tách dòng gen

CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ I. I. Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ tổ hợp) hợp) II. Nghiên cứu gen tách dòng II. Nghiên cứu gen tách dòng III. Kỹ thuật PCR III. Kỹ thuật PCR I. I. Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ hợp) hợp)  A. Khái niệm  B. Enzym giới hạn  C. Vector tách dòng A. Khái niệm A. Khái niệm - Tách dòng gen là quá trình phân lập một gen → véctơ tách dòng → tế bào chủ để nhân lên thành nhiều bản sao. - Để tách dòng gen cần: - + ADN (gen) cần tách dòng - + Enzym giới hạn - + Vector tách dòng - + Thể nhận (vi khuẩn) - + Các enzym khác (Các E. làm đứt gãy liên kết phosphodieste, nối ADN, E. bảo vệ, giãn xắn, đóng xoắn ADN ) B. Enzym giới hạn: B. Enzym giới hạn: Phát hiện Phát hiện enzym giới hạn enzym giới hạn  Hiện tượng giới hạn và sửa đổi: - Hiện tượng giới hạn vật chủ: Phagơ sinh trưởng ở vật chủ này không có khả năng sinh trưởng trên vật chủ khác dù đó đã từng là vật chủ của nó. - Cơ chế: Hai loại enzym tham gia vào quá trình này: Enzym giới hạn cắt ADN ngoại lai ở những vị trí xác định và enzym giới hạn sửa đổi ADN ngoại lai (methyl hóa ADN ở những vị trí xác định) để sửa đổi nó phù hợp vật chủ mới. B. Enzym giới hạn B. Enzym giới hạn  Các enzym giới hạn có hai đặc tính:  Không cắt các liên kết phophodieste ở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân tử ADN.  Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù, thường gồm 4 – 8 nucleotit, tạo ra các đoạn ADN có đầu dính (bổ trợ) hoặc đầu bằng. Ví dụ: Eco RI thường cắt ở trình tự đọc theo chiều xuôi – ngược như nhau. Một số enzym giới hạn và tính chất Một số enzym giới hạn và tính chất Tên enzym Tên enzym Nguồn vi khuẩn Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết Trình tự nhận biết trên ADN trên ADN Số Số nucleotit nucleotit của đoạn của đoạn trình tự trình tự nhận biết nhận biết Cắt đầu dính: Cắt đầu dính: Sau Sau 3A 3A Eco Eco RI RI Bam Bam HI HI Not Not I I Sac Sac I I Hae Hae III III Staphilococus aureus 3A Staphilococus aureus 3A Escherichia coli Escherichia coli Bacillus amiloliquefaciens Bacillus amiloliquefaciens Norcadio otitidis-caviarum Norcadio otitidis-caviarum Streptomyces Streptomyces achromogenes achromogenes Haemophilus aegyptius Haemophilus aegyptius 5’- 5’- ↓ ↓ GATC- 3’ GATC- 3’ 3’- CTAG 3’- CTAG ↑ ↑ -5’ -5’ 5’-G 5’-G ↓ ↓ AATT C-3’ AATT C-3’ 3’-C TTAA 3’-C TTAA ↑ ↑ G-5’ G-5’ 5’-G 5’-G ↓ ↓ GATC C-3’ GATC C-3’ 3’-C CTAG 3’-C CTAG ↑ ↑ G-5’ G-5’ 5’-G 5’-G ↓ ↓ CGGCCG C-3’ CGGCCG C-3’ 3’-C GCCGGC 3’-C GCCGGC ↑ ↑ G-5’ G-5’ 5’-G AGCT 5’-G AGCT ↓ ↓ C-3’ C-3’ 3’-C 3’-C ↑ ↑ TCGA G-5’ TCGA G-5’ 5’-G CGT 5’-G CGT ↓ ↓ C-3’ C-3’ 3’-C 3’-C ↑ ↑ GC G-5’ GC G-5’ 4 4 6 6 6 6 8 8 6 6 4 4 Cắt đầu bằng Cắt đầu bằng Hpa Hpa I I Sca Sca I I Haemophilus Haemophilus paraipluenzae paraipluenzae Streptomyces caespitosus Streptomyces caespitosus 5’-GTT 5’-GTT ↓ ↓ AAC-3’ AAC-3’ 3’-CAA 3’-CAA ↑ ↑ TTG-5’ TTG-5’ 5’-AGT 5’-AGT ↓ ↓ ACT-3’ ACT-3’ 3’-TCA 3’-TCA ↑ ↑ TGA-5’ TGA-5’ 6 6 6 6 C. Vector tách dòng: Đặc điểm C. Vector tách dòng: Đặc điểm 1. Phải có trình tự khởi đầu sao chép để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ. 2. Có thể nhận biết nhờ các gen chỉ thị/hoặc gen đánh dấu (phải có dấu chuẩn chọn lọc). 3. Có vị trí gắn phân tử ADN ngoại lai (vị trí đa tách dòng – Multicloning site / MCS). Vị trí đa tách dòng Vị trí đa tách dòng VÉCTƠ PLASMID - Kích thước 1 – 200 kb, sợi kép, vòng. - pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế, có 21 điểm cắt cho các enzym giới hạn, cho phép mang đoạn ADN cài đến 6 kb. [...]... trúc đơn giản hơn ADN hệ gen  Sơ đồ tách dòng cADN CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ I Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ hợp) II Nghiên cứu gen tách dòng Nghiên cứu gen tách dòng 1 2 3 Dò tìm gen trong ngân hàng gen Lập bản đồ giới hạn Giải trình tự đoạn ADN tách dòng Dò tìm gen trong ngân hàng gen - Có một số phương pháp để tìm dòng gen mong muốn trong ngân hàng hệ gen: - (1) Mẫu dò ADN từ... cấy trên môi trường chọn lọc, hoặc sử dụng các gen chỉ thị /gen đánh dấu Các bước chính để tách dòng gen TÁCH DÒNG GEN VÀ XÂY DỰNG NGÂN HÀNG HỆ GEN Có hai loại ngân hàng gen: 1) Ngân hàng hệ gen và 2) Thư viện cADN - Ngân hàng ADN hệ gen  Có mặt tất cả các trình tự trong hệ gen của tế bào  Các gen có trình tự các nucleotit và cấu trúc giống như trong hệ gen của tế bào trong tự nhiên, bao gồm cả các... để tách dòng gen     Phân lập gen: Tách ADN tổng số → cắt bằng enzym giới hạn thích hợp ở hai đầu (thường dùng chung với véctơ) Chọn véctơ tách dòng: tùy kích thước đoạn gen và tế bào chủ mà có thể chọn các véctơ plasmid, phage, cosmid, YAC… Tạo véctơ tái tổ hợp và nhân dòng: sử dụng DNA/RNA ligase (vd T4 DNA ligase) gắn véctơ với gen phân lập Chuyển vào tế bào chủ để nhân lên Chọn lọc các dòng. .. sinh vật khác Ví dụ dùng gen insulin đã biết trình tự của lợn để dò tìm gen của người - (2) Mẫu dò từ sản phẩm của gen (ví dụ: enzym hoặc protein) tổng hợp một đoạn mARN, rồi ADN để làm mẫu dò Kỹ thuật Southern blotting  Kỹ thuật này dùng để phát hiện gen cần tìm Nghiên cứu gen tách dòng 1 2 3 Dò tìm gen trong ngân hàng gen Lập bản đồ giới hạn Giải trình tự đoạn ADN tách dòng Lập bản đồ giới hạn... eukaryote - Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích thước lớn (> 10 kb) VÉCTƠ PHAGE     Phần lớn xuất phát từ phage λ: phần trung tâm hệ gen phage λ mang các gen liên quan đến quá trình gây tan vật chủ bị thay bằng ADN ngoại lai Kích thước khoảng 48,5 kb Có thể mang các đoạn ADN cài đến ~20 kb (virut có thể đóng gói ADN đến 4050 kb) Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh Có thể tách dòng ở cả prokaryote... chẳng hạn ở eukaryote - Các véctơ con thoi đặc biệt có hiệu quả khi nghiên cứu đặc tính các gen đồng thời ở prokaryote (vd E coli) và eukaryote (vd Saccharomyces cerevisiae) NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC) Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ... đệm, trình tự liên gen và các trình tự không mã hóa (intron)  Ở sinh vật nhân chuẩn, phần lớn các trình tự ADN là các trình tự không mã hóa cho protein, như các đoạn trình tự lặp lại, các trình tự đệm, các trình tự điều khiển, bên cạnh đó là các gen cấu trúc  ADN hệ gen là cấu trúc ADN đầy đủ và phức tạp của tế bào - Thư viện cADN  Chỉ là tập hợp nhỏ một phần của hệ gen, gồm các gen được biểu hiện... tìm gen trong ngân hàng gen Lập bản đồ giới hạn Giải trình tự đoạn ADN tách dòng Lập bản đồ giới hạn  Bản đồ giới hạn của đoạn ADN tách dòng là sơ đồ cho thấy số điểm cắt và vị trí tương đối của các điểm cắt bởi enzym giới hạn trên đoạn ADN đó Giải trình tự đoạn ADN tách dòng Phương pháp Sanger (1970) hay phương pháp dideoxy  - - Nguyên tắc: Loại bỏ nhóm 3’OH ở đường deoxyribose của các deoxyribonucleotite... plasmid thuộc thế hệ thứ 3 * Chứa cả điểm khởi đầu sao chép của phage M13 * Thường mang dấu chuẩn là Ampr và LacZ Sàng lọc xanh-trắng  pUC mang gen LacZ trong vùng điều hòa ngược dòng Khi ADN ngoại lai xen vào điểm cắt gới hạn, nó phá vỡ khung đọc của gen βgalactosidase, làm cho vi khuẩn không tổng hợp được enzym này để phân hủy cơ chất 5-bromo-4chloro-3-indodyl-βgalactosidase (gọi tắt là X-gal)... (ddNTP) Khi ddNTP gắn vào chuỗi đang tổng hợp thỉ quá trình tổng hợp dừng lại Giải trình tự đoạn ADN tách dòng Đánh dấu phóng xạ 1 Mồi oligonucleotide + ADN polymerase, dATP, dGTP, dCTP & dTTP 2 3 Chia hỗn hợp vào 4 ống rồi bổ sung mỗi loại ddNTP vào mỗi ống 4 5 Gây biến tính ADN đã được tinh sạch để tách hai mạch Trộn với mồi đã được đánh dấu phóng xạ Chia dung dịch trên vào 4 ống nghiệm có bổ sung . I. Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ tổ hợp) hợp) II. Nghiên cứu gen tách dòng II. Nghiên cứu gen tách dòng III niệm - Tách dòng gen là quá trình phân lập một gen → véctơ tách dòng → tế bào chủ để nhân lên thành nhiều bản sao. - Để tách dòng gen cần: - + ADN (gen)