LUẬN văn THẠC sĩ chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây cỏ nhọ nồi

TỔNG QUAN

Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)

Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae) là họ lớn nhất trong lớp này, với hơn 1.600 chi và 23.000 loài Chúng thường tập trung chủ yếu ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừng nhiệt đới ẩm với độ cao thấp Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thực vật được sử dụng bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi trên thế giới, đặc biệt là cho các mục đích y học [8]

Các loài thuộc họ Cúc có các đặc điểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, chùm lông trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín [1]

Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú và đa dạng, sự phát triển của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ Nguồn thông tin về các hợp chất này rất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặt của các hợp chất hóa học cụ thể hoặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệ phân loại ở phân họ và cấp thấp hơn [8].

Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là Eclipta alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae) [1], [2]

Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có vị trí phân loại như sau:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.2.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba ) [2]

Mô tả: Cây thảo mọc hằng năm, thân cao 10-60 cm, phân nhánh, màu lục, đôi khi hơi đỏ tía, phủ lông cứng Lá mọc đối, phiến hình ngọn giáo tới bầu dục – thuôn, dài 3-10 cm, rộng 0,5-2,5 cm, mép nguyên hoặc khía răng, có lông tơ dày ở cả hai mặt Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, trên cuống dài 1,5 mm, ở nách lá hoặc ở ngọn cành Tổng bao gồm 1 hàng lá bắc hình bầu dục, có lông tơ ở mặt lưng Đế hoa lồi, rộng 1 cm Các hoa ở mép là hoa cái có tràng dạng lưỡi nhỏ, màu trắng, đầu có hai thùy; các hoa lưỡng tính ở giữa, hình ống, ở đầu có 4-5 thùy Quả bế dẹt, có 3 cạnh màu đen

Hình 1.1 Cây cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba ) [12]

Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô

Phân bố: Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11 Mọc hoang ở chỗ ẩm mát ven làng, đồng ruộng từ vùng thấp lên tới độ cao 1800m Phân bố phổ biến khắp nơi từ Bắc vào Nam và còn phân bố ở các nước nhiệt đới khác thuộc châu Á, châu Phi

Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn Quy kinh vào can và thận

Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc

Thường được sử dụng để trị nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết; Viêm gan mạn, viêm ruột, lỵ; Trẻ em suy dinh dưỡng; Ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh; Nấm da, vết loét, chảy máu, viêm da Còn dùng làm thuốc trong viêm họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc

1.2.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba )

Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi có chứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids, triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids, phytosterol,….Trong lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone, demethylwedelolactone-7- glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol Rễ chứa hentriacontanol và heptacosanol [15] Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin trong chiết xuất n- hexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol, glucoside của axit triterpenic và wedelolactone [23] a Alkaloid

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất hiện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tính sinh học verazine, dehydroverazine ecliptalbine Năm 1998, M S Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của Eclipta alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid Alkaloid chính được xác định là

(20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1), (20R)-verazine

(2) và các alkaloid khác được xác định là 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6), (20R)-25β-hydroxyverazine

Hình 1.2 Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid b Coumestan

Coumestan là một dẫn xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực vật Wedelolactone (9), demethylwedelolactone (10), demethyl-wedelolactone-7- glucosid (11) là các coumestan chính phân lập được từ cỏ nhọ nồi [33]

Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất Coumestan

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU c Flavonoid và Sterol

Các flavonoid được tìm thấy trong cỏ nhỏ nồi là apigenin (12), luteolin (13), luteolin-7-glucoside (14) và quercetin (15) Các sterol hiện diện trong cỏ nhọ nồi là phytosterol, glucoside của phytosterol, daucosterol (16), β-sitosterol (17), stigmasterol (18) và stigmasterol-3-O-glycoside (19) [56]

Hình 1.4 Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid

Hình 1.5 Cấu trúc của các hợp chất Sterol

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU d Saponin triterpen

Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53] Năm 1997, S Yahara và cộng sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X (21-

24) [55] Năm 2008, M K Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III (26-28) và eclalbasaponin V (29) [40]

Hình 1.6 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1

Hình 1.7 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 e Dẫn xuất thiophen và polyacetylen

Năm 1966, F Bolhman và cộng sự thuộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ nhọ nồi Cùng năm 1966, N R Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ đã xác định được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba Năm 1985,

P Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34)

34 Hình 1.8 Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU f Tinh dầu

Các thành phần tinh dầu chính bao gồm heptadecane, 6,10,14-trimethyl-2- pentadecanone, axit n-hexadecanoic, pentadecane, eudesma-4 (14), 11-diene, phytol, octadec-9-enoic axit diisooctylester, (Z, Z) -9,12- octadecadienoic acid, (Z) -7,11- dimethyl-3- methylene-1,6,10-dodecatriene và (Z, Z, Z) -1,5, 9,9-tetramethyl-1,4,7- cycloundecatriene D-dithienylacetylene ester, ecliptal hoặc α-terthienyl aldehyd, α- terthienyl-metanol và α-formylterthienyl [31]

1.2.4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi ( Eclipta alba ) a Tác dụng giảm đau, chống viêm

Dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid toàn phần của Eclipta alba có hoạt tính giảm đau tốt khi được dùng với liều 150mg/kg,

250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống Tác dụng giảm đau này có hiệu quả như nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47]

Khả năng chống viêm của dịch chiết methanolic của lá cỏ nhọ nồi đã được nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng

Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đường uống cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin (10mg/kg) và cyproheptadine (8 mg/kg) [9] b Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta alba và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn Các nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại Staphylococcus aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium [18]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng

Dược liệu nghiên cứu là cây cỏ nhọ nồi Eclipta alba được thu hái từ tỉnh Thanh Hóa, trong tháng 06/2018 Dược liệu thu về được sấy khô ở nhiệt độ 50-60 0 C đạt độ ẩm khoảng 5%, thái nhỏ hoặc xay nhỏ và bảo quản trong túi polymer để nơi khô ráo, tránh ẩm

2.2 Hóa chất, thiết bị 2.2.1 Hóa chất

- Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, n-hexan, ethyl acetat, dicloromethan, aceton

- Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol đốt nóng để phát hiện viết chất trên bản mỏng

- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

- Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck)

- Chất chuẩn wedelolacton, quercetin, methyl gallat đạt tinh khiết 98%

- Máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi)

- Máy cất quay Buchi dung tích bình cất 250ml, 500ml, 1000ml

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Bếp điện, bếp cách thủy Memmert

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đo hàm ẩm

- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

- Dụng cụ thủy tinh: Bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu các dung tích 250ml, 500ml, 1000ml, cột sắc ký các loại, phễu thủy tinh, ống đong, ống nghiệm các kích thước,…

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập

- Cỏ nhọ nổi được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với methanol, sau đó lọc loại bã dược liệu và gộp dịch chiết Tiếp theo cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc toàn phần

- Cao toàn phần được phân tán trong nước và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat thu được các phân đoạn tương ứng

- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong dung môi Tiến hành quá trình sắc ký cột:

+ Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải

+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký khô, sạch, lắp thẳng đứng trên giá cố định Nhồi một lớp bông xuống đáy cột Cân một lượng chất nhồi cột thích hợp vào cốc có mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí Đưa từ từ hỗn hợp chất nhồi cột lên cột, gõ nhẹ, đều tránh bọt khí Sau đó, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột đến khi cột ổn định

+ Nạp mẫu: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi dung môi đến khi được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều trên mặt cột Sau đó, đặt một miếng bông lên để bảo vệ bề mặt cột

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải

- Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

- Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc các hợp chất được xác định thông qua sự kết hợp của các phương pháp phổ hiện đại và các đặc trưng hóa lý (điểm nóng chảy) Các phương pháp phổ được dùng phổ biến trong xác định cấu trúc là phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance - NMR)

- Phổ khối lượng: Cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3]

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ ( 1 H, 13 C ) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường)

Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó

Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1 H hay 13 C) như trong các phổ một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [3]

Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cỏ nhọ nồi là:

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi

Lấy 2 kg cỏ nhọ nồi được xay mịn chiết nóng với MeOH, chiết 3 lần ở 70 0 C, mỗi lần 3 giờ, với tỉ lệ DL/DM: 1/8 Sau đó, lọc lấy dịch chiết và cô dưới áp suất giảm thu được cao tổng NTP (288,3 g)

Phân tán 280g NTP vào 2l nước sau đó lắc phân đoạn với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan và EtOAc, 3 lần với mỗi dung môi Gộp dịch chiết và cô dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn n-hexan (NH:

20,6g), phân đoạn EtOAc (NE: 60,9g) và phân đoạn nước (NW: 197,3 g) được biểu diễn như Hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi

1 Phân tán cao trong nước

2 Lắc phân đoạn lần lượt với n-hexan (x3), EtOAc (x3)

Cao EtOAc (NE) (60,9g) Cao n-hexan (NH)

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi

Dùng 60g cao phân đoạn NE tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là: NE1-7

Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với hệ dung môi DCM-MeOH (10/1) thu được phân đoạn ký hiệu là: NE4.1- 4.4 Phân đoạn NE4.1 (1,9g) được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu được hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg) Phân đoạn NE4.2 (1,1g) được tiến hành tiến hành sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thu được hợp chất N03 (48 mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của cỏ nhọ nồi

CC: pha thường DCM/MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1)

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (10/1)

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (8/1)

CC: pha thườngDM: DCM/MeOH (8/1)

UV 254nm UV 366nm TT H 2 SO 4 10%/Ethanol

Hình 3.3 SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc

Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi

Hợp chất N01: chất bột màu trắng

ESI-MS: m/z 314 [M + ]: C16H10O7 Phổ 13 C-NMR, phổ 1 H-NMR và DEPT (Bảng 3.1) Các số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân tử của hợp chất wedelolacton (Hình 3.3)

Phổ 1 H-NMR cho tín hiệu proton của nhóm methoxy ở δ H 3,88 (3H, s, H-15)

Hai tín hiệu proton ở vị trí para của vòng thơm ở δ H 7,35 (1H, s, H-13), 7,16 (1H, s, H-10); Hai tín hiệu ở δ H 6,44 (1H, d, J=2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8) là tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta

Phổ 13 C-NMR của N01 có 16 tín hiệu carbon, trong đó: tín hiệu cacbon cacbonyl của vòng lacton ở δ C 164,0; 4 tín hiệu ở δ C 99,5; 94,5; 99,6 và 106,0 là tín hiệu của 4 nhóm CH kề nối đôi (CH=), 10 tín hiệu ở 103,3; 161,4, 98,4, 156,3, 164,4, 157,0, 151,2, 146,7, 115,7 là tín hiệu của 10 carbon bậc 4 kề nối đôi Tín hiệu ở 56,3 là cacbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene Phổ HMBC cho thấy nhóm OCH3 này tương tác với C7 (δ = 164,4)

Tương tác H→C được quan sát thấy trên phổ HMBC cho vị trí chính xác của các proton và carbon trong phân tử của N01 (Bảng 3.1) Từ đây, dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố [42] cấu trúc của chất N01 được xác định là 5,11,12-Trihydroxy-7- methoxycoumestan (Wedelolactone)

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton)

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton

Hợp chất N02: Chất rắn màu vàng, điểm nóng chảy 313-314 o C

R f = 0,35 (TLC, silica gel, CH2Cl2 /MeOH 9/1,v/v), Hiện màu vàng sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin

Phân tích phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT của chất N02 cho các tín hiệu đặc trưng của một flavonol Phổ 1 H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó 3 tín hiệu tương tác ABX ở δ H 7,82 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,69 (1H, dd, J 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5') thuộc về vòng thơm B, hai tín hiệu proton tương tác meta ở δ H 6,51 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,26 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) thuộc về vòng thơm A

Phổ 13 C-NMR và DEPT chỉ ra chất N02 gồm 15 cacbon với 5 CH nhân thơm ở δ C 99,1 (C-6), 94,4 (C-8), 115,7 (C-2'), 116,2 (C-5') và 121,4 (C-6'), 10 C trong đó tín hiệu δ C 176,5 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl, bốn cacbon có độ chuyển dịch δ C 145,8, 148,3, 162,3, 164,9 ppm đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm OH của các cacbon C-3', C-4', C-5, C-7 Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δ C

136,7 (C-3) đặc trưng cho cacbon của nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl

Dựa vào dữ kiện phổ trên đồng thời so sánh điểm nóng chảy và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó [5], cấu trúc của chất N02 được xác định là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone hay quercetin

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin) 3.2.3 Biện luận cấu trúc N03

Hợp chất N03: Chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy là 201-202°C

Hiện màu nâu ở UV 254 nm, không hiện màu ở UV 365 nm Hiện màu nâu sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dung dịch FeCl3/etanol 5%

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat

Phổ 1 H-NMR của chất N03 cho một tín hiệu singlet của hai proton trong vòng thơm δ H 7,07 (2H, s, H-2 & H-6) Sự có mặt của một metyl este thể hiện qua tín hiệu singlet của proton metyl δ H 3,83 (3H, s, H-OCH3)

Phổ 13 C-NMR của N03 cho tín hiệu của 8 cacbon trong đó tín hiệu của cacbon cacbonyl ở δ C 169,0 (C-7), cacbon metyl este δ C 52,3 Sáu cacbon thuộc về vòng thơm xuất hiện trong khoảng chuyển dịch δ C 110,1-146,4, trong đó C-1 và C-4 cho tín hiệu tương ứng ở δ C 121,5; 139,7 Tín hiệu chồng chập của hai cacbon methin C-2 và C-6 ở δ C 110,1 với cường độ mạnh Tương tự vậy, hai cacbon vòng thơm còn lại C-3 và C-5 xuất hiện ở δ C 146,4 Các dữ kiện phổ trên gợi ý cho ta về cấu trúc một phenolic thế tetra ở các vị trí 1,3,4,5 của hợp chất N03 trong đó có một metyl este và ba nhóm còn lại là hydroxy Các tương tác HMBC cho phép xác định cụ thể từng vị trí của các nhóm chức vào nhân thơm Từ nhận định trên, kết hợp với tài liệu tham khảo [43] cho phép kết luận cấu trúc của hợp chất N03 là methyl 3,4,5-trihydroxybenzoate hay methyl gallat

Bàn luận

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dung môi là MeOH Phương pháp này được lựa chọn vì đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm MeOH là dung môi chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dễ kiếm; tuy nhiên MeOH là một dung môi độc Cao chiết tổng tiếp theo được chiết thành các phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc, để thuận lợi cho quá trình phân tách tiếp theo

3.3.2 Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp, hiệu quả tách cao và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm Để lựa chọn phân đoạn, thăm dò hệ dung môi rửa giải, định tính các chất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá trình phân lập, đề tài sử sụng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Với phương pháp sắc ký và hệ dung môi rửa giải phù hợp, kết quả là đã phân lập được 3 hợp chất N01, N02, N03 Dựa vào dữ liệu phổ MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và đối chiếu với các tài liệu đã được công bố, đã xác định cấu trúc của các chất trên lần lượt là: wedelolacton, quercetin, methyl gallat

Wedelolacton là một coumestan có hàm lượng lớn và đóng vai trò quan trọng trong nhiều tác dụng dược lý của cây cỏ nhọ nồi [31] Wedelolactone đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm ức chế phospholipase A2, virus viêm gan C RNA-polymerase và các hoạt động Na +, K + -ATPase Wedelolacton còn

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU được sử dụng như thuốc để kháng lại nọc độc rắn và có khả năng chống oxy hóa [19],

Tác dụng chống viêm được chứng minh thông qua việc ức chế hoạt động IKK, có tiềm năng chống viêm bằng cách ức chế nồng độ IL-1β trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, hen suyễn và sốc nhiễm trùng [38]

Tác dụng chống ung thư của wedelolacton đã được chứng minh Đầu tiên, wedelolactone đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của carcinosarcoma và tế bào adenoma tuyến yên in vitro [30] và ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt in vitro và in vivo [52] Wedelolactone ức chế sự tăng trưởng và gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư vú MDA-MB-231, do khả năng liên kết với DSDNA, ức chế topoisomerase IIa và ngăn chặn sự tổng hợp DNA [11]

Wedelolacton được nghiên cứu và cho thấy khả năng chống viêm, phòng và chữa bệnh nhiễm trùng nặng Wedelolactone làm giảm các phản ứng viêm do zymosan gây ra đã được nghiên cứu tại Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội [17]

Quercetin là một trong những flavonoid nổi tiếng, đã được đưa vào chế độ ăn uống của con người trong một thời gian dài Việc sử dụng quercetin có rất nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm chống oxy hóa, chống béo phì, chống viêm, kháng vi-rút, kháng khuẩn và chống ung thư [20], [37], [41]

Quercetin đã được báo cáo là có tiềm năng mạnh mẽ trong điều trị ung thư, nó có thể ức chế sự tăng sinh của các loại tế bào ung thư khác nhau (ví dụ như tế bào ung thư đại trực tràng, tế bào ung thư tuyến tiền liệt, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư tuyến tụy và tế bào ung thư phổi, ) bằng cách tác động đến chu trình tế bào của chúng và ngăn chặn chúng phát triển [35], [36], [39], [49] Chức năng chống ung thư của quercetin được báo cáo liên quan đến khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ của nó

Kết quả từ một số nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của quercetin trong việc ức chế các bệnh tim mạch Đối với bệnh nhân tăng huyết áp, việc sử dụng quercetin (730 mg / ngày, 4 tuần) đã được ghi nhận là làm giảm huyết áp tâm thu (giảm 7 mm Hg), huyết áp tâm trương (giảm 5 mm Hg) và áp lực động mạch trung bình (giảm 5 mm Hg) [21] Trong một nghiên cứu tương tự, huyết áp tâm thu và mức LDL do xơ vữa đã giảm đối với một số đối tượng béo phì có triệu chứng hội chứng chuyển hóa sau khi được sử dụng 150 mg quercetin/ngày trong 42 ngày [22]

Homer et al (1990) đã nghiên cứu về khả năng ngăn chặn các hoạt động phân giải protein của một số vi khuẩn như Bacteroides gingivalis, Bacteriodes intermedius và Treponema denticola [27] Methyl gallat ức chế tăng trưởng E coli, mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn sản xuất axit lactic [6] và kết hợp hiệp đồng với ciprofloxacin để chống lại Salmonella [14]

Methyl gallat được biết đến như một trong những chất chống oxy hóa [24]

Ngoài ra, methyl gallat còn có tác dụng kháng tiểu cầu [41], bảo vệ DNA khỏi tổn thương do stress oxy [28], giảm stress oxy hóa trong tiểu đường [13]

Tiêu đề	Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây cỏ nhọ nồi
Tác giả	Đinh Thị Nguyệt Ánh
Người hướng dẫn	Ths. Nguyễn Thị Hồng Anh, PGS.TS. Dương Thị Ly Hương
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	2,54 MB