LUẬN văn THẠC sĩ phân tích ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê dạng hít sevoflurane

TỔNG QUAN

Thuốc gây mê đường hô hấp dùng trong phẫu thuật

Câu chuyện về thuốc gây mê đường hô hấp bắt đầu khi ether được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1540, sau đó là nitơ oxit (N2O – khí cười) được ghi nhận có khả năng gây mê [37, 40] Mặc dù vậy, cả N2O và ether đều không được sử dụng trong gây mê phẫu thuật cho đến giữa thế kỷ 19, nhờ William Morton chứng minh tính chất gây mê của diethyl ether vào năm 1846 [32, 37] Lần lượt các thuốc gây mê bao gồm ether, N2O, chloroform, ethylene, cyclopropane, trichloroethylene và divinyl ether được đưa vào thực hành lâm sàng Tuy nhiên, một số thuốc này đã bị ngừng sử dụng do có mùi khó chịu, dễ cháy nổ, biên độ an toàn hẹp và gây ra nhiều tác dụng phụ [3, 40] Vào những năm 1950, fluroxene – tác nhân flo hóa đầu tiên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng Fluroxene có khả năng gây mê tốt trên động vật thí nghiệm nhưng đã bị thu hồi vào năm 1974 do nguy cơ gây cháy nổ của thuốc Theo sau đó, các thuốc gây mê gồm halothane, methoxyflurane, enflurane, isoflurane, sevoflurane và desflurane lần lượt được tổng hợp, mở ra cuộc cách mạng của các thuốc gây mê halogen hóa [32, 37]

Hiện nay, vai trò của nitơ oxit trong gây mê cân bằng hiện đại vẫn gây tranh cãi [32] Các thuốc gây mê halogen được sử dụng phổ biến hiện nay là isoflurane, sevoflurane, desflurane Ngoài ra, xenon – một loại khí gây mê lý tưởng đã được nghiên cứu thử nghiệm vào năm 1951 Tuy nhiên, do chi phí sản xuất lớn nên việc sử dụng thuốc còn hạn chế [3, 43]

1.1.2 Định nghĩa, phân loại và vai trò của thuốc gây mê đường hô hấp

Thuốc gây mê đường hô hấp là một loại thuốc cơ bản được sử dụng trong gây mê cân bằng hiện đại, gây mê phẫu thuật và giảm đau [32, 42] Thuốc gây mê đường hô hấp có hai loại: thể khí (N2O, xenon) và thể lỏng hóa hơi (halothane, enflurane, isoflurane, sevoflurane, desflurane) Lợi ích rõ ràng của thuốc gây mê là làm cho bệnh nhân mất cảm giác hoặc nhận thức về cơn đau, giãn cơ mà vẫn duy trì được các chức năng sống (tuần hoàn, hô hấp, chuyển hóa, bài tiết…) Trước và trong quá trình phẫu thuật, bác sĩ gây mê sẽ kiểm soát liên tục chức năng hô hấp và đường thở của bệnh nhân Điều này cho phép bác sĩ thực hiện phẫu thuật mà không gây đau đớn hoặc chấn thương tinh thần ở bệnh nhân Nhiều ca phẫu thuật không thể thực hiện được nếu bệnh nhân không được gây mê như phẫu thuật tim, ghép tạng và thay khớp [68]

1.1.3 Đặc điểm các thuốc gây mê đường hô hấp 1.1.3.1 Cấu trúc hóa học, đặc tính vật lý

Mỗi thuốc gây mê đường hô hấp đều có đặc tính hóa học như cấu trúc hóa học, trọng lượng phân tử và một số tính chất vật lý đặc trưng riêng cho từng loại như điểm sôi, tỷ trọng chất lỏng, áp suất hơi Bảng 1.1 tổng hợp đặc tính hóa học và vật lý của một số thuốc gây mê đường hô hấp như halothane, enflurane, isoflurane, desflurane, sevoflurane và nitơ oxit

Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của một số thuốc gây mê đường hô hấp [1, 32]

Tên thuốc Cấu trúc hóa học

Trọng lượng phân tử Điểm sôi °C ( ở 760 mmHg)

Tỷ trọng chất lỏng (g/ mL)

Thuốc gây mê dễ bay hơi (halothane, enflurane, isoflurane, desflurane, sevoflurane) có áp suất hơi thấp, điểm sôi cao, dễ hóa lỏng ở nhiệt độ phòng (20°C) Thuốc gây mê dạng khí (N2O, xenon) có áp suất hơi cao, nhiệt độ sôi thấp và tồn tại ở dạng khí khi ở nhiệt độ phòng [68] Áp suất riêng phần của isoflurane và sevoflurane ở nhiệt độ môi trường đủ để đạt được nồng độ thích hợp cho sử dụng lâm sàng với bình xịt thông thường Áp suất riêng phần của desflurane cao (Bảng 1.1), đòi hỏi sử dụng máy hóa hơi riêng mà trong máy hóa hơi này, desflurane được làm nóng để đạt được áp suất hơi 1400 mmHgvà áp suất hơi được điều chỉnh bởi hai điện trở biến thiên N2O tồn tại ở thể khí ở áp suất và nhiệt độ môi trường, có thể phân phối qua đồng hồ lưu lượng [32]

Bên cạnh áp suất hơi và nhiệt độ sôi, độ hòa tan là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến dược động học của thuốc gây mê đường hô hấp Desflurane có cấu trúc hóa học khác với isoflurane là trên gốc carbon  - ethyl gắn với flo thay cho clo Tương tự sevoflurane cũng được halogen hóa chỉ với flo Chính sự thay thế này làm độ hòa tan trong máu của desflurane và sevoflurane thấp hơn isoflurane, gần bằng độ hòa tan của N2O [10]

Như vậy, các đặc tính hóa lý của một thuốc gây mê dạng hít quyết định hiệu quả lâm sàng và cách thức sử dụng của chúng, cụ thể là việc đạt được nồng độ điều trị tại mô trong CNS Nồng độ tại vị trí ảnh hưởng có liên quan đến áp suất riêng phần của các tác nhân gây mê trong CNS, được biểu thị ở trạng thái cân bằng bởi nồng độ tại phế nang Ngoài ra còn liên quan đến khả năng hấp thu thuốc từ phổi với độ hòa tan là đặc tính cơ bản và quan trọng trong động học của các thuốc gây mê đường hô hấp [32, 66]

1.1.3.2 Đặc điểm dược động học

Yếu tố ảnh hưởng đến hấp thu và giải phóng thuốc gây mê đường hô hấp

Các thuốc gây mê đường hô hấp được đưa vào cơ thể qua trao đổi khí trong phế nang của phổi Sự hấp thu thuốc từ phế nang vào máu và phân phối vào các vị trí cảm ứng trong CNS là những yếu tố quan trọng quyết định dược động học của các thuốc này Về bản chất, sự hấp thu và giải phóng thuốc gây mê dạng hít phụ thuộc vào nồng độ thuốc trong phế nang và khả năng hấp thu của thuốc từ phế nang vào máu bởi tuần hoàn phổi Hai yếu tố này được trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ thuốc gây mê đường hô hấp trong phế nang và khả năng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu [43]

Nồng độ thuốc trong phế nang

Khả năng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu

(1) Nồng độ hít vào của thuốc: Nồng độ thuốc gây mê trong phế nang (FA) thay đổi phụ thuộc vào nồng độ thuốc hít vào (FI) FI càng lớn,

(1) Độ hòa tan (hệ số phân bố máu/ khí): Hệ số phân bố máu/ khí () phản ánh độ hòa tan của thuốc mê dễ bay hơi trong máu  là tỉ lệ nồng độ thuốc trong máu và khí khi áp suất riêng phần của chúng ở trạng thái cân bằng  càng lớn, độ hòa tan của thuốc trong máu càng cao, dẫn đến sự tăng hấp thu thuốc từ phế nang vào máu bởi tuần hoàn phổi Nồng độ thuốc trong máu tăng mà áp suất riêng phần của thuốc trong phế nang tăng chậm hơn, dẫn đến kéo dài thời gian gây mê và hồi phục sau gây mê  và khởi mê càng nhanh

Tăng thông khí phế nang làm tăng áp suất riêng phần của thuốc trong phế nang, dẫn đến gia tăng FA, tỉ lệ FA/ FI tăng nhanh (~ 1) và tốc độ khởi mê nhanh

(3) Dung tích cặn chức năng (FRC): Một phần FRC làm loãng nồng độ thuốc hít vào, áp suất riêng phần của thuốc giảm, dẫn đến tốc độ khởi mê chậm phụ thuộc vào nồng độ của các thành phần trong huyết thanh như: albumin, globulin, triglyceride và cholesterol

Các phân tử này liên kết với các phân tử thuốc gây mê, làm tăng độ hòa tan của thuốc trong máu

(2) Lưu lượng máu qua phổi (cung lượng tim): Nếu không có shunt, lưu lượng máu qua phổi bằng cung lượng tim

Cung lượng tim cao dẫn đến khả năng hấp thu thuốc gây mê từ phế nang vào máu lớn hơn và phân phối nhanh hơn đến các mô bao gồm cả hệ TKTW

(3) Chênh lệch áp suất riêng phần của thuốc gây mê trong phế nang và tĩnh mạch: Sự hấp thu thuốc gây mê ở mô gây ra sự khác biệt của áp suất riêng phần của thuốc trong phế nang và tĩnh mạch Sự chênh lệch này càng lớn, thời gian khởi mê càng chậm

(4) Hiệu ứng thuốc thứ hai: Khi phối hợp N2O và thuốc gây mê đường hô hấp khác, do khả năng hấp thu từ phế nang vào máu của N2O cao, làm tăng áp suất riêng phần của thuốc sử dụng đồng thời Tỉ lệ FA/ FI tăng làm tốc độ khởi mê tăng

Sự hấp thu thuốc gây mê ở mô phụ thuộc vào các yếu tố sau: Lưu lượng máu ở mô, khả năng hòa tan của thuốc ở mô và chênh lệch áp suất riêng phần của thuốc gây mê trong máu động mạch và mô Ở mô não, sự chênh lệch áp suất này cân bằng nhanh do được tưới máu nhiều Mô mỡ có mức độ tưới máu thấp nên cần thời gian dài hơn để cân bằng áp suất Ngoài ra, sự hấp thu cao và giải phóng chậm các phân tử thuốc gây mê từ mô mỡ dẫn đến tốc độ khởi mê chậm ở những bệnh nhân có khoang mỡ lớn Khả năng hòa tan của thuốc gây mê trong mô khác với trong máu, phụ thuộc vào ái lực với lipid của thuốc Tất cả các thuốc gây mê đường hô hấp hòa tan tốt trong mô mỡ và ít hòa tan trong các mô khác [32]

Phản ứng tăng thân nhiệt ác tính

Tăng thân nhiệt ác tính là một rối loạn gen liên quan đến thuốc (pharmacogenetic) của hệ cơ xương liên quan đến tăng chuyển hóa mất kiểm soát, có thể gây tử vong TTNAT xuất hiện ở những người nhạy cảm với một số thuốc gây mê đường hô hấp (halothane, isoflurane, sevoflurane, desflurane), thuốc giãn cơ succinylcholine nhất định hoặc do catecholamine sinh ra trong trường hợp căng thẳng Phần lớn bệnh nhân mắc bệnh cơ lõi trung tâm (CCD), bệnh multi – minicore (MmCD) và hội chứng King – Denborough dễ xuất hiện phản ứng

TTNAT Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chỉ ra bệnh nhược cơ của người Mỹ bản địa (Native American myopathy) liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT [25]

1.2.2 Đặc điểm dịch tễ học phản ứng tăng thân nhiệt ác tính 1.2.2.1 Tình hình phản ứng tăng thân nhiệt ác tính trên thế giới

Phản ứng TTNAT hiếm xảy ra với tỉ lệ dao động từ 1:15000 – 1:75000, có thể xuất hiện ngay lần đầu tiên bệnh nhân tiếp xúc với các tác nhân gây mê

TTNAT xuất hiện ở nam giới thường xuyên hơn so với nữ giới với tỉ lệ xấp xỉ 2:1

Số liệu thu thập được tại đơn vị TTNAT ở Leeds từ năm 1990 – 2014 đã chỉ ra kết quả xét nghiệm dương tính với TTNAT ở nam giới (42%) cao hơn so với nữ (37%) Điều này có thể là ngẫu nhiên do nam giới cần can thiệp phẫu thuật nhiều hơn nữ giới hoặc do can thiệp trên lâm sàng ở nam nhạy cảm với TTNAT hơn ở nữ [23, 25]

Tính nhạy cảm với TTNAT xuất hiện ở các cá nhân đến từ tất cả các nhóm dân tộc trên thế giới (Châu Á, Châu Âu, Trung Đông và Châu Phi) với mọi lứa tuổi khác nhau (từ sáu tháng tuổi đến 78 tuổi) Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở người trẻ tuổi với độ tuổi trung bình của các bệnh nhân trải qua phản ứng TTNAT là 18,3 tuổi Trong đó, trẻ em dưới 15 tuổi chiếm 52,1% trong các trường hợp

Vào cuối những năm 1970, sau khi giới thiệu thuốc đặc trị TTNAT (dantrolene), tỷ lệ tử vong do TTNAT đã giảm từ 80% xuống dưới 5% Tuy nhiên, trong thập kỷ đầu tiên của thế kỷ 21, tỷ lệ tử vong đã tăng lên 14% [23, 25] Mặc dù tỉ lệ xuất hiện TTNAT là rất thấp nhưng tỉ lệ mắc các bất thường về mặt di truyền liên quan đến tính nhạy cảm với TTNAT khoảng 1:2000 – 1:3000 [23, 80], với ước tính gần đây là một trong 400 cá thể [11] Các báo cáo đã chỉ ra rằng TTNAT không chỉ xảy ra ở người, mà còn được mô tả ở một số loài động vật khác như lợn, ngựa, chó [25]

1.2.2.2 Tình hình phản ứng tăng thân nhiệt ác tính tại Việt Nam

Tại Việt Nam, trong vòng 10 năm qua đã ghi nhận ca lâm sàng đầu tiên về phản ứng TTNAT được phát hiện và điều trị tại Bệnh viện E, được trình bày và phân tích ở Chương II và Chương III

1.2.3 Sinh lý bệnh tăng thân nhiệt ác tính

Bệnh nhân nhạy cảm với TTNAT có bất thường di truyền thụ thể ở cơ xương, gây tăng nồng độ cấp tính Ca 2+ nội bào cơ vân khi tiếp xúc với một số tác nhân gây mê Cơ chế gây ra phản ứng TTNAT của thuốc gây mê tương tác với các thụ thể bất thường này chưa được xác định, tuy nhiên có thể liên quan đến rối loạn vận chuyển Ca 2+ qua thụ thể ryanodine (RyR1) mà nguyên nhân chính là do chức năng bất thường của cặp kích thích – co cơ (excitation – contraction) (EC) [7, 19]

Phức hợp EC bao gồm hai thành phần: Thành phần thứ nhất là hệ thống ống T với thụ thể dihydropyridine (DHPR) nằm trên bề mặt màng hệ thống ống T, được mã hóa bởi gen CACNA1S và rất nhạy cảm với sự thay đổi điện thế của màng bao cơ

Các DHPR có cấu trúc giống với kênh canxi loại L, nhưng không có chức năng như kênh canxi mà hoạt động như một bộ phận cảm ứng điện thế Thành phần còn lại của EC là màng lưới nội chất của tế bào cơ có chứa các thụ thể RyR1 – kênh phóng thích Ca 2+ của hệ võng nội bào (sarcoplasmic reticulum – SR) Khi điện thế động truyền đến các cảm biến điện áp trong ống T (DHPR) gây ra thay đổi hình dạng của thụ thể này Các DHPR tương tác với RyR1 làm thay đổi hình dạng của RyR1, Ca 2+ được giải phóng vào tương bào cơ vân theo sự chênh lệch nồng độ, dẫn đến sự co cơ bằng cách bắt đầu liên kết ngang của các siêu sợi actin và myosin (Hình 1.1) [9, 18, 81]

Hình 1.1 Quá trình phóng thích và bắt lại Ca 2+ giữa võng nội bào và tương bào cơ vân [81]

Trong giai đoạn đầu của TTNAT, sự tăng phóng thích Ca 2+ được bù trừ bằng cách tăng bắt lại Ca 2+ vào SR nhằm duy trì cân bằng nội môi Tuy nhiên, hoạt động tái hấp thu Ca 2+ này thông qua một bơm phụ thuộc ATP (Ca 2+ - ATPase) Điều này làm tăng nhu cầu chuyển hóa glucose để cô lập Ca 2+ , gây ra sự tăng sản sinh CO2 và tiêu thụ O2 CO2 tăng làm tăng thân nhiệt, kích thích hệ thần kinh giao cảm dẫn đến kích thích tim – hô hấp Khi sự giải phóng Ca 2+ không thể kiểm soát, nồng độ Ca 2+ nội bào tăng gây hoạt hóa các sợi cơ và sự co cơ Sự gắn kết liên tục actin và myosin trong co cơ cần sự thoái giáng ATP dẫn đến chuyển hóa ngày càng tăng, quá trình sinh nhiệt tăng, độ cứng cơ tiến triển và tăng ly giải cơ vân

Rối loạn ban đầu là nhiễm toan hô hấp Ly giải cơ vân dẫn đến tăng kali máu, giải phóng creatine kinase (CK) và myoglobin gây loạn nhịp tim và suy thận cấp Tăng thân nhiệt và tiêu cơ vân có xu hướng gây đông máu nội mạch lan tỏa (DIC) [25,

1.2.4 Biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán và điều trị tăng thân nhiệt ác tính 1.2.4.1 Biểu hiện lâm sàng

TTNAT có thể xảy ra bất cứ thời điểm nào trong quá trình gây mê hoặc trong vòng 1 giờ hay lâu hơn sau khi chấm dứt quá trình gây mê Dấu hiệu sớm nhất là nhịp tim nhanh, tăng nồng độ CO2 cuối kỳ thở ra (ETCO2) kèm theo cứng cơ Nếu succinylcholine được sử dụng trong quá trình gây mê thì các biểu hiện lâm sàng diễn ra nhanh chóng hơn, tăng huyết áp, tăng nhiệt độ rõ rệt và rối loạn nhịp tim diễn ra trong vòng 5 đến 10 phút [25]

Trong hầu hết các trường hợp, các biểu hiện đầu tiên của TTNAT thường xảy ra trong phòng mổ Dấu hiệu ban đầu điển hình thường là ETCO2 tăng, nhịp tim nhanh, sau đó huyết áp có thể tăng thường liên quan đến rối loạn nhịp thất gây ra bởi kích thích hệ thống thần kinh giao cảm từ việc tăng nồng độ CO2 trong máu, nhiễm toan chuyển hóa Sau đó, bệnh nhân có biểu hiện cứng cơ, tăng trương lực cơ và nhiệt độ cơ thể có thể tăng 1-2 o cứ sau 5 phút Nếu không được điều trị kịp thời, thiếu máu cơ tim và tiêu cơ vân dẫn đến tăng K + máu, myoglobin niệu có thể dẫn đến suy thận cấp biểu hiện bằng nước tiểu màu cola và DIC [23, 25] Một số rối loạn trên lâm sàng phổ biến được tổng kết trong Hình 1.2

Hình 1.2 Biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh TTNAT [26]

Tăng nồng độ Ca 2+ nội bào trong cơ vân

Giảm oxy máu Nhịp tim nhanh Toan chuyển hóa Cạn kiệt ATP Tăng thân nhiệt

Tăng nồng độ CK và K + trong huyết thanh

Loạn nhịp tim Thiếu máu cục bộ Suy thận

Việc chẩn đoán TTNAT được dựa trên các biểu hiện lâm sàng hoặc các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm Những đặc trưng quan trọng trong chẩn đoán TTNAT là sự gia tăng không giải thích được của nồng độ ETCO2, cứng cơ, nhịp tim nhanh, toan chuyển hóa, tăng thân nhiệt và tăng K + máu Sự thay đổi trong thứ tự và thời điểm xuất hiện các biểu hiện làm cho chẩn đoán lâm sàng khó khăn hơn

Thang điểm lâm sàng được xây dựng bởi Larach và cộng sự để hỗ trợ cho chẩn đoán lâm sàng Các yếu tố được liệt kê trong Bảng 1.6 Mỗi yếu tố được cho một số điểm khác nhau Tuy nhiên, thang điểm thiếu độ nhạy do không phải yếu tố nào cũng được kiểm tra trong mỗi ca bệnh [25] Tổng cộng 50 điểm hầu như chắc chắn là TTNAT, tổng cộng từ 35-49 thì rất có thể là TTNAT

Bảng 1.6 Các tiêu chí được dùng trong thang điểm lâm sàng cho bệnh

Quá trình Biểu hiện Điểm

1 Độ cứng a Cứng cơ tổng quát (không có rung mình do hạ thân nhiệt, trong hoặc ngay sau khi dùng thuốc gây mê dạng hít)

15 b Co thắt Masseter ngay sau khi dùng succinylcholine 15

2 Suy nhược cơ bắp a Tăng CK > 20000 IU sau khi dùng thuốc mê có succinylcholine

15 b Tăng CK > 10000 IU sau khi dùng thuốc mê không có succinylcholine

15 c Nước tiểu màu cola trong giai đoạn phẫu thuật 10 d Myoglobin trong nước tiểu > 60 μg/L 5 e Myoglobin huyết thanh > 170 μg/L 5 f K + trong máu /huyết tương/huyết thanh > 6 mEq/L (không có suy thận)

3 Nhiễm toan hô hấp a PETCO2 > 55 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí được kiểm soát tốt

15 b PaCO2 động mạch > 60 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí được kiểm soát tốt

15 c PETCO2 > 60 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí tự phát 15 d PaCO2động mạch > 65 mmHg với sự lọc máu bằng dưỡng khí tự phát

15 e Tăng CO2 máu bất thường 15 f Thở nhanh bất thường 10

4 Tăng thân nhiệt a Tăng thân nhiệt nhanh bất thường 15 b Tăng thân nhiệt bất thường > 38,8°C (101,8°F) trong giai đoạn phẫu thuật

5 Liên quan tim a Nhịp xoang nhanh bất thường 3 b Nhịp tim nhanh hoặc rung tâm thất 3

Phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS)

Khởi đầu với phát hiện cơ bản đầu tiên về cấu trúc của DNA vào năm 1953

[60], các phương pháp nhằm phát hiện trình tự DNA được phát triển và hoàn thiện theo thời gian Vào những năm 1970, Sanger và cộng sự [56], Maxam và Gilbert

[49] đã phát triển các phương pháp giải trình tự DNA nhằm cung cấp công cụ để giải mã hoàn chỉnh các gen và toàn bộ hệ gen Trong đó, kỹ thuật giải trình tự Sanger yêu cầu xử lý ít hóa chất độc hại và đồng vị phóng xạ hơn phương pháp của Maxam và Gilbert, nên đã trở thành phương pháp giải trình tự DNA phổ biến trong 30 năm sau [8, 71] Đồng thời, những đổi mới về hóa chất và thiết bị đã hỗ trợ cho sự khởi đầu của Dự án bộ gen người với bản thảo đầu tiên được đưa ra vào năm 2001 và hoàn thiện vào năm 2004 [15, 17, 33] Tuy nhiên, Dự án bộ gen người đòi hỏi không chỉ thời gian, nguồn lực, mà cần công nghệ nhanh hơn, lưu lượng xử lý cao hơn và giá thành rẻ hơn ở thời điểm bấy giờ Chính vì vậy, năm

2004, Viện nghiên cứu bộ gen người quốc gia (National Human Genome Research Institute – NHGRI) đã khởi xướng một chương trình tài trợ với mục tiêu giảm chi phí giải trình tự bộ gen người xuống 1000$ trong vòng 10 năm Điều này đã kích thích sự phát triển và thương mại hóa các công nghệ giải trình tự tiếp theo (Next Generation Sequencing – NGS) [8] Kể từ đó, hàng chục công ty và công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo được tạo ra vào giữa những năm 2000, cùng với lĩnh vực tin sinh học, đã bùng nổ như một ngành khoa học và đào tạo chính [2, 71]

1.3.2 Khái niệm và ứng dụng của công nghệ giải trình tự tiếp theo 1.3.2.1 Khái niệm

Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) là phương pháp giải trình tự đồng thời hàng triệu đoạn DNA (hoặc DNA bổ sung), được áp dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm lâm sàng bởi khả năng phân tích đồng thời một số gen hoặc vùng gen với thử nghiệm đơn so với các phương pháp truyền thống đã biết [85] Với NGS, toàn bộ bộ gen của con người có thể được giải trình tự trong vòng một ngày Ngược lại, sử dụng công nghệ giải trình tự Sanger trước đây phải cần hơn một thập kỷ để đưa ra kết quả cuối cùng [71]

Những phương pháp giải trình tự mới này đưa đến ba cải thiện chính: Thứ nhất, thay vì yêu cầu nhân bản các đoạn DNA của vi khuẩn, các thư viện DNA được chuẩn bị trong một hệ thống không có sự có mặt của tế bào Thứ hai, thay vì hàng trăm thì hàng ngàn đến hàng triệu phản ứng được tạo ra song song Thứ ba, đầu ra giải trình tự được phát hiện trực tiếp mà không cần điện di; đồng thời thẩm vấn cơ sở dữ liệu được thực hiện song song và theo chu kỳ Số lượt đọc khổng lồ do NGS tạo ra đã cho phép giải trình tự toàn bộ bộ gen với tốc độ nhanh chóng

Với sự phát triển nhanh chóng và ứng dụng rộng rãi của các phương pháp NGS, thông tin giải trình tự bộ gen được cung cấp cho các nghiên cứu quy mô lớn như exomics, di truyền học sinh thái (metagenomics), di truyền học biểu sinh (epigenomics) và nghiên cứu ở mức độ phiên mã gen (transcriptomics) Giải trình tự bộ gen không chỉ cung cấp kiến thức cho các nghiên cứu cơ bản, mà còn hỗ trợ nhằm đạt được mục tiêu giải mã bí ẩn của cuộc sống, tạo ra cây trồng và vật nuôi phát triển tốt hơn, năng suất cao hơn; cải thiện chẩn đoán, tiên lượng phương pháp điều trị ung thư và các bệnh phức tạp khác, nâng cao chất lượng cuộc sống con người Các ứng dụng của NGS có thể kể đến như: giải trình tự de novo, mate – pair, giải trình tự RNA, giải mã hệ phiên mã, xác định đa hình trình tự hệ gen hoặc vùng gen đích, di truyền học biểu sinh và di truyền học sinh thái [47]

1.3.3 NGS qua các thế hệ 1.3.3.1 Giải trình tự thế hệ thứ nhất

Các phương pháp đầu tiên được sáng lập nhằm giải trình tự DNA gồm phương pháp giải trình tự Sanger [56] và phương pháp phân tách hóa học của Maxam và Gilbert [49] Phương pháp của Maxam và Gilbert dựa trên sự biến đổi hóa học của DNA và sự phân cắt mạch chính DNA tại các vị trí liền kề với các nucleotide đã biến đổi Giải trình tự Sanger sử dụng các nucleotide chấm dứt chuỗi (dideoxy nucleotide – ddNTPs) thiếu nhóm 3’ – OH để dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp chuỗi DNA do ngăn chặn sự hình thành liên kết phosphodiester bởi enzyme DNA polymerase Kết quả tạo ra các đoạn DNA bổ sung với độ dài ngắn khác nhau Các ddNTP được gắn phóng xạ hoặc huỳnh quang để phát hiện sản phầm cuối cùng trên các bản gel điện di, hoặc bằng các máy giải trình tự tự động để xác định trình tự gen (Hình 1.3) Mặc dù giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert đã được sửa đổi nhằm loại bỏ hóa chất và thuốc thử độc hại, phương pháp giải trình tự Sanger vẫn phổ biến hơn và trở thành tiêu chuẩn giải trình tự với nhiều ứng dụng cho đến nay [82]

Hình 1.3 Quy trình giải trình tự Sanger Được công bố vào năm 1977, mặc dù phương pháp giải trình tự Sanger tương đối chậm so với các tiêu chuẩn NGS hiện nay, nhưng với những cải tiến trong phương pháp chấm dứt chuỗi, tự động hóa và thương mại hóa, phương pháp này vẫn được sử dụng trong thí nghiệm lâm sàng Những đổi mới quan trọng nhất trong giải trình tự Sanger được kể đến như: sự phát triển của thuốc nhuộm huỳnh quang, sử dụng trình tự chu trình nhiệt để giảm số lượng DNA đầu vào và ổn định polymerase để kết hợp và kết thúc chính xác bằng cách nhuộm huỳnh quang vào các chuỗi DNA đang tổng hợp, phát triển phần mềm để phân tích các trình tự [82]

1.3.3.2 Giải trình tự thế hệ thứ hai

Sau phương pháp Sanger, thuật ngữ giải trình tự thế hệ thứ hai, thứ ba,… được sử dụng cho các công nghệ giải trình tự DNA tiếp theo Các phương pháp giải trình tự thế hệ thứ hai được chia thành hai nhóm chính: giải trình tự bằng cách lai và giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (Sequencing by synthesis – SBS)

Giải trình tự bằng cách lai Được phát triển vào những năm 1980, phương pháp này sử dụng các oligonucleotide DNA (đầu dò) được sắp xếp theo trình tự đã biết trên các bộ lọc, lai với các đoạn DNA chứa các dấu ấn sinh học Sau khi lai, các DNA không nhắm đích bị rửa trôi và mẫu được làm giàu để rửa giải và giải trình tự Giải trình tự bằng phương pháp lai phần lớn đã chuyển sang các công nghệ phụ thuộc vào việc thăm dò cụ thể để thẩm vấn các trình tự, như các ứng dụng chẩn đoán để xác định đa hình đơn nucleotide (SNPs) trong gen hoặc xác định các bất thường NST (sắp xếp lại, xóa, nhân đôi, sao chép các biến thể số) [38]

Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS)

Các phương pháp SBS là sự phát triển tiếp theo của trình tự Sanger với đặc điểm không có các đầu tận cùng dideoxy, các chu trình tổng hợp, hình ảnh và phương pháp lặp đi lặp lại để kết hợp các nucleotide bổ sung trên mạch đang được tổng hợp Thoạt nhìn, các phương pháp này có vẻ tốn kém chi phí, nhưng những phản ứng thường chạy song song ở các thể tích nanolit, picolit hoặc zeptolit trong buồng nhỏ Do đó, chi phí giải trình tự cho mỗi cặp bazơ không quá tốn kém Các phương pháp SBS được trình bày trong Bảng 1.10

Bảng 1.10 Một số kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS)

Khái niệm Tóm tắt quy trình

Là phương pháp giải trình tự thế hệ thứ hai lần đầu tiên được đưa ra thị trường, dựa trên sự phát hiện pyrophosphate (PPi) giải phóng khi dNTP được thêm vào chuỗi DNA đang tổng hợp

Các đoạn DNA riêng lẻ (400 – 700bp) được gắn vào các adapter tạo ra thư viện sst – DNA mạch đơn Các adapter làm trình tự mồi cho emPCR trong phản ứng khuếch đại PCR nhũ tương Sau đó, tiến hành giải trình tự các đoạn DNA bằng phát hiện hóa học các phản ứng tổng hợp DNA với sự tham gia của dNTP, PPi giải phóng được đo bằng máy ảnh và nguồn sáng, xảy ra trong buồng kích thước picolit

Là kĩ thuật giải trình tự thông qua việc

Sau khi tạo ra thư viện DNA và khuếch đại bằng PCR nhũ tương, các đoạn DNA được giải trình tự

Sequen- cing phát hiện tín hiệu điện do ion H + giải phóng ra trong quá trình tổng hợp DNA bằng máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip bán dẫn theo nguyên lý ion semiconductor Trong phản ứng tổng hợp DNA, dNTP được bổ sung vào chuỗi DNA sẽ giải phóng PPi và ion H + Ion H + làm thay đổi độ pH của dung dịch và tín hiệu điện hóa tạo ra được ghi lại trực tiếp và nhanh chóng bởi phần mềm máy tính

Là kỹ thuật giải trình tự đóng vai trò chính trong lĩnh vực giải trình tự thể hệ thứ hai, sử dụng công nghê được phát triển đầu tiên bởi Solexa và Lynx Therapeutics

Giải trình tự Illumina dựa trên kỹ thuật khuyếch đại cầu nối, trong đó các phân tử DNA (~ 500bp) với các adaptor thích hợp được gắn ở mỗi đầu được sử dụng làm chất nền cho các phản ứng tổng hợp khuếch đại, lặp lại trên một tấm kính với các giếng chứa trình tự oligonucleotide bổ sung với các adaptor

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu ca lâm sàng của bệnh nhân được tài trợ bởi Bệnh viện E, Việt Nam (Dự án KH05 – 2018).

Phương pháp nghiên cứu

Dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân được thu thập tại Trung tâm Tim mạch – Bệnh viện E

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA

Mẫu máu của bệnh nhân được xử lý để giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa protein – exon bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, nhằm mục đích phát hiện các biến thể gen liên quan đến phản ứng TTNAT và phục vụ trong chẩn đoán DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần của bệnh nhân theo các bước như sau: Đầu tiên, phá màng tế bào và màng nhân bằng cách ủ mẫu bệnh phẩm trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như sarcosyl) và enzyme phân hủy protein Tiếp theo, sử dụng dung dịch phenol/chloroform để biến tính protein, làm tủa protein để dễ dàng loại bỏ ra khỏi hỗn dịch Cuối cùng, sử dụng cồn làm kết tủa DNA trong điều kiện lạnh và thu nhận lại DNA bằng ly tâm DNA được hòa lại trong nước để khử enzyme nucleaza

2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen

Các bước giải trình tự gen được tiến hành như sau: Đầu tiên, DNA tổng số được giải trình tự trên máy giải trình tự thế hệ mới nhằm thu được dữ liệu thô đầu tiên Dữ liệu thô này được kiểm định chất lượng bằng thuật toán Phred để xác định điểm chất lượng (Phred quality score) nhằm kiểm soát tính chính xác của các lần đọc và phát hiện các lỗi đọc bazơ Điểm chất lượng càng cao thì độ chính xác càng cao (Bảng 2.1) Tiếp theo, thư viện DNA được chuẩn bị để thu được các đoạn DNA tinh sạch, đạt yêu cầu về chất lượng, sau đó được giải trình tự trên máy giải trình tự gen thế hệ mới Dữ liệu trình tự thu được được sắp xếp và so sánh với ngân hàng gen người và loại bỏ vị trí phân tử trùng lặp Dữ liệu sau đó tiếp tục được phân tích nhằm tìm ra tất cả các vị trí có sự thay đổi alen với tần số thống kê cao, các biến thể như các đa hình đơn nucleotide (SNPs), đột biến thêm bớt (INDEL) Tiếp theo, dữ liệu được chọn lọc để tìm ra những biến thể tiềm năng có khả năng gây bệnh bằng công cụ SIFT và Polyphen2 Với SIFT, các nhà nghiên cứu có thể dự đoán chức năng của protein có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay thế amino acid hay không, dựa trên chỉ số tỉ lệ amino acid được thay thế và dự đoán tính dung nạp hoặc gây hại của chúng (chỉ số < 0,05 được coi là gây hại và ngược lại là dung nạp) Polyphen2 là một công cụ dự đoán tác động có thể có của sự thay thế các acid amin lên cấu trúc và chức năng của protein người dựa trên thang điểm đánh giá Các tác động này được chia làm ba mức theo điểm đánh giá: an toàn (B:

0 – 0,452), có thể gây hại (P: 0,453 – 0,956) và có hại (D: 0,957 – 1) Sau khi xác định được biến thể tiềm năng có liên quan đến bệnh, xác định điểm đột biến bằng phương pháp giải trình tự Sanger rồi tiến hành phân tích các kết quả thu được

Bảng 2.1 Mối liên hệ giữa điểm chất lượng Phred với khả năng mắc lỗi đọc bazơ và tính chính xác của các lần đọc Điểm chất lượng Phred Khả năng mắc lỗi đọc bazơ Độ chính xác của các lần đọc

Nghiên cứu nhận được sự cho phép của Hội đồng Khoa học và Đạo đức Bệnh viện E để công bố thông tin bệnh nhân dưới dạng văn bản.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân

3.1.1 Thông tin chung và kết quả cận lâm sàng của bệnh nhân

Bệnh nhân A, giới tính nam, 59 tuổi, nặng 52 kg, có tiền sử phẫu thuật mổ tách van hai lá 22 năm trước Bệnh nhân nhập viện do đau ngực trái âm ỉ, thở cấp

II được NYHA (2016) phân loại với triệu chứng khó thở nhẹ trong vòng một tháng

Vào ngày nhập viện, bệnh nhân tỉnh, huyết động ổn định, nhịp tim bình thường, mạch đập 83 lần/phút, huyết áp 160/100, nhịp thở 18 lần/phút, nhiệt độ 36 o C Giá trị một số chỉ số cận lâm sàng (sinh hóa máu, huyết học, đông máu) bất thường của bệnh nhân được thể hiện trong Bảng 3.1, các chỉ số khác nằm trong giới hạn bình thường

Bảng 3.1 Giá trị một số chỉ số cận lâm sàng bất thường của bệnh nhân trong ngày nhập viện

Tên xét nghiệm (đơn vị) Kết quả Giá trị bình thường

Sinh hóa máu Ure (mmol/L) 8,3 2,8 – 7,2

APTT ( R) (Bệnh/chứng) 1,44 0,85 – 1,2 Huyết học Số lượng HC (x 10 12 /L) 4,32 4,5 – 5,9

Huyết sắc tố (%) 13,2 13,5 – 17,5 Đoạn ưa acid (%) 7,8 1 – 5

Máu lắng 1 h bằng máy tự động (mm/1h)

Kết quả siêu âm Doppler tim của bệnh nhân cho thấy huyết khối trong buồng nhĩ trái và van hai lá hẹp khít cần được tiến hành phẫu thuật (Hình 3.1), chức năng tâm thu thất trái trong giới hạn bình thường

Hình 3.1 Phẫu thuật thay van tim của bệnh nhân A: Vị trí phẫu thuật tim

3.1.2 Kết quả lâm sàng của bệnh nhân

Bệnh nhân được gây mê toàn thân bằng thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch Esmeron 50 mg nhằm hỗ trợ gây mê để đặt nội khí quản và thuốc gây mê đường hô hấp bao gồm Isoflurane 250 mg, Sevoflurane 250 mg; duy trì gây mê bằng Diprivan (propofol) 100 mg – 50 mg – 30 mg, Fentanyl 0,25 mg – 0,2 mg – 0,1 mg Sau khi gây mê, tiến hành đặt sonde dạ dày, lấy máu động mạch của bệnh nhân làm xét nghiệm khí máu và đặt đầu dò đo nhiệt độ thực quản Trong suốt quá trình phẫu thuật, bệnh nhân được theo dõi thán đồ, nhiệt độ, khí máu, đo huyết áp không xâm lấn Cuộc phẫu thuật kéo dài 5 giờ với tổng liều thuốc mê đã dùng như sau: Propofol (180 mg); Fentanyl (0,95 mg); Esmeron (150 mg); Sevoflurane (250 mg (35 ml)); Isoflurane (250 mg (40 ml))

Sau 280 phút phẫu thuật, sau khi đã lấy được huyết khối trong buồng nhĩ trái, cắt bỏ van hai lá thay bằng van sinh học Hancock số 29, bệnh nhân có biểu nhiều, đồng tử giãn 1 mm hai bên, phản xạ ánh sáng dương tính, các chỉ số khí máu và điện giải bất thường (Bảng 3.2) Kiểm tra thông khí ở bệnh nhân không thấy dấu hiệu co thắt và chảy máu Kết quả xét nghiệm khí máu động mạch tại thời điểm này cho thấy áp lực riêng phần của CO2 trong máu động mạch (pCO2) tăng lên đến 68,3 mmHg (Bảng 3.2) Các bác sĩ phẫu thuật cho rằng đây là phản ứng tăng thân nhiệt ác tính Do đó bệnh nhân được xử lý theo hướng điều trị của phản ứng này

Bảng 3.2 Kết quả xét nghiệm khí máu động mạch và điện giải của bệnh nhân tại thời điểm bắt đầu xảy ra phản ứng TTNAT

Tên XN Đơn vị Kết quả Giá trị BT Nhận xét pH 7,062 7,35 – 7,45 ↓ pCO2 mmHg 68,3 35 – 45 ↑ pO2 mmHg 121,6 80 – 100 ↑

Tiến hành điều trị theo hướng tăng thân nhiệt ác tính bằng cách thở máy có kiểm soát với FiO2 60 – 100%, sử dụng Cefuroxim 250 mg, Dobutamine 250 mg, Ephedrine, Fentanyl duy trì 100 g/giờ; làm mát tích cực bằng nước đá và rửa nước muối lạnh thông thường qua sonde dạ dày cho đến khi nhiệt độ cơ thể bệnh nhân giảm xuống; thuốc lợi tiểu Furosemide 20 mg (1 ống) được sử dụng nhằm duy trì lượng nước tiểu lớn hơn 2 ml/kg/giờ, ngăn ngừa suy thận cấp; sử dụng Natri bicarbonate 4,2% (2 chai), Insuline, Glucose 5% để điểu trị nhiễm toan chuyển hóa và tăng K + máu; CaCl2 0,5 g chống rối loạn nhịp tim; dung dịch tiêm tĩnh mạch natri clorua (NaCl) 0,9%, thiết lập đường tĩnh mạch trung tâm, đo huyết áp động mạch không xâm lấn; hai đơn vị máu được truyền để tăng thể tích máu nội mạch và cải thiện khả năng oxy kết hợp hemoglobin của bệnh nhân; tiến hành làm xét nghiệm khí máu, xét nghiệm đông máu sau mỗi 4 giờ Dantrolene không có sẵn tại thời điểm này do đó bệnh nhân không được điều trị bằng thuốc đặc trị TTNAT

Sau một vài giờ được điều trị tích cực, bệnh nhân có dấu hiệu hồi phục, thân nhiệt đạt đỉnh 42 o C giảm xuống còn 40,6 o C Vào những thời điểm tiếp theo trong ngày, nhiệt độ bệnh nhân giảm dần và trở lại bình thường (37 o C) Kết quả xét nghiệm khí máu động mạch cho thấy pCO2, nồng độ K + và Ca 2+ trong máu giảm dần Hai ngày sau ngày phẫu thuật đầu tiên, tiến hành ca phẫu thuật tiếp theo cho bệnh nhân do chảy máu sau phẫu thuật thay van hai lá Một tháng sau, ca phẫu thuật thứ ba của bệnh nhân được tiến hành do máu cục màng tim sau mổ thay van hai lá Cả hai ca phẫu thuật đều không thực hiện gây mê bằng thuốc gây mê đường hô hấp sevoflurane mà sử dụng thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch (propofol và fentanyl) Bệnh nhân không biểu hiện bất kỳ triệu chứng nào của phản ứng tăng thân nhiệt ác tính

Vào ngày tiến hành phẫu thuật thứ hai, thân nhiệt bệnh nhân đạt 36,3 o C và không xuất hiện bất thường trong những ngày sau Quá trình tiêu cơ vân do TTNAT dẫn đến chỉ số creatine kinase tăng tối đa (7715 U/L), creatine đạt đỉnh ở 240,1 mol/L sau ngày phẫu thuật lần thứ hai, sau đó giảm dần và trở lại bình thường; chỉ số CK – MB đạt đỉnh ở 110 U/L sau đó giảm dần vào những ngày tiếp theo Nồng độ K + trong máu cao nhất vào sau ngày phẫu thuật lần thứ hai (5,9 mmol/L) và trở lại bình thường trong những ngày tiếp theo Sau hai tháng kể từ thời điểm nhập viện, phẫu thuật và điều trị, kết quả siêu âm Doppler tim của bệnh nhân cho kết quả: Van hai lá sinh học đúng vị trí, hoạt động bình thường; tuy nhiên van động mạch chủ hở nhẹ, chức năng tâm thu thất trái giảm nhẹ

Bằng cách tiến hành các biện pháp điều trị tích cực, phản ứng TTANT xảy ra ở bệnh nhân đã được đẩy lùi Bệnh nhân tiếp tục được theo dõi và trải qua hai ca phẫu thuật tiếp theo trên tim tại bệnh viện E Cả hai ca phẫu thuật đều diễn ra thuận lợi và không xảy ra phản ứng TTNAT do không sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp Sau hai tháng theo dõi và điều trị kể từ thời điểm nhập viện, kết quả siêu âm Doppler tim cho thấy van hai lá sinh học đúng vị trí, hoạt động bình thường Với sự đồng ý của bệnh nhân và gia đình, bệnh nhân đã được lấy mẫu máu để tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen theo phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) nhằm phát hiện các điểm thay đổi trên gen có liên quan đến phản ứng tăng thân nhiệt ác tính.

Kết quả phân tích gen của bệnh nhân

Bằng cách sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo, hơn 169 triệu lượt đọc của 150 cặp base trên phân tử DNA đã được giải trình tự trên toàn bộ mẫu với 99,9% số lần đọc đã được ánh xạ thành công vào bộ gen người, bao gồm

10 429 171 492 base Lọc về chất lượng của chuỗi và điểm ánh xạ cho thấy tỉ lệ phần trăm cơ sở có điểm chất lượng Phred (Qphred) cao hơn 20 hoặc 30 chứng tỏ độ chính xác của các lần đọc lớn hơn 99,9% (Bảng 2.1) Kết quả chúng tôi đã xác định được 96 286 đa hình đơn nucleotide (SNP) gồm 11 705 biến thể synonymous,

11 388 biến thể sai nghĩa, 106 đột biến điểm dừng đạt (stop gained) và 89 đột biến điểm dừng mất (stop lost) Tổng cộng có 13 692 đột biến thêm bớt (INDEL) được phát hiện bao gồm 321 biến thể frameshift, 178 đột biến chèn nucleotide trong khung và 207 đột biến xóa nucleotide trong khung SNP và INDEL đã được phát hiện trên bộ gen mã hóa của bệnh nhân với tỉ lệ kiểu gen biến đổi dị hợp tử với kiểu gen biến đổi đồng hợp tử (Het/Hom) là 1,3

Kết quả phân tích của bệnh nhân nhắm tới mục tiêu là các gen liên quan đến phản ứng TTNAT, cho thấy phát hiện 18 điểm thay đổi trên gen RYR1, trong đó có 07 điểm synonymous, 10 điểm trên intron, 01 đột biến điểm đã được công bố là gây bệnh (codon 2350, c7048G >A, p.Ala2350Thr, polyphen 2 đánh giá thang điểm gây bệnh 0,999, SIFT 0,001) ở dạng dị hợp tử; ngoài ra còn phát hiện được

15 điểm thay đổi trên gen CACNA1S trong đó có 07 điểm trên intron, 04 điểm synonymous, 03 điểm splice, 01 điểm upstream; 02 điểm thay đổi trên gen STAC3 trong đó có 01 trên intron, 01 trên vùng 3 prime UTR Đột biến sai nghĩa c7048G

>A, p.Ala2350Thr được xác nhận bởi trình tự Sanger, được trình bày trong Hình

3.2 Đây là một trong những đột biến đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây (https://www.emhg.org/) Hình 3.2 cho thấy đột biến p.Ala2350Thr nằm ở vùng chứa trình tự được bảo tồn (conservative region) qua các loài của gen RYR1 nên sự thay thế này gây ảnh hưởng đến chức năng của protein RyR1

Hình 3.2 A: Điểm đột biến (c7048G >A, p.Ala2350Thr) trong gen RYR1 của bệnh nhân được xác định bằng trình tự Sanger B: So sánh cấu trúc bậc 1 của phân tử protein RyR1 giữa các loài: con người

(XM011527205), bò (NM001206777), lợn (NM001001534), thỏ

Bàn luận

Tăng thân nhiệt ác tính là một rối loạn dược lý mang tính tự phát và các đột biến trên gen RYR1, CACNA1S và STAC3 đã được chứng minh có liên quan đến phản ứng này [80] Hiện nay, các biến thể trên các gen RYR1, CACNA1S và STAC3 đã được công bố liên quan đến TTNAT, ứng dụng trong tư vấn chẩn đoán và điều trị Trong đó, khoảng 37-86% các trường hợp được báo cáo mang đột biến trong gen RYR1 [74], khoảng 1% mang đột biến trong gen CACNA1S [36] Đột biến trong gen STAC3 được xác định có liên quan đến bệnh nhược cơ bẩm sinh của người Mỹ bản địa, có xu hướng xuất hiện phản ứng TTNAT [34] Hiện tại, trong các gen đáp ứng liên quan đến thuốc được báo cáo, hơn 200 biến thể RYR1 được tìm thấy cùng với phản ứng TTNAT, nhưng chỉ có 35 biến thể RYR1 và 2 biến thể

CACNA1S được công nhận là đủ đặc điểm chức năng (www.emhg.org) để sử dụng trong xét nghiệm di truyền chẩn đoán cho TTNAT [80].Phân tích các gen này được các nhà nghiên cứu khuyến cáo nên được đưa vào công việc chẩn đoán ở bệnh nhân thuộc bất kì dân tộc nào có biểu hiện TTNAT, đặc biệt nếu có báo cáo về tiền sử TTNAT của gia đình [34] Trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh nhân

A đã được giải trình tự toàn bộ exome bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, thu được kết quả được trình bày ở trên Từ những kết quả này chúng tôi có những bàn luận dưới đây:

3.3.1 Đặc điểm ca lâm sàng tăng thân nhiệt ác tính của bệnh nhân

Tại Việt Nam, nghiên cứu của chúng tôi là trường hợp báo cáo TTNAT trong phẫu thuật tim khi sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp đầu tiên và duy nhất trong mười năm qua Bệnh nhân A, 59 tuổi, giới tính nam với tiền sử cá nhân và gia đình không có tình trạng mẫn cảm với TTNAT Tất cả các dấu hiệu điển hình như tăng thân nhiệt đột ngột (39,5 o C), nhiễm toan hô hấp (pH giảm 7,062, pCO2 tăng 68,3), tăng nồng độ K + trong máu (5,96 meq/l), tăng CK (7715 U/L) phù hợp với các tiêu chuẩn chẩn đoán của phản ứng TTNAT Bệnh nhân được điều trị tích cực bằng các biện pháp như làm mát bề mặt nhằm giảm nhiệt độ cơ thể, sử dụng thuốc phòng và điều trị các tiến triển xấu của TTNAT như nhiễm toan chuyển hóa, rối loạn nhịp tim, suy thận cấp, DIC Việc kiểm soát sớm nhiệt độ và nồng độ K + trong máu rất quan trọng, tuy nhiên sau khi nhiệt độ cơ thể trở lại bình thường cần tiếp tục làm mát bề mặt cơ thể bệnh nhân, tránh để mất kiểm soát nhiệt độ dẫn đến tình trạng hạ thân nhiệt đột ngột Để bù đắp cho lượng lớn O2 bị tiêu thụ do tăng chuyển hóa và lượng CO2 tăng do quá trình giảm thông khí, bệnh nhân được thiết lập thở máy có kiểm soát với FiO2 60 – 100% trong suốt quá trình điều trị

Dantrolene tiêm tĩnh mạch không có sẵn tại thời điểm diễn ra phản ứng nên bệnh nhân không được điều trị bằng thuốc đặc trị TTNAT Chính vì vậy, trường hợp TTNAT này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phán đoán sớm TTNAT dựa trên dấu hiệu lâm sàng, điều trị triệu chứng tích cực và liên tục, ngừng sử dụng thuốc gây mê đường hô hấp và theo dõi nghiêm ngặt tình trạng bệnh nhân khi các xét nghiệm chẩn đoán và thuốc đặc trị dantrolene không thể có mặt kịp thời Trường hợp này có thể xảy ra ở các vùng nông thôn, vùng đang phát triển thiếu điều kiện chăm sóc y tế Một trường hợp TTNAT tương tự ở Trung Quốc được báo cáo bởi Liu và cộng sự: Bệnh nhân nam 14 tuổi được điều trị thành công mà không sử dụng thuốc đặc trị dantrolene do không có sẵn [72] Điều này khẳng định rằng những kinh nghiệm điều trị TTNAT không sử dụng dantrolene rất cần thiết, đặc biệt đối với các quốc gia không có sẵn loại thuốc này

3.3.2 Đặc điểm của thuốc gây mê sử dụng trong phẫu thuật thay van hai lá ở bệnh nhân

Trong quá trình phẫu thuật tách van hai lá và loại bỏ huyết khối buồng nhĩ trái xảy ra phản ứng TTNAT, bệnh nhân đã được gây mê toàn thân bằng thuốc gây mê đường hô hấp (Isoflurane 250 mg, Sevoflurane 250 mg) và thuốc gây mê đường tiêm tĩnh mạch (Esmeron 50 mg (Rocuronium bromide), Diprivan 100 mg – 50 mg – 30 mg (Propofol), Fentanyl 0,25 mg – 0,2 mg – 0,1 mg) Các thuốc gây mê này đều chuyển hóa trong cơ thể chủ yếu qua gan tạo thành chất chuyển hóa có hoạt tính hoặc không có hoạt tính, sau đó được thải trừ qua thận hoặc ở gan

Trong đó, các liên kết giữa carbon (C) và halogen trong sevoflurane và isoflurane được chuyển hóa bởi enzyme gan CYP2E1, giải phóng các ion halogen (F - , Cl - ): thể gây độc thận, isoflurane chuyển hóa ít (0,2%) và không gây độc [86] Propofol được chuyển hóa nhanh chóng ở gan bằng cách kết hợp với glucuronide và sulphate, tạo ra các hợp chất hòa tan trong nước được đào thải qua thận [87]

Rocuronium và fentanyl được chuyển hóa thành chất chuyển hóa ít hoạt tính và không hoạt tính Sau đó, rocuronium được đào thải chủ yếu bởi gan, còn fentanyl được bài tiết qua nước tiểu hoặc phân [88, 89]

Trong phẫu thuật tim hiện đại, việc tiến hành gây mê phải đảm bảo duy trì và bảo vệ chức năng các cơ quan, đặc biệt là tim và não Nghiên cứu của Schraag đã chỉ ra các lợi ích của thuốc gây mê đường tĩnh mạch, bao gồm khả năng bảo vệ các cơ quan và tăng cường quá trình hồi phục ở bệnh nhân sau phẫu thuật tim mạch [4] Các nghiên cứu khác cũng cho thấy isoflurane và sevoflurane an toàn đối với tim mạch trong phẫu thuật tim, cải thiện thông số huyết động và khả năng phục hồi sau phẫu thuật tương đương nhau ở bệnh nhân trải qua phẫu thuật van tim [5, 70] Tuy nhiên, việc gây mê bằng sevoflurane thuận lợi hơn isoflurane do không gây kích thích đường hô hấp, tốc độ khởi mê nhanh hơn, không làm tăng nhịp tim ở nồng độ sử dụng trong khi isoflurane làm tăng nhịp tim rõ rệt [65]

Trong các thuốc gây mê toàn thân được sử dụng hiện nay, thuốc gây mê dạng hít là tác nhân chính kích hoạt phản ứng TTNAT Nghiên cứu của Sumitani và cộng sự tại Nhật Bản đã chỉ ra tỉ lệ mắc TTNAT tương đối cao ở bệnh nhân dùng sevoflurane mà không tìm thấy ý nghĩa thống kê ở bệnh nhân dùng thuốc gây mê tĩnh mạch rocuronium và propofol [59] Trong những năm 1970, phần lớn các trường hợp TTNAT gây ra bởi halothane Tuy nhiên, vào những năm 2009 – 2011, sevoflurane và isoflurane là các tác nhân phổ biến nhất gây TTNAT [41] Nghiên cứu của Migita và cộng sự đã chỉ ra mức độ nghiêm trọng của phản ứng TTNAT gây ra bởi sevoflurane so với isoflurane trên lâm sàng là tương đương nhau, được khuyến cáo không nên sử dụng ở những người mang yếu tố nguy cơ mắc TTNAT

[20] Mặc dù nên tránh gây mê bằng thuốc gây mê đường hô hấp ở những người nhạy cảm với TTNAT, nhưng đối với những người không nhạy cảm với TTNAT, gây mê toàn thân bằng đường tĩnh mạch cũng không được khuyến cáo sử dụng Điều này là do các thiết bị cần thiết cho gây mê tĩnh mạch không có sẵn tại các nước đang phát triển, đồng thời gây mê tĩnh mạch có nguy cơ ảnh hưởng đến nhận thức cao hơn 5 – 10 lần so với gây mê đường hô hấp Chính vì vậy, gây mê đường hô hấp vẫn được ưu tiên sử dụng trong các trường hợp bệnh nhân không nhạy cảm với TTNAT bởi tốc độ gây mê nhanh, không đau và không cần tiêm tĩnh mạch

Nguyên nhân gây kích thích phản ứng TTNAT của các thuốc gây mê đường hô hấp có liên quan đến các biến thể đột biến trên một số gen Vì vậy cần lựa chọn thuốc gây mê phù hợp với tình trạng, tiền sử bệnh nhân và gia đình nhằm phòng tránh các phản ứng cấp tính trên lâm sàng Nghiên cứu sâu hơn về dược động học và dược lực học của thuốc gây mê đường hô hấp có thể giúp đưa ra loại thuốc phù hợp với bệnh nhân Đây là một chặng đường dài bởi cơ chế hoạt động của thuốc gây mê đường hô hấp rất phức tạp

Hiện nay, phân tích các đồng phân đối quang (chirality) là nghiên cứu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thuốc mới, đồng thời góp phần giải thích cơ chế tác dụng của các thuốc gây mê Chirality là một thuộc tính hình học của phân tử và ion, trong đó một cấu trúc hóa học có thể có hai hình ảnh ở bên phải và bên trái, chúng được gọi là các đồng phân đối quang (enantiomer)

Chirality phụ thuộc vào sự hiện diện của một trung tâm bất đối xứng (thường là một nguyên tử C gắn liền với bốn nguyên tử hoặc nhóm khác nhau) trong cấu trúc hóa học của thuốc Chirality có liên quan đến các thuốc gây mê do phần lớn các chất được sử dụng trong gây mê lâm sàng là thuốc chứa dược chất đối quang (chiral drug) [75] Hầu hết các thuốc này đều tồn tại dưới dạng hỗn hợp tỉ lệ 1:1 của các ĐPQH (hữu tuyền và tả tuyền), được gọi là hỗn hợp racemic Các thuốc có chứa dược chất đối quang là thuốc gây mê đường hô hấp như halothane, isoflurane, enflurane, desflurane (trừ sevoflurane); thuốc gây mê đường tĩnh mạch như etomidate, thiopental Trong đó, etomidate là thuốc duy nhất được sử dụng dưới dạng đồng phân R (+) tinh khiết trong các thuốc gây mê tĩnh mạch Đồng phân S (-) của thiopental có hoạt tính mạnh gấp đôi so với đồng phân R (+) tại các thụ thể GABAA [61] Các ĐPQH của isoflurane thể hiện tính lập thể dựa vào hoạt so với R – isoflurane Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra những bất lợi trong việc sử dụng S – isoflurane và một số thuốc gây mê chứa dược chất đối quang khác trong lâm sàng [76] Vì vậy, các ĐPQH của isoflurane vẫn là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu cho đến nay [61]

3.3.3 Đặc điểm của các gen liên quan đến phản ứng TTNAT 3.3.3.1 Gen RYR1

Gen RYR1 là gen mã hóa thụ thể ryanodine – kênh giải phóng Ca 2+ của lưới cơ tương trong cơ vân Đây được cho là gen chính liên quan đến TTNAT với 189 biến thể được xác định (www.emhg.org truy cập lần cuối ngày 31 tháng 12 năm