tách dòng gen

Một số enzym giới hạn và tính chấtTên enzym Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết trên ADN Số nucleotit của đoạn trình tự nhận biết Streptomyces achromogenes Haemophilus aegyptius Cắt đầu

CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ

I Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái

tổ

hợp)

II Nghiên cứu gen tách dòng

III Kỹ thuật PCR

I Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ hợp)

 A Khái niệm

 B Enzym giới hạn

 C Vector tách dòng

A Khái niệm

kết phosphodieste, nối ADN, E bảo vệ, giãn xắn, đóng xoắn ADN )

B Enzym giới hạn: Phát hiện

enzym giới hạn

 Hiện tượng giới hạn và sửa đổi :

- Hiện tượng giới hạn vật chủ: Phagơ sinh trưởng ở vật chủ này không có khả năng sinh trưởng trên vật chủ khác dù đó đã từng là vật chủ của nó.

- Cơ chế: Hai loại enzym tham gia vào quá trình này: Enzym giới hạn cắt ADN ngoại lai ở những vị trí xác định và enzym giới hạn sửa đổi ADN ngoại lai (methyl hóa ADN ở những vị trí xác định) để sửa đổi

nó phù hợp vật chủ mới.

B Enzym giới hạn

 Các enzym giới hạn có hai đặc tính:

đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên

trong phân tử ADN.

thường gồm 4 – 8 nucleotit, tạo ra các đoạn ADN có đầu dính (bổ trợ) hoặc đầu bằng.

Ví dụ: Eco RI thường

cắt ở trình tự đọc theo chiều xuôi – ngược như nhau

Một số enzym giới hạn và tính chất

Tên enzym Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết

trên ADN Số nucleotit

của đoạn trình tự nhận biết

Streptomyces achromogenes Haemophilus aegyptius

Cắt đầu bằng

HpaI Haemophilus 5’-GTT↓AAC-3’

C Vector tách dòng: Đặc điểm

1 Phải có trình tự khởi

đầu sao chép để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ

2 Có thể nhận biết nhờ

các gen chỉ thị/hoặc gen đánh dấu (phải

có dấu chuẩn chọn lọc).

3 Có vị trí gắn phân tử

ADN ngoại lai (vị trí

đa tách dòng – Multicloning site / MCS).

Vị trí đa tách dòng

21 điểm cắt cho các enzym giới hạn, cho phép mang đoạn ADN cài đến 6 kb.

VÉCTƠ PLASMID pUC

* Nhóm pUC là nhóm véctơ plasmid

thuộc thế hệ thứ 3.

* Chứa cả điểm khởi đầu sao chép của phage M13.

* Thường mang dấu chuẩn là Ampr và

LacZ.

Sàng lọc xanh-trắng

 pUC mang gen LacZ

trong vùng điều hòa ngược dòng Khi ADN ngoại lai xen vào điểm cắt gới hạn, nó phá vỡ khung đọc của gen β - galactosidase, làm cho vi khuẩn không tổng hợp được enzym này để phân hủy cơ chất 5-bromo-4-

chloro-3-indodyl- β galactosidase (gọi tắt

-là X-gal) -làm cho cơ chất có mầu trắng (khuẩn lạc trắng).

VÉCTƠ PLASMID

Ưu điểm

- Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ.

- Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.

- Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh.

Nhược điểm

- Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.

- Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.

- Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích thước lớn (> 10 kb).

VÉCTƠ PHAGE

 Phần lớn xuất phát từ phage λ : phần trung tâm

hệ gen phage λ mang các gen liên quan đến quá

trình gây tan vật chủ bị thay bằng ADN ngoại lai.

 Kích thước khoảng 48,5 kb.

cài đến ~20 kb (virut có thể đóng gói ADN đến 40-

50 kb)

chủ nhanh Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.

VÉCTƠ PHAGE

Ưu điểm:

- Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.

- Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.

- Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd

VÉCTƠ COSMID

- Là véctơ lai của plasmid và phage λ , mang các ưu điểm của hai véctơ này: (1) khả năng tự tái bản số

lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage

- Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 35 – 45 kb.

VÉCTƠ COSMID

VÉCTƠ CON THOI

- Các véctơ plasmid, phage

và cosmid cần các trình tự khởi đầu sao chép khác

nhau tùy theo từng loại tế

bào chủ (trừ E coli)

- Các véctơ con thoi có thể

sao chép trong cả E coli

cũng như những tế bào khác, chẳng hạn ở

eukaryote

- Các véctơ con thoi đặc biệt

có hiệu quả khi nghiên cứu đặc tính các gen đồng thời

ở prokaryote (vd E coli)

và eukaryote (vd

Saccharomyces cerevisiae)

NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC)

Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn

ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd

gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo có thể mang các đoạn cài ADN dài

từ 200 đến 500 kb Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền.

NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC)

- Về cơ bản giống với nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo nhưng được tạo ra từ nhân tố giới tính

F Giống với YAC, BAC có thể mang các đoạn cài lớn, nhưng ngoài ra có khả năng sao chép

trong E coli giống như các

véctơ plasmid, λ , cosmid.

- Vi khuẩn A Tumefaciens - loại vi

khuẩn lây nhiễm chủ yếu thực vật hai lá mầm (như cà chua, thuốc

lá, đậu ) nhưng gần đây được biết chúng cũng lây nhiễm cả thực vật một lá mầm, lúa – có chứa plasmid Ti dài 200 kb (plasmid sinh khối u) Khi lây nhiễm, một phần của plasmid

Ti (là T-ADN) được lồng ghép vào ADN nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào thực vật

sinh trưởng không kiểm soát

Các bước chính để tách dòng

gen

 Phân lập gen: Tách ADN tổng số → cắt bằng

enzym giới hạn thích hợp ở hai đầu (thường dùng chung với véctơ).

 Chọn véctơ tách dòng: tùy kích thước đoạn

gen và tế bào chủ mà có thể chọn các véctơ plasmid, phage, cosmid, YAC…

 Tạo véctơ tái tổ hợp và nhân dòng: sử dụng

DNA/RNA ligase (vd T4 DNA ligase) gắn véctơ với gen phân lập Chuyển vào tế bào chủ để nhân lên.

 Chọn lọc các dòng tế bào mang véctơ tái tổ

hợp: bằng phương pháp nuôi cấy trên môi

trường chọn lọc, hoặc sử dụng các gen chỉ

thị/gen đánh dấu.

Các bước chính để tách dòng

gen

TÁCH DÒNG GEN VÀ XÂY DỰNG NGÂN HÀNG HỆ

GEN

Có hai loại ngân hàng gen: 1) Ngân hàng hệ gen và 2) Thư viện cADN

- Ngân hàng ADN hệ gen

 Có mặt tất cả các trình tự trong hệ gen của tế bào.

 Các gen có trình tự các nucleotit và cấu trúc giống như trong hệ gen

của tế bào trong tự nhiên, bao gồm cả các trình tự điều hòa, các trình

tự ADN đệm, trình tự liên gen và các trình tự không mã hóa (intron)

 Ở sinh vật nhân chuẩn, phần lớn các trình tự ADN là các trình tự

không mã hóa cho protein, như các đoạn trình tự lặp lại, các trình tự đệm, các trình tự điều khiển, bên cạnh đó là các gen cấu trúc.

 ADN hệ gen là cấu trúc ADN đầy đủ và phức tạp của tế bào.

- Thư viện cADN

 Chỉ là tập hợp nhỏ một phần của hệ gen, gồm các gen được biểu hiện.

 Các trình tự cADN phản ánh trình tự các sản phẩm mARN được hoàn

thiện sau quá trình phiên mã, không phải là trình tự thực sự và đầy

đủ của gen tương ứng trên phân tử ADN hệ gen (không có các trình tự điều khiển, như promoter, operator, enhancer, v.v…)

 Phần lớn cADN không phải là một bản sao có chiều dài đầy đủ của

chính phân tử mARN.

 Các protein được mã hóa bởi cADN có thể được tổng hợp (dịch mã)

trong một tế bào chủ mà ở đó không cần có bộ máy hoàn thiện phân

tử mARN (bao gồm quá trình cắt các intron).

 cADN có trật tự và cấu trúc đơn giản hơn ADN hệ gen.

 Sơ đồ tách dòng cADN

CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ

I Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái

tổ

hợp)

II Nghiên cứu gen tách dòng

Nghiên cứu gen tách dòng

1 Dò tìm gen trong ngân hàng gen

2 Lập bản đồ giới hạn

3 Giải trình tự đoạn ADN tách dòng

Dò tìm gen trong ngân hàng gen

- Có một số phương pháp để tìm dòng gen mong muốn trong ngân hàng hệ gen:

- (1) Mẫu dò ADN từ sinh vật khác Ví dụ dùng gen insulin đã biết trình tự của lợn

để dò tìm gen của người.

- (2) Mẫu dò từ sản phẩm của gen (ví dụ: enzym hoặc protein) tổng hợp một đoạn mARN, rồi ADN để làm mẫu dò.

Kỹ thuật Southern blotting

 Kỹ thuật này dùng để phát hiện gen cần tìm.

Nghiên cứu gen tách dòng

1 Dò tìm gen trong ngân hàng gen

3 Giải trình tự đoạn ADN tách dòng

Lập bản đồ giới hạn

 Bản đồ giới hạn của đoạn ADN tách dòng là sơ đồ cho thấy số điểm cắt và vị trí tương đối của các điểm cắt bởi enzym giới hạn trên đoạn

ADN đó.

Giải trình tự đoạn ADN tách

deoxyribonucleotite

để tạo ra các dideoxyribonucleotite (ddNTP).

- Khi ddNTP gắn vào chuỗi đang tổng hợp thỉ quá trình tổng hợp dừng lại.

Giải trình tự đoạn ADN tách

3. Chia dung dịch trên

vào 4 ống nghiệm

có bổ sung ddNTP (khoảng 1%) Phản ứng tổng hợp dừng lại khi mạch mới được bổ sung ddNTP.

4. Điện di trên gel

Giải trình tự đoạn ADN tách

dòng

Phân tích tự động trình tự base

 Kết quả từ một phản ứng giải trình tự ADN tự động

trình tự thu được từ một mẫu ADN với việc sử dụng một mồi nhất định

Giải trình tự ADN tự động

 Máy tính đọc trình tự bổ sung với mạch khuôn theo chiều từ trái qua phải (tương ứng chiều 5’ → 3’)

Chương trình máy tính tự động suy ra trình tự mạch khuôn Các nucleotide bị “nhiễu” được ghi là “N” và đôi khi có thể suy luận được bằng các kỹ thuật bổ

Giải trình tự ADN tự động

III Kỹ thuật PCR

 K B Mullis phát minh năm 1986

 Cho phép nhân nhanh chóng đoạn

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ giai đoạn gồm ba : gây biến tính – gắn mồi – tổng hợp.

Giai đoạn I

tách hai mạch của ADN rồi hạ nhiệt độ xuống khoảng 40 –

(nhiệt độ hạ xuống phụ thuộc vào hàm lượng GC của đoạn ADN cần nhân).

Giai đoạn 2

 Gây biến tính và làm lạnh

Polymerase tổng hợp mạch mới.

 Giai đoạn này sinh ra 4 ADN

Giai đoạn 3

gây biến tính và gắn mồi để tổng hợp tiếp.

ra 2 phân đoạn ADN có trình tự đúng gen đích.

tổng hợp.

1 bản sao

2 bản sao

4 bản sao