PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ ĐẤT Ở QUẬN NINH KIỀU, THÀNH PHỐ CẦN THƠ

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 34 (2014): 7-11 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ ĐẤT Ở QUẬN NINH KIỀU, THÀNH PHỐ CẦN THƠ Nguyễn Thị Hà1 Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 15/05/2014 Ngày chấp nhận: 30/10/2014 Title: Isolation and selection of some fungi having antibacterial activity from the soil of Ninh Kieu District, Can Tho City Từ khóa: Fusarium solani, gene ITS, hoạt tính kháng khuẩn, Penicillium pinophilum, vi sinh vật đất Keywords: Antibacterial activities, gene ITS, Fusarium solani, Penicillium pinophilum, soil fungi ABSTRACT This study aimed to isolate and characterize antibacterial fungi strains from soil samples collected in Ninh Kieu District, Can Tho City Seven fungi isolates exhibited high antibacterial activities towards bacterial pathogens, such as Bacillus subtilis, E coli, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila, were screened Among these isolates, two isolates exhibiting highest antibacterial activity were selected Based on morphological study, these two isolates belonged to Penicillium and Fusarium genus Furthermore, ITS sequence analysis and BLAST search results on NCBI genbank database revealed that two selected antibacterial fungi isolates were Penicillium pinophilum and Fusarium solani species TĨM TẮT Đề tài nhằm mục đích phân lập khảo sát hoạt tính kháng khuẩn số chủng nấm sợi từ đất quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ Xác định hoạt tính kháng khuẩn chủng nấm sợi phân lập phương pháp khối thạch loài vi khuẩn gây bệnh người động vật E coli, Bacillus subtillis, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri cho thấy ba bảy chủng nấm có hoạt tính kháng ba loại vi khuẩn kiểm định, qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch trích sinh khối ba chủng nấm kháng ba loại vi sinh vật kiểm định, tìm hai chủng nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao Định danh khảo sát hình thái kính hiển vi quang học vật kính 40X, giải trình tự gene ITS kết hợp sử dụng phần mềm BLAST ngân hàng gene NCBI cho thấy có khả hai chủng nấm thuộc loài Penicillium pinophilum Fusarium solani GIỚI THIỆU kháng nhiều loại KS thông thường, ngày xuất nhiều chủng VSV kháng thuốc nên việc điều trị kháng sinh trở nên khó khăn cho thầy thuốc lâm sàng Việc tìm kiếm CKS có nguồn gốc từ thiên nhiên, VSV tiết chống lại VSV gây bệnh lờn thuốc thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học, việc làm vơ cấp thiết quan trọng Chất kháng sinh (CKS) trở thành thần dược cứu sống người mà ứng dụng rộng rãi trồng trọt, chăn nuôi, công nghệ thực phẩm bảo vệ môi trường Ở nước ta nước phát triển việc lạm dụng thuốc KS, việc VK gây bệnh người Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Cơng nghệ Sinh học: 34 (2014): 7-11 thạch có VSVKĐ Đặt đĩa tủ lạnh từ 4h-8h, sau ủ nhiệt độ phòng 24h Xác định hoạt tính kháng sinh cách đo kích thước vịng vơ khuẩn D-d D đường kính vịng vơ khuẩn, d đường kính khối thạch D-d ≥ 25 mm mạnh, Dd < 15 mm yếu, D-d ≥ 20 mm mạnh, D-d = mm không kháng, D-d ≥ 15 mm trung bình (Đỗ Thu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp phân lập nấm sợi Bốn địa điểm khác quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ chọn để thu mẫu đất, lấy 50 g đất với độ sâu khoảng 5-7 cm cho vào bọc nilon, ghi đem trữ ngăn mát tủ lạnh Đồng mẫu: cân mẫu đất thu thập, mẫu g đất cho vào ống nghiệm chứa ml nước cất Pha loãng theo mức độ 10-1, 10-2, 103 , 10-4 lần, lấy 0,1 ml dung dịch nồng độ pha loãng khác cấy trang lên mơi trường YEA có bổ sung chất kháng khuẩn chloramphenicol 0,01%, ủ mẫu tủ ủ vi sinh vật nhiệt độ 300C 48 Tiếp tục phân lập đến ròng (Choi, Hà, 2004) 2.3.2 Phương pháp đục lỗ Cấy dòng nấm sợi phân lập rịng vào bình tam giác chứa 20 ml YEA dịch thể Ủ nhiệt độ phòng, sau 3-5 ngày thu dịch nuôi cấy Cấy trải VSV kiểm định lên môi trường tương ứng Dùng khoan nút chai khoan lỗ đĩa có VSV kiểm định Dùng pipet hút 0,1 ml dịch nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu cho vào lỗ khoan Đặt đĩa tủ lạnh từ 4-8 giờ, ủ nhiệt độ phịng ngày, xác định hoạt tính kháng sinh cách đo đường kính vịng vơ khuẩn D-d (mm) 1999) 2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái nấm sợi Hình thái đại thể: Cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau ngày cho ml nước cất vô trùng vào ống giống, lăn nhẹ ống giống lòng bàn tay để bào tử thấm nước tạo thành dịch huyền phù Sau dùng que cấy vơ trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù cấy điểm vào đĩa petri có đổ lớp mỏng mơi trường MEA Ủ nhiệt độ 300C, quan sát khuẩn lạc ngày đặc điểm sau: tốc độ phát triển khuẩn lạc, màu sắc biến đổi màu sắc bào tử, hình dáng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc sợi nấm 2.3.3 Định danh chủng nấm sợi phân lập Chủng nấm sợi có khả sinh kháng sinh nuôi môi trường YEA, sau định danh sơ phương pháp quan sát hình thái với đặc điểm như, dạng bìa, màu sắc, kích thước, hình dạng bề mặt khuẩn lạc Ngồi mẫu cịn làm tiêu xem kính hiển vi để quan sát hệ sợi nấm, bào tử Phương pháp làm tiêu bản: Dùng dao lam lấy 0.5x0.5cm diện tích agar có nấm sợi đặt lên lam nhuộm với 30 µl thuốc nhuộm cotton blue 30 phút Sau dùng lamell đậy lại (tránh bọt khí) xem kính hiển vi vật kính 40X Sau đó, đặc điểm hình thái chủng nấm sợi có khả sinh kháng sinh so sánh với đặc điểm hình thái chủng nấm sợi với khóa phân loại Nguyễn Đức Lượng (2003) Hình thái vi thể: Đặt miếng thạch mỏng (MT5) có kích thước 0,5x0,5cm lên miếng lam vô trùng đặt đĩa petri miếng giấy lọc làm ẩm nước cất vơ trùng Sau cấy nấm sợi vào góc đối miếng thạch, đậy lamell lên, đậy nắp đĩa petri lại ủ nhiệt độ phòng ngày Lấy lam ra, nhuộm nấm phương pháp nhuộm kép với acetocarmin fushin, sau quan sát kính hiển vi vật kính 40X 100X đặc điểm sau: hình dạng sợi nấm: màu sắc, có hay khơng có vách ngăn, có phân nhánh hay khơng, đặc điểm quan sinh bào tử, hình dáng bào tử 2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 2.3.1 Phương pháp khối thạch Chủng nấm sợi sau định danh sơ đặc điểm hình thái gởi định danh phương pháp sinh học phân tử phịng thí nghiệm Sinh học phân tử Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Kết định danh phương pháp dựa giải trình tự vùng ITS so sánh với sở liệu Genebank trang web NCBI công cụ BLAST SEARCH Cấy dòng nấm sợi phân lập ròng MT MEA, ủ nhiệt độ phòng từ 3-4 ngày Dùng khoan nút chai vô trùng khoan khối thạch có đường kính mm Chuẩn bị MT môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (MPA), đổ môi trường thành lớp thạch mỏng lên đĩa Petri, cấy trải VSVKĐ lên bề mặt Dùng kim mũi mác lấy khối thạch chứa chủng nấm sợi nghiên cứu đặt lên đĩa KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm Từ bốn mẫu đất thu thập từ khu vực khác Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ, phân lập 11 chủng nấm sợi Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 34 (2014): 7-11 3.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn kháng VSVKĐ theo phương pháp khối thạch (Hình 1) để tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh Các chủng VSVKĐ Aeromonas Hydrophila Edwardsiella Ictaluri (VSV gây bệnh cá tra) hai chủng gây bệnh người động vật chủng B subtillis E coli Kết trình bày Bảng Những chủng có hoạt tính kháng khuẩn tốt tuyển chọn từ 11 chủng nấm sợi phân lập Quá trình tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ tiến hành theo bước: bước 1, 11 chủng nấm sợi sàng lọc hoạt tính Hình 1: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chủng nấm sợi phương pháp khối thạch với B subtillis VSVKĐ A VT3.1, B VR1.1 Bảng 1: Hoạt tính kháng khuẩn nấm sợi phương pháp khối thạch STT 10 11 KH Chủng VT3.1 VC1.3 DH2.3 VR1.1 VC2.4 NK6 VC2.3 CK VC2.2 VC3.2 DH2.2 B subtilis 35 10 17 17 0 18 Hoạt Tính kháng VSVKĐ (D – d, mm) E coli Aeromonas Hydrophila Edwardsiella Ictaluri 18 0 0 30 10 10 0 30 0 0 0 0 0 0 0 0 Ghi chú: D = đường kính vịng vơ khuẩn, d = đường kính lỗ đục đĩa thạch chủng VC2.4 có hoạt tính kháng B subtillis E coli dạng trung bình, NK6 có hoạt tính kháng B subtillis E coli mạnh khơng có khả kháng hai vi khuẩn cịn lại Đối với CK DH2.2 kháng B.subtillis mức độ trung bình Qua kết thấy chủng VT3.1, DH2.3 có hoạt tính kháng khuẩn cao, VR1.1 hoạt tính kháng khuẩn khơng cao có khả kháng ba loại VSVKĐ Vì vậy, ba chủng chọn để xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch trích sinh khối nấm bước Dựa vào kết xác định đường kính vịng kháng khuẩn Bảng cho thấy, số 11 chủng nấm có bốn chủng khơng thể hoạt tính kháng VSVKĐ Những chủng cịn lại thể hoạt tính khác chủng VKKĐ khác Chủng VT3.1 có khả kháng vi khuẩn B subtillis mạnh, kháng E coli trung bình có khả kháng Aeromonas Hydrophila thấp Cịn chủng DH2.3 có khả kháng E coli mạnh kháng B subtillis thấp VT3.1, ngồi chủng cịn kháng Aeromonas Hydrophila Edwardsiella Ictaluri Tương tự chủng VT3.1, chủng VR1.1 kháng ba loại VSVKĐ hoạt tính yếu Còn hai Ở bước hai, ba chủng nấm (VT3.1, DH2.3, VR1.1) nuôi cấy điều kiện Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 34 (2014): 7-11 thời gian tuần, nhiệt độ phịng (30-320C) Dịch ni cấy nấm sau ly tâm loại bỏ xác tế bào sử dụng để xác định hoạt tính kháng A khuẩn phương pháp đục lỗ thạch (Hình 2) Hoạt tính kháng VSVKĐ trình bày Bảng B C D-d D-d D-d Hình 2: Hoạt tính kháng khuẩn dịch trích sinh khối chủng VT3.1, DH2.3, VR1.1 phương pháp đục lỗ thạch môi trường MT MPA VT3.1(VSVKĐ: B.Subtillis), B DH2.3(VSVKĐ: E.Coli), C VR1.1(VSVKĐ: E.Coli) Bảng 2: Hoạt tính kháng VSVKĐ dịch trích sinh khối chủng VT3.1, DH2.3, VR1.1 môi trường MT YEA STT KH Chủng VT3.1 DH2.3 VR1.1 B subtilis 40 15 Hoạt Tính kháng VSVKĐ (D-d, mm) E coli Aeromonas Hydrophila Edwardsiella Ictaluri 20 36 10 10 Ghi chú: D = đường kính vịng vơ khuẩn, d = đường kính lỗ đục đĩa thạch 3.3 Định danh chủng nấm VT3.1 DH2.3 phương pháp sinh học phân tử Kết sàng lọc bước hai cho thấy, ba chủng VT3.1, DH2.3, VR1.1 chọn để xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch trích sinh khối, chủng VT3.1 có hoạt tính kháng VSVKĐ B subtilis mạnh với đường kính vịng vơ khuẩn lớn 40 mm Riêng chủng VR1.1 có hoạt tính kháng VSVKĐ yếu Kết khảo sát cho thấy chủng VT3.1 DH2.3 có khả ức chế VK G (+) lẫn VK G (-), đặc tính đặc biệt chủng nấm sợi Ngoài chủng nấm VT3.1 cịn có khả ức chế vi khuẩn Aeromonas Hydrophila chủng DH2.3 có khả ức chế vi khuẩn Aeromonas Hydrophila lẫn vi khuẩn Edwardsiella Ictaluri gây bệnh cá tra Chủng nấm VT3.1 chủng nấm DH2.3 gởi định danh phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Trình tự ITS chủng nấm VT3.1 có tổng số 533 nucleotide giải trình tự cặp mồi White et al (1990): (ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’; ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) Kết giải trình tự cho thấy ITS chủng nấm sợi VT3.1 có trình tự sau: Như vậy, sau bước sàng lọc hai chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ tốt chủng VT3.1 DH2.3 chọn để định danh phương pháp sinh học phân tử TATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCAC CGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGCAC GTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCGC TGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGA GTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACA ATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAG AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGA 10 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 34 (2014): 7-11 ATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACTTTGCGCCCCCTGGCATTCCG GGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTG CCCTCAAGCACGGGTTGGTGTGTTGGGTGT GGTCCCCCCGGGAACCTACCCAAAAGGAA GCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTA TGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACC TGCGGGGGTTGGTCACCACCACATTTTACC ACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTAC CCGCTGAACTTAAAGCATATCAATAAGCGG GAAGAAA Như vậy, hai chủng nấm có hoạt tính kháng khuẩn cao vừa phân lập từ đất vùng trũng hẻm 51, đường 3.2, quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ (VT3.1), đất khuôn viên Trường ĐHCT (DH 2.3) có khả thuộc lồi Penicillium pinophilum Fusarium solani tương ứng KẾT LUẬN Đã phân lập 11 chủng nấm sợi từ đất thu thập quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ, có chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn E Coli, chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn B subtilis Về mặt hình thái chủng thuộc giống Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma Alternaria Hai chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao chọn thuộc hai loài khác Penicillium pinophilum Fusarium solani Sử dụng BLAST so sánh trình tự đoạn gene với trình tự gene ITS chủng nấm biết ngân hàng gene NCBI cho thấy, chủng VT3.1 xác định có độ mức tương đồng gene ITS cao (100%) với chủng Penicillium pinophilum SGE75 Trình tự ITS chủng nấm DH2.3 có tổng số 533 nucleotide giải trình tự cặp mồi White et al (1990): LỜI CẢM TẠ Cám ơn Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện vật chất cho thí nghiệm, cám ơn sinh viên Lâm Thị Thúy Huỳnh tham gia thực đề tài ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’; ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Chủng nấm sợi DH2.3 có kết giải trình tự ITS sau: TÀI LIỆU THAM KHẢO Choi, Y.W., Hyde, K.D and Ho, W.H 1999 Single spore isolation of fungi Fungal Diversity 3: 29-38 Đỗ Thu Hà 2004 Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng Luận án tiến sĩ Khoa Học, ĐHSP Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết 2003 Thí nghiệm cơng nghệ sinh học NXB ĐH Quốc gia, TP HCM, Tập - Thí nghiệm vi sinh vật học White, T J., T Bruns, S Lee, and J W Taylor 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics Pp 315-322 ACATACCTAAAACGTTGCTTCGAGCGGG AACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGAGC CCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCA TTATGTTTCTTCTGAGTAAAACAAGCAAAT AAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA ATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC AGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT GCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCT GTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCC CGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGAGGCG CCCCCTGCGGGCACACGCCGTCCCCCAAAT ACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTG CGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAG CGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAAC TTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGA ATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAA CGGAGGAC Kết tra cứu BLAST NCBI cho thấy dòng DH2.3 xác định có độ tương đồng với dịng Fusarium solani genomic DNA containing partial ITS gene mức 98% 11 ... lạc, màu s? ??c biến đổi màu s? ??c bào tử, hình dáng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc s? ??i nấm 2.3.3 Định danh chủng nấm s? ??i phân lập Chủng nấm s? ??i có khả sinh kháng sinh ni mơi trường YEA, sau định danh s? ? phương... định danh phương pháp dựa giải trình tự vùng ITS so s? ?nh với s? ?? liệu Genebank trang web NCBI cơng cụ BLAST SEARCH Cấy dịng nấm s? ??i phân lập ròng MT MEA, ủ nhiệt độ phòng từ 3-4 ngày Dùng khoan... B DH2.3(VSVKĐ: E.Coli), C VR1.1(VSVKĐ: E.Coli) Bảng 2: Hoạt tính kháng VSVKĐ dịch trích sinh khối chủng VT3.1, DH2.3, VR1.1 mơi trường MT YEA STT KH Chủng VT3.1 DH2.3 VR1.1 B subtilis 40 15 Hoạt