiều phôi thành thể khảm - Biến đổi thành phần tế bào c a phôi phát triển Kỹ thuật vi thao tác phôi bắt nguồn từ thao tác động vật thí nghiệm, dựa s phát chế phân hóa phơi sớm, chế phát triển cá thể động vật khơng xương s ng sau động vật có xương s ng bậc thấp cu i động vật có vú Các thực nghiệm ch ng minh tế bào phôi tách từ phơi hai tế bào (two-cell embryo) có khả phát triển thành phơi hồn chỉnh, đồng th i kết hợp hai hợp tử chuột hình thành nên thể dạng khảm Thực nghiệm vi thao tác phơi động vật có vú tiến hành th Bảo quản phôi Đây giai đoạn tiến hành trước cấy truyền phôi vào động vật nhận, tạo điều kiện đảm bảo vận chuyển phôi xa, không cần phải gây động dục đồng th i cho vật nhận sau vi thao tác lấy phôi từ vật cho Trong thực tiễn cấy truyền phôi, bảo quản lạnh phôi nitrogen l ng (-196oC) đ i với tất loại vật ni (trừ lợn) bị, kỹ thuật đơng lạnh phơi cho kết thụ thai khoảng 80%, Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 175 trư ng hợp phôi nguyên cho kết cao phôi thao tác tác động c a yếu t thao tác tách phôi Nuôi cấy tạm thời phôi thể sống Ngư i ta tiến hành nuôi cấy tạm th i phôi gia súc, vật nuôi hệ th ng khác nhau: ng dẫn tr ng c a cừu, chuột, th ; tử cung c a bò cái; xoang màng bụng (phúc mạc, periton) c a chuột; xoang i phôi gà Hầu hết hệ th ng nói sử dụng với vi thao tác, cần đến kỹ thuật bọc phôi loại chất bảo vệ (thư ng agar) để bảo vệ màng su t c a phôi không bị tổn thương Kỹ thuật bọc phôi agar Sử dụng dung dịch agar 0,9% NaCl Trước thao tác, cho nóng chảy agar, sau làm nguội agar 39oC, vừa khơng q nóng đ i với phơi, cịn nh giọt Việc bọc agar quanh phôi phải tiến hành nhanh, để agar chưa kịp đông lại Trước bọc agar, phôi m lớp màng su t phải nhúng vào huyết bê đun ấm Mục đích c a thao tác nêu để không làm thương tổn tế bào phôi Kỹ thuật nuôi cấy tạm thời phôi ống dẫn tr ng Lấy hai kh i agar bọc phôi, chuyển vào ng dẫn tr ng c a cừu cái, kèm lượng t i thiểu môi trư ng Cừu phải tạm ngừng sinh dục, không động dục không chửa th i gian nuôi cấy Các điều kiện nêu đáp ng trước ngày thao tác cấy phôi, ngư i ta tiêm vào tử cung progestagen Các phơi bình thư ng vào tử cung giai đoạn tám đến mư i sáu tế bào ng dẫn tr ng c a th sử dụng rộng rãi để cấy phôi động vật, cấy hợp tử thụ tinh ng nghiệm Để cấy vào ng dẫn tr ng th , phôi cần bọc b i lớp m ng muxin Thư ng ngư i ta dùng ng dẫn tr ng c a th để nuôi cấy tạm th i phôi lợn Ngồi ra, kỹ thuật ni cấy tạm th i phơi tử cung c a bị sử dụng để nghiên c u pha sớm trình hình thành thể khảm phơi bị Xoang i c a gà sử dụng để nuôi cấy phôi c a chuột, dê mèo Phôi bọc kh i agarose sau chuyển vào xoang i c a gà Nhập môn Công nghệ sinh học 176 VI Nhân vơ tính động vật có vú Khái niệm Nhân vơ tính (hay cịn gọi tạo dịng vơ tính) q trình tạo một tập hợp thể gi ng hệt mặt di truyền gi ng b (hoặc mẹ) ban đầu phương th c sinh sản vơ tính Nhân vơ tính dựa quan điểm cho tế bào c a thể đa bào xuất phát từ tế bào hợp tử ban đầu qua phân bào nguyên nhiễm, nhân c a chúng hoàn toàn gi ng hệt mặt di truyền Sinh sản vơ tính sinh sản không kèm theo tái tổ hợp di truyền, thực theo chế phân bào mitose, genome tái nguyên vẹn Khác với sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính (tiến hóa hơn) có kèm theo tái tổ hợp di truyền thực theo chế phân bào mitose meiose Tái tổ hợp di truyền nguyên nhân dẫn đến đa dạng sinh học (biodiversity) Sinh sản hữu tính hình th c sinh sản phổ biến sinh vật bậc cao Trong sinh sản vơ tính tồn thể có cấu trúc tương đ i đơn giản gặp nhiều thực vật (thực vật có hình th c sinh sản hữu tính) động vật bậc cao sinh sản vơ tính tồn giai đoạn phát triển sớm hình th c biến dạng c a sinh sản hữu tính hình th c đơn tính sinh Nhân vơ tính động vật Có thể hiểu cách đơn giản kỹ thuật nhân nhiều cá thể từ tế bào vơ tính (somatic cell) (Hình 5.9) Nhân vơ tính động vật đánh giá phương th c tăng s lượng động vật thương mại khoa học quan trọng Đầu tiên, phát triển hoàn chỉnh chuột thu tiền nhân (pronucleus) nhân (nucleus) từ phôi chuột giai đoạn sớm hai tế bào chuyển vào noãn bào phá b nhân (enucleated oocyte) Nhân từ giai đoạn sau xem khơng đ khả để tái chương trình hóa hỗ trợ phát sinh phơi Ngư i ta thấy hoạt hóa nhân tạo (bằng cách kích thích điện) cho phép nhân từ phơi chuột có tám tế bào chuyển vào tế bào chất giai đoạn MII, việc chuyển theo chuỗi (sinh trư ng tr ng khôi phục lại môi trư ng ch a cytochalasin B, sản xuất Nhập môn Công nghệ sinh học 177 “hai nhân gi ng tiền nhân”, chuyển vào phôi tế bào thụ tinh phá b nhân trước đó) cải thiện việc sản xuất dòng chuột Bằng cách dùng phương th c chuyển nhân, cừu tạo dịng từ tế bào có nguồn g c từ phơi từ dịng tế bào soma có nguồn g c từ thai tuyến vú Gần hơn, tạo dịng phơi bị cách chuyển đa nhân thông báo Phôi ếch ho c nòng nọc (ấu trùng) Tế bào trứng ếch Nhân UV Tế bào ruột Nhân Cấy nhân Phôi tế bào Nhân bị hủy Nịng nọc Hình 5.9 Sơ đồ nhân vơ tính ếch Nhân vơ tính cừu Dolly Đây cơng trình c a Wilmut, Campbell cộng (Ecosse, Anh) Đ i tượng nghiên c u khơng cịn tế bào phôi nang, mà tế bào lấy từ tuyến vú cừu Finn Dorset, sáu năm tuổi, lông trắng, th i kỳ ba tháng cu i từ cừu mang thai, th i kỳ tế bào tuyến vú phân hóa (differentiation) cao độ phát triển Nhập môn Công nghệ sinh học 178 Hình 5.10 Cừu Dolly cừu mẹ Đem ni cấy in vitro tế bào tuyến vú, để ngày môi trư ng nuôi cấy nghèo huyết thanh, với mục đích làm cho chu kỳ tế bào giảm từ từ ngừng hoàn toàn Giai đoạn gọi G0 Sau đó, làm lạnh trước đưa tế bào tuyến vú vào noãn chưa thụ tinh, rút nhân c a cừu khác, đầu đen Kết quả, tế bào hình thành, phát triển tạo thành phơi có ph i hợp c a hai kỹ thuật, hoạt hóa tr ng lấy nhân c a cừu đen, hai làm ngừng chu kỳ s ng c a tế bào tuyến vú cừu trắng, t c tế bào soma biệt hóa cao độ, tách từ thể trư ng thành ngư i ta thành công kỹ thuật dung hợp tế bào Thành công vượt lên cơng trình trước đó, từ 1992 thất bại ch yếu tế bào phôi sử dụng để chuyển nhân không định vị giai đoạn G0 (như trư ng hợp tạo cừu Dolly), mà phát triển tới G2 (pha tăng trư ng) S (pha tái bản, tổng hợp DNA), cản tr dung hợp tế bào Cừu Dolly sinh ngày 5/7/1996, có trọng lượng bình thư ng khơng có biểu dị dạng thí nghiệm trước S ng tử cung c a “mẹ nuôi hộ” lông đen, cừu Dolly có lơng trắng, phân tích kiểm tra di truyền xác nhận cừu Dolly c a cừu Finn Dorset, cừu cung cấp tế bào tuyến vú Nhập môn Công nghệ sinh học 179 Cừu cho tế bào tuyến vú Cừu cho tế bào trứng Tế bào trứng từ nỗn Ni cấy tế bào tuyến vú Chu kỳ tế bào ngừng lại (phage G0) Loại bỏ nhân Dung hợp tế bào Tế bào sinh trưởng nuôi cấy Nhân tế bào tuyến vú Phôi sớm Cấy truyền vào tử cung cừu thứ ba Cừu mẹ thay Phát triển phôi Cừu non (Dolly) giống hệt nhiễm sắc thể với cừu cho tế bào tuyến vú Hình 5.11 Sơ đồ nhân vơ tính cừu Dolly Sau Wilmut Campbell tạo ba cừu từ tế bào bào thai 26 ngày b n cừu từ tế bào phôi hình thành ngày Thành cơng nêu ch ng t động vật có vú lớn nhân từ tế bào soma mà không cần có tác động c a tế bào sinh dục, Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 180 ngồi sinh chất c a noãn bào Ngư i ta nhân thành công khỉ lợn, gần ngư i dùng phôi non (14 ngày) để cung cấp nguyên liệu cấy ghép chữa bệnh Về chất lượng, nói chung nhân từ tế bào soma tạo cá thể đực ưu việt theo ý mu n Tuy nhiên, vấn đề cần tiếp tục kiểm tra, vai trò c a tế bào chất c a tr ng (noãn) dung hợp với tế bào soma (tuyến vú) Tế bào chất c a tr ng tiếp nhận nhân chuyển vào kh i động cho phát triển c a phôi Tuy nhiên, chế c a q trình chuyển genome mẹ vào genome phơi chưa sáng t vai trò c a tế bào chất c a nỗn thí nghiệm dung hợp chưa biết đầy đ Tài liệu tham khảo/đọc thêm Nguyễn Ngọc Hải 2005 Sinh học mạo hiểm NXB Thanh niên, Hà Nội Phan Kim Ngọc Hồ Huỳnh Thùy Dương 2001 Sinh học c a sinh sản NXB Giáo dục, Hà Nội Phan Cự Nhân 2001 Di truyền học động vật NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press Inc New York, USA Coleman WB and Tsongalis GJ 1997 Molecular Diagnostics-For The Clinical Laboratorian Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA Klefenz H 2002 Industrial Pharmaceutical Biotechnology Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany Lee JM 2000 Biochemical Engineering Prentice Hall Inc USA Marshak DR, Gardner RL and Gottlieb D 2001 Stem Cell Biology Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 10 Mather JP and Roberts PE 1998 Introduction to Cell and Tissue Culture: Theory and Technique Plenum Press, New York, USA 11 Pollard JW and Walker JM 1997 Basic Cell Culture Protocols Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA 12 Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK 13 Shuler ML and Kargi F 2002 Bioprocess Engineering-Basic Concepts 2nd ed Prentice Hall Inc NJ, USA Nhập môn Công nghệ sinh học 181 ... mạch xơ hóa u nang - Sản xuất tế bào động vật để dùng chất in vitro nghiên c u độc chất học dược học - Phát triển công nghệ mô phát sinh quan để sản xuất quan thay nhân tạo -sinh học/ các dụng cụ... tiểu đư ng Nhập môn Công nghệ sinh học 142 1.2 Một s hạn chế c a nuôi cấy tế bào động vật Mặc dù tiềm ng dụng c a nuôi cấy tế bào động vật lớn, việc nuôi cấy s lượng lớn tế bào động vật thư ng... tiền - Tế bào động vật phần c a mơ tổ ch c (phân hóa) thể đơn bào riêng biệt vi sinh vật - Hầu hết tế bào động vật sinh trư ng gắn bề mặt Các dịng tế bào động vật có vú đặc điểm c a Các tế bào động

Ngày đăng: 12/12/2022, 09:17

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w