LUẬN văn THẠC sĩ chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat vỏ quả cây bảy lá một hoa (paris polyphylla var chinensis (franch ) h hara) trồng ở lào cai

TỔNG QUAN

Tổng quan về chi Paris

Hiện nay, hệ thống phân loại thực vật chi Paris chƣa có sự thống nhất Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris:

Phân giới thực vật bậc cao

Phân lớp Loa kèn (Lilidae)

Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae)

Chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris) [5]

Chi Paris là một chi nhỏ, phân bố ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nê Pan, Pakistan, Mianma, Thái Lan), châu Âu và châu Mỹ [7]

Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài, 17 thứ, trong đó có 12 loài đặc hữu [20,26] Ở Việt Nam, chi Paris hiếm gặp, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh vùng núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên, theo Nguyễn Thị Đỏ nghiên cứu mô tả chi tiết và có khóa phân loại kèm hình ảnh về chi Paris L có 6 loài theo bảng 1.1 [7]

Cây thảo nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh hoặc hiếm khi phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông Lá mọc đối hoặc mọc vòng trên thân, 4 -

10 lá; phiến lá màu lục, có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngƣợc, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn Hoa thường đơn độc hoặc một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lưỡng tính, mẫu 3 -

5, cuống dài, thẳng đứng Đài (2) 3 - 5 (10), rời nhau, hình mũi giáo, màu lục hoặc màu trắng, thường to hơn cánh hoa, xếp lợp hoặc hơi vặn Cánh hoa 2 (3) - 5 (10), là 6 - 12; chỉ nhị dẹt, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc không kéo dài Bầu thƣợng, tròn hoặc có cạnh, 3 - 12 lá noãn, nhiều ô, với kiểu đính noãn trung trụ hoặc 1 ô với kiểu đính noãn bên, mỗi bên nhiều noãn; vòi nhụy 3 - 5, rời hoặc dính nhau phần gốc; đầu nhụy 3 - 5 Quả mọng hoặc quả nang, mở ở lưng ô Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc, chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Paris L ở Việt Nam [6],[ 7]

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo)

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Hải An), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương), Kon Tum (Kon Plong)

Paris fargesii Franch Sa Pa (Lào Cai)

(Bảy lá một hoa, Tảo hưu)

Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Nội (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn, Mai Châu: Pà Cò)

(Trọng lâu vân nam) Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu (Phong Thổ)

1.1.3 Thành phần hóa học chi Paris Những nghiên cứu trong nước

Các công bố về thành phần hóa học chi Paris ở Việt Nam cho đến nay còn sterol từ thân rễ loài Paris yunnanensis thu thái tự nhiên tại Kon Tum là diosgenin, gracillin và hỗn hợp stigmasterol-3-O-β-D-glucosid và sistosterol-3-O-β-D-glucosid

Những nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paris L chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất tanin, flavonoid, acid phenolic, saponin [28,52], đường [1], acid amin [45] Trong đó thành phần chính là saponin steroid [40,54]

Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938 bởi Dutt và cộng sự [19] phân lập đƣợc parid và paristyphnin từ loài P quadrifolia Sau đó năm 1983 Nakano [31] và Chen (1995) [17] công bố các hơp hợp chất saponin, flavonoid glycosid, sterol [14,18], β-phytoecdyson và polysaccharid đƣợc công bố lần lƣợt bởi Singh [42] và Zhou [53] Cho đến nay có trên 55 saponin đƣợc phân lập từ 8 loài là: P polyphylla var yunnanensis, P polyphylla var chinensis, P delavayi Franch, P vietnamensis, P dunniana, P luquanensis, Paris polyphylla var pseudothibetica, P quadrifolia

1.1.3.1 Các hợp chất saponin a Các hợp chất sapoin steroid

 Các hợp chất saponin spirostan

Các saponin này thường có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin hoặc dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C-24 hoặc C-27 Các saponin này có từ 1 đến 4 đường và thường liên kết với phần aglycon tại C-3 Một số pennogenin saponin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 đƣợc phân lập bởi Chen và cộng sự [14,15,41] từ loài P axialis và PPY Các saponin spirotan (hình 1.1) đã phân lập đƣợc là:

Diosgenin (1) phân lập từ thân và lá loài PPY [37]

Trillin (2), Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc (3) phân lập từ thân rễ

PP [39], thân và lá PPY [37]

Paris V (4) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân và lá PPY [37]

Polyphyllin C (5) phân lập từ thân rễ PP [43]

Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (6) phân lập từ thân rễ PP [31]

Polyphyllin D/ Paris I (7) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân rễ PPY [47]

Dioscin/Paris III (8) phân lập từ thân rễ Paris axialis, thân lá PPY [16]

Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→3)]-β-D-Glc (9) phân lập từ thân rễ PP [43]

Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (10) phân lập từ loài PPC [49]

Gracillin (11) phân lập từ loài PP [50], thân rễ PPY [47]

Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (12) phân lập từ thân rễ PP [39]

Paris II (13) phân lập từ thân rễ PP, thân và lá PPY [50]

Polyphyllin F (14), Polyphyllin E (15) phân lập từ thân rễ PP [43]

Diosgenin-3-O-β-D-Glc-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Rha-(1→3)]-β-D-Glc

(16) phân lập từ thân rễ PP [50]

Reclinatosid (17), Loureirosid (18) phân lập từ thân rễ PP [51]

Diosgenin-3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)-β-D-Glc (19) phân lập từ thân rễ PPC [30]

Diosgenin-3-O-β-D-Glc-(1→5)-α-L-Ara-(1→4)-[Rha(1→2)]-β-D-Glc (20) Paris IV (21) phân lập từ thân rễ, thân và lá PPY [50]

Pennogenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (22) phân lập từ thân rễ PP [31]

Paris H (23), Paris D (24) phân lập từ thân rễ PPC [30]

Pennogenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Rha(1→2)]-β-D-Glc (25) phân lập từ hạt PPY [14]

Pennogenin-3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)- β-D-Glc (26) Paris VII (27) phân lập từ phần trên mặt đất PPY, lá và thân rễ PPC [18]

Polyphyllosid (28) phân lập từ thân rễ PP [50]

Pennogenin-3-O-β-D-Api-(1→3)-[α-L-Rha-(1→2)]-β-D-Glc (29) phân lập từ thân rễ PPY [47]

Pennogenin-3-O-β-D-Glc-(1→5)-α-L-Rha-(1→4)-[Rha(1→2)]-β-D-Glc (30) phân lập từ thân rễ PPY [47]

Hình 1.1 Cấu trúc của các saponin spirostan của chi Paris

Hình 1.2 Cấu trúc của các saponin furostan

Các saponin furostan có cấu trúc tương tự như các saponin spirostan nhưng bị phản ứng của enzym mở vòng ở vòng F và bị đường hóa tại C-26 Cấu trúc dạng này lần đầu tiên phân lập từ Paris bởi Matsuda và cộng sự năm 2003 [29] là protogracillin Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại khung E Các saponin furostan (hình 1.2) đã phân lập đƣợc là:

(25R)-26-O-β-D-Glc-22-hydroxy-5-en-furost-3β,26-diol-3-O-α-L-Rha- (1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (31) phân lập từ cây Paris quadriforia L [33]

Parisaponin I (32) phân lập từ thân rễ PP [29]

Parisyunnanosid A (33), Th (34), Pseudoproto-Pb (35), Parisyunnanoside B

(36) phân lập từ thân rễ PP [51]

 Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan

Chen và cộng sự lần đầu tiên phân lập đƣợc hai nhóm saponin pseudo- spirostanol và pregnan từ chi Paris, trong đó nhóm saponin pseudo-spirostanol

(1995) [17] gồm nuatigenin và isonuatigenin, năm 1990 công bố nhóm saponin pregnan [14,18]

Các saponin pregnan (hình 1.3) đã công bố gồm:

Pregna-5,16-dien-3-ol-20-on-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→4)]-β-D-Glc

Hypoglaucin H (38) phân lập từ lá PPY [37]

Chonglouosid SL-7 (39), Chonglouosid SL-8 (40) phân lập từ thân và lá PPY

Hình 1.3 Cấu trúc của các saponin pregnan

Năm 2009, Xiao và cộng sự phân lập đƣợc parispseudosid A và parispseudosid B (41) [48] 26-O-β-D-Glc-(25R)-Δ(5,6),(17,20)-dien-16,22-dion- cholestan-3β,26-diol-3-O- α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→2)]-β-D-Glc (42) đƣợc phân lập từ thân rễ PP [51] Hợp chất 18-norspirostanol đƣợc phân lập từ loài P quadrifolia bởi Nohara năm 1982 [33] Năm 2016 Qin và cộng sự [35] đã phân lập đƣợc hai sterol là 7α-hydroxy stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (43) và 7β- hydroxy sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44)

Hình 1.4 Một số saponin steroid khác đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Paris b Các saponin triterpen

Theo Wu và cộng sự [47] đã lần đầu tiên phân lập đƣợc 15 saponin triterpenoid từ phần thân rễ loài PPY (hình 1.5) trong đó 6 hợp chất saponin oleanoid là mới (45-60) và 9 hợp chất còn lại đã biết cấu trúc gồm 3β,12α- dihydroxyolean-28,13β-olid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (paristrisid A, 45),

3β,12α-dihydroxyolean-28,13β-olid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid B,

46), 3β-dihydroxyolean-11,13,(18)-dien-28-oic 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (paristrisid C, 47), 3β-dihydroxyolean-11,13,(18)-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Glc-

(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid D, 48), 3β-hydroxyolean-18-dien-28-oic acid 3-O-β-D-

Glc-(1→2)-α-L-Ara (paristrisid E, 49), 3β-hydroxyolean-18-dien-28-oic acid 3-O- β-D-Glc-(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid F, 50), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid

3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (51), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-β-D-Xyl (52), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-α-L-Ara (53), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Xyl (54), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Glc (55), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-α-L-Rha-(1→2)-β-D-Glc (56), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O- β-D-Glc-(1→2)-β-

D-Glc (57), 3β,23-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid 3-O-β-D-Xyl-(1→2)-α-L-Ara

(58), 3β,23-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (59)

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen

Các flavonoid glycosides trong đó 6 chất có aglycon là kaempferol, 3 chất với aglycon là isorhamnetin, 1 quercetin đƣợc phân lập từ PPY và P.axialis [50]

Hầu hết đều là dạng O-glycosid Hợp chất 65, 66 và 67 đƣợc phát hiện từ chi

Paris bởi Wang Trong đó hợp chất 69 đƣợc phân lập từ P Mairei by Huang et al

Một số phytosterols chính chứa stigmasterol (70), β-sitosterol (71), và chất chuyển hóa của chúng trong chi Paris, Daucosterol (72) đƣợc phân lập từ P delavayi bởi Liu et al [50]

Bảng 1.2 Các flavonoid đƣợc phân lập từ chi Paris [50]

65 Glc-(1→6)-Glc H OCH 3 Isorhamnetin-3-O-β-gentiobiosid

66 Glc-(1→2)-Rha H OCH 3 Isorhamnetin-3-O-β-D-runtinosid

Một phenylpropanosid glycosid là parispolysid F (73) và một ramification của phenolic glycosid parispolysid G (74), một sphingolipid ethyl-α-D- fructofuranosid (75) và một glycosid (76) đƣợc phân lập từ PPY bởi Wang [50]

Ngoài ra, phân lập bằng CC phát hiện 18 acid amino [45]

Theo Danbensky, Stepven Clavey và cộng sự, Paris polyphylla có độc tính nhẹ, ở liều bình thường gần như không có tác dụng phụ, ở liều cao (60 – 90 g) có phản ứng ngộ độc nhẹ, xuất hiện sau 1 – 3 giờ dùng thuốc Biểu hiện: buồn nôn, nôn, ỉa chảy, hoa mắt chóng mặt, đau đầu, da mặt xanh tái, mắt mờ Một số trường hợp có thể gây co thắt, khó thở, loạn nhịp Bột dƣợc liệu có thể gây kích ứng mũi và kết mạc mắt [10].

Tổng quan về loài Bảy lá một hoa

Bảy lá một hoa có tên khoa học là Paris polyphylla var chinensis (Franch.)

Tên đồng nghĩa là Paris chinensis Franchet, Paris formosana Hayata, 1911;

Paris polyphylla auct non Smith: Pei & Chou, 1964; Paris polyphylla ssp polyphylla auct non Smith: Phamh., 1993 [10,27]

Tên thông thường là Tảo hưu, Thất diệp nhất chi hoa, cúa dô (H’Mông) [1]

Tên nước ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp) [1]

Bảy lá một hoa là cây thảo nhiều năm, cao 40 - 100 (130) cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, đường kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông Lá 5 - 6

(7), xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngƣợc, hình thuôn, kích thước 25 (27)  (5 – 7) cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 (6) cm Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, thẳng đứng Đài 5 - 6 (7), dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thước (3,5) 5 - 8 (9) × ((1) 1,5 - 2,5 (3,5)) cm, màu lục Cánh hoa 5 - 6 (7), màu vàng, dạng dải, kích thước ((3) 4,5 - 6 (7))  0,1 cm, bằng nhau Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhụy 5 – 6 Quả nang, mở ở lƣng ô Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7]

Hình 1.6 Các bộ phận sinh dƣỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var chinenis Franchet đƣợc trồng tại Sapa, Lào Cai [11]

A Thân khí sinh mang lá và hoa; B Một lá; C Thân rễ; D Lát cắt ngang thân rễ;

E Đài hoa; F Cánh hoa; G Nhị; H Nhụy; I Quả; K Hạt

Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo bờ khe suối, đất ẩm nhiều mùn Phần thân trên mặt đất lụi hàng năm vào cuối thu Thân rễ mang 1 – 2 chồi ngủ tồn tại qua đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn với chiều dài thân rễ trên 5 cm mới thấy có hoa quả [1] Mùa ra hoa tháng 2 - 6, mùa quả tháng 3 – 10 [7,27]

Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Nội (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn, Mai Châu: Pà Cò) Còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [7]

1.2.4 Thành phần hóa học Những nghiên cứu trong nước

Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” (tập I), thân rễ Bảy lá một hoa chứa 7 – 9 % đường, 2% glycosid là α – paridin và α - paristyphnin [1]

Năm 2005, trong khoá luận tốt nghiệp dƣợc sỹ của Nguyễn Thị Bảo Vân

“Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng của cây Bảy lá một hoa”, cho thấy trong thân rễ của Bảy lá một hoa có chứa các nhóm chất saponin, tanin catechic, sterol, acid amin và polysaccharid

Năm 2013, khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Hoàng Thị Thu Hồng (Đại học sƣ phạm TP.Hồ Chí Minh) đã thực hiện “Khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetat cây Bảy lá một hoa (Paris Polyphylla)” phân lập đƣợc hỗn hợp của stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid

Một số công bố của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Duyên – Viện Dƣợc liệu:

Nguyễn Thị Duyên, Phạm Quốc Long, Đỗ Thị Hà (2016), “Saponin steroid từ cắn ethyl acetat của thân rễ Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis Franchet) trồng tại Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 21(1+2), 30-35

Nguyễn Thị Thu, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Đắc Bình Minh, Đào Thùy Dương, Nguyễn Thị Duyên (2016), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 21( 4), 242-247

Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Thu, Phạm Quốc Long (2016), “Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis Franchet) họ Trọng lâu (Triliaceae)”, Tạp chí khoa học và công nghệ 56 (2C), 472-478

Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Trần Vũ Thắng, Nguyễn Quyết Chiến, Phạm Quốc Long, “Thành phần hóa học cao phân đoạn etyl axetat cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis Franchet) trồng tại Việt Nam”, Tạp chí Hóa học

Những nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học chi Paris gồm hơn 70 hợp chất đƣợc công bố, tuy nhiên hầu hết các hợp chất đều đƣợc phân lập từ Paris polyphylla var yunnanensis 20 hợp chất đƣợc phân lập từ PPC và đều là các saponin sterol gồm saponin diosgenin (12 hợp chất), saponin pennogenin (6 hợp chất), hợp chất 39 và 42 Các hợp chất này đều đƣợc glycosid hóa tại vị trí C-3 trong đó saponin diosgenin là 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 và saponin pennogenin là 21,

1.2.5 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 1.2.5.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Theo nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự phân lập đƣợc 10 saponin steroid là: 4, 7, 11, 20, 21, 22, 24, 25, 26 và 28 từ cao methanol phần thân rễ Paris polyphylla var chinensis Dịch chiết methanol ức chế 99% sự sinh trưởng của tế bào HL-60 ở mức liều 10 àg/ml, IC 50 = 3,3 àg/ml Cỏc hợp chất 4, 7, 11, 20,

21, 24, 25 và 28 biểu hiện tác dụng gây độc tế bào ung thƣ với IC 50 lần lƣợt là: 1,8, 0,5, 2,1, 0,8, 5,1, 5,0, 1,5 và 1,7 àg/ml Hợp chất 7 cũn cú khả năng ức chế nhiều dũng tế bào ung thƣ khỏc nhƣ tế bào ung thƣ mỏu MOLT-4 (GI 50 = 0,19 àg/ml; TGI

= 0,41 àg/ml; LC 50 = 0,91 àg/ml), ung thƣ phổi A549/ATCC (GI 50 = 0,20 àg/ml;

TGI = 0,36 àg/ml; LC 50 = 0,66 àg/ml), ung thƣ đại tràng SW-620 (GI 50 = 0,19 àg/ml; TGI = 0,42 àg/ml; LC 50 = 0,91 àg/ml), u ỏc tớnh M14 (GI 50 = 0,20 àg/ml;

TGI = 0,36 àg/ml; LC 50 = 0,65 àg/ml), ung thƣ trực tràng 786-0 (GI 50 = 0,22 àg/ml;

TGI = 0,47 àg/ml; LC 50 = 0,98 àg/ml) [30]

Theo Lin-Lin Gao và cộng sự, phân lập đƣợc dioscin (8) từ Paris chinensis

Hợp chất này ức chế sự tăng trưởng của dòng tế bào ung thư buồng trứng SKOV3 phụ thuộc thời gian và liều, với IC 50 lần lƣợt là 14,6±0,11, 7,64±0,40 và 5,81±0,33 mg/ml tương ứng với các thời điểm sau 24, 48 và 72 h dùng thuốc Dioscin (8) làm tăng đáng kể quá trình apotosis, do làm tăng nồng độ Ca 2+ quá mức trong ti thể, dẫn đến tăng nồng độ enzym caspase-3 và cytochrom C trong tế bào SKOV3 [22]

Trong một nghiên cứu khác trên dòng tế bào ung thƣ dạ dày SGC-7901, nhóm nghiên cứu đã phát hiện khả năng gây độc tế bào này theo cơ chế liên quan đến chu kỳ tế bào và quá trình apotosis Kết quả nghiên cứu cho thấy dioscin ức chế sự tăng trưởng của dòng tế bào SGC-7901 phụ thuộc thời gian với nồng độ với IC 50 lần lượt là 13,77±0,18, 8,73±0,41 và 3,62±0,29 mg/ml tương ứng với các thời điểm

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng

Mẫu cây Bảy lá một hoa đƣợc thu hái tại huyện Sa Pa - tỉnh Lào Cai, tháng 8/2015 Mẫu (mẫu tươi bao gồm: thân, lá, hoa, rễ, quả) được giám định tên khoa học bởi Ths Bùi Hồng Quang, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam Tên khoa học của mẫu nghiên cứu đƣợc xác định là Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara, họ Trọng lâu (Trilliaceae)

Mẫu quả đƣợc bỏ hạt, giữ lại phần vỏ quả tiến hành nghiên cứu

Hình 2.1 Mẫu quả Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai.

Hoá chất, trang thiết bị

Các dung môi hóa chất: Cồn 70 o , nước cất hai lần, dung môi n-hexan, ethyl acetat, methanol, aceton, dicloromethan, ether dầu hỏa (Trung Quốc), FeCl 3 5%, chì acetat 10%, gelatin 1%, amoniac, HCl, NaOH, KOH, Na 2 CO 3 , H 2 SO 4 1N, thuốc thử Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT Libermann – Burchardt, TT Natri nitroprussiat, acid picric 1%, TT Baljet, TT Diazo, TT Fehling A, B, TT Lugol (Merck), …

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo YMC (30-50 àm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

SKLM đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F 254 (Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F 254 (Merck, 0.25 mm)

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm (Merck)…

Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI)

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Bếp điện, bếp đun cách thủy

Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

Máy siêu âm Power sonic 405

Máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

[α] D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) đƣợc đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN.

Phương pháp nghiên cứu

Định tính các nhóm chất có trong vỏ quả Bảy lá một hoa bằng các phản ứng hóa học thường quy ghi trong sách Thực tập Dược liệu và Bài giảng Dược liệu tập

1, trường Đại học Dược Hà Nội [2,3,4]

2.3.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc

Phương pháp chiết nóng: sử dụng cồn 70 o ở 70 o C Phương pháp chiết lỏng – lỏng: sử dụng để chiết thành các cao phân đoạn

- Phương pháp phân lập và tinh chế chất tinh khiết:

Phương pháp SKLM, SKC (nguyên tắc theo hình 2.2) [9,12]

Phương pháp rửa, kết tinh

- Phương pháp phổ và so sánh các cơ sở dữ liệu để xác định và nhận dạng cấu trúc: Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, độ quay cực, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ 1 chiều: 1 H-NMR, 13 C- NMR, DEPT), phổ 2 chiều (COSY, HMBC, HSQC) … [9] và so sánh với các cơ sở dữ liệu thực nghiệm và cơ sở sở dữ liệu trước đó

Hình 2.2 Nguyên tắc sắc ký [12]

Minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm chất A, B và C

(lực tương tác với pha tĩnh của A < B < C) theo thời gian a) sắc ký cột b) sắc ký bản mỏng

Định tính các nhóm chất

Tiến hành : Cho khoảng 5 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc cho đều vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 2 ml để làm định tính Ống nghiệm 1: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều

Hiện tượng : Sau phản ứng dung dịch có vẩn đục màu vàng nâu Vẩn đục vàng nâu xuất hiện là do tanin tạo kết tủa với muối kim loại sắt

Kết luận : Phản ứng dương tính Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10%, lắc đều

Hiện tượng : Sau phản ứng thấy dung dịch có xuất hiện kết tủa rất rõ rệt Do tanin tạo kết tủa với muối kim loại chì

Kết luận: Phản ứng dương tính Ống nghiệm 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%, lắc đều

Hiện tượng : Sau phản ứng thì dung dịch không có hiện tƣợng gì xảy ra

Kết luận: Phản ứng âm tính

Kết luận chung: 2/3 phản ứng dương tính với tanin 3.1.2 Định tính flavonoid

Tiến hành: Cho 5 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25 ml cồn 90 o , đun cách thủy sôi trong 10 phút, lọc nóng đƣợc dịch chiết cồn, đem làm các phản ứng flavonoid

Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater): Dung dịch trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanon, flavanonol

Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu vàng và xuất hiện bọt khí thoát ra mạnh mẽ

Kết luận: Phản ứng âm tính

Phản ứng với FeCl 3 5%: Tùy theo nhóm Flavonoid và tùy theo số lƣợng, vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu

Hiện tượng: Dung dịch có xuất hiện kết tủa và chuyển sang màu nâu sẫm

Kết luận: Phản ứng dương tính

Phản ứng với hơi NH 3 :

Hiện tượng: Trên giấy lọc có xuất hiện màu vàng rất nhạt là do nồng độ

Flavonoid rất ít và tùy theo nhóm Flavonoid

Kết luận: Phản ứng dương tính

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na 2 CO 3 ), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút)

Hiện tượng: Dung dịch xuất hiện màu vàng đậm dần lên là do thuốc thử diazo có màu vàng cam

Kết luận: Phản ứng âm tính

Kết luận chung: Như vậy 2/4 phản ứng dương tính

Tiến hành định tính : Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dƣợc liệu, thêm 5 ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt

Hiện tượng: Quá trình tạo bọt xảy ra rất mãnh liệt và bọt còn bền vững sau

Kết luận: Phản ứng dương tính mạnh

Tiến hành định tính: Cho khoảng 5 g bột dƣợc liệu vào bình nón dung tích

100 ml, thấm ẩm dƣợc liệu bằng dung dịch amoniac đặc Sau 30 phút thêm 25 ml cloroform vào, đậy kín Sau 12 giờ lọc lấy dịch chiết cloroform cho vào bình gạn

Lắc kỹ với 10 ml dung dịch H 2 SO 4 1N hai lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết acid lại với nhau, đem làm phản ứng (khi đó dịch có màu trắng)

Phản ứng với thuốc thử Mayer (K 2 HgI 4 ) Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer (Các alcaloid sẽ cho tủa vô định hình màu trắng hoặc trắng ngà)

Hiện tượng: Sau phản ứng ta thấy dung dịch không có hiện tƣợng gì xảy ra

Kết luận: Phản ứng âm tính

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (KBiI 4 ) Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff (Các alcaloid cho tủa màu đỏ cam đến đỏ)

Hiện tượng: Dung dịch chuyển từ không màu sang màu cam do thuốc thử

Kết luận: Phản ứng âm tính

Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat (Các alcaloid cho tủa màu nâu đến nâu đen)

Hiện tượng: Sau phản ứng ta thấy dung dịch không có hiện tƣợng gì xảy ra

Kết luận: Phản ứng âm tính

Kết luận chung: Như vậy không có phản ứng nào dương tính với Alcaloid

Tiến hành định tính: Cho 10 g bột dƣợc liệu vào bình nón 250 ml, ngâm trong 50 ml cồn 25 o trong 24 giờ Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ 100 ml, đem loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% đến dƣ Lọc bỏ tủa qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 100 ml, nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat là lúc đó lƣợng chì acetat đã đủ Cho dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml lắc với chloroform, mỗi lần 8 ml Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã sấy khô, chia đều vào 6 ống nghiệm nhỏ đem cô cách thủy Cắn thu đƣợc để làm các phản ứng

Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn, nghiêng ống 45 o , cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống

Hiện tượng: Dung dịch phân ra thành 2 lớp, lớp dưới có màu trắng còn lớp trên có màu nâu nhạt

Kết luận: Phản ứng dương tính

Cho vào ống nghiệm 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ xuất hiện màu vàng

Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch chuyển từ trắng sang vàng, do dịch chiết đƣợc hòa tan với ethanol và phản ứng với thuốc thử Natri nitroprussiat

Kết luận: Phản ứng dương tính

Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (có màu cam) mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam

Hiện tượng: Ta so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid, thấy ống thử có màu cam đỏ đậm hơn ống chứng

Kết luận: Phản ứng dương tính

Cho vào ống nghiệm 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45 o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong lòng ống

Hiện tượng: Dung dịch trong ống nghiệm phân thành hai lớp, lớp dưới có màu trắng đục lớp trên có màu nâu

Kết luận: Phản ứng dương tính

Kết luận chung: Như vậy 4/4 phản ứng dương tính với Glycosid

Tiến hành định tính: Lấy 10 g bột dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90 o , đun cách thủy tới sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu đƣợc đem làm các phản ứng sau

Phản ứng mở, đóng vòng lacton

- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết: Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để nguyên

- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát: Ống 1: Có tủa đục màu vàng Ống 2: Vàng trong

- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát: Ống 1: Dung dịch có màu vàng trong Ống 2: Vẫn giữ nguyên hiện tƣợng

Kết luận: Phản ứng dương tính

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo

Hiện tượng: Khi nhỏ thuốc thử Diazo vào dung dịch sẽ có màu vàng

Kết luận: Phản ứng dương tính

Kết luận chung: Dƣợc liệu có coumarin

3.1.7 Định tính chất béo, caroten, sterol

Tiến hành định tính: Ngâm 5 g dƣợc liệu trong bình nón dung tích 50 ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm (15 giờ) Lọc lấy dịch lọc đem làm các phản ứng sau: Định tính chất béo: nhỏ một vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên một miếng giấy lọc để khô rồi quan sát

Hiện tượng : Sau khi sấy khô thì vẫn còn thấy vết dung môi

Chiết xuất

Vỏ quả khô (quả đã bỏ loại hạt) (0,5 kg) đƣợc nghiền nhỏ và chiết nóng 3 lần, mỗi lần với dung môi ethanol – nước (7 : 3), tỷ lệ dược liệu – dung môi là 1:10, ở nhiệt độ 70°C Gộp và cô loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được 124,5 g cao ethanol 70%(PCEt) Cao ethanol 70% này được phân tán vào lượng nước tối thiểu (khoảng 600 ml nước) và chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan và ethyl acetat (tỷ lệ dịch cao phân đoạn – dung môi (1:1)), mỗi dung môi chiết 3 lần), cô loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết phân đoạn: n- hexan (1,5 g) và ethyl acetat (PE, 27,6 g), phân đoạn nước (64,5 g) (hình 3.1)

Sau khi chiết các cao phân đoạn, qua tổng quan tài liệu tôi thấy đa số hợp chất đã phân lập đƣợc từ phân đoạn cặn chiết EtOAc của Bảy lá một hoa Nên chúng tôi lựa chọn phân đoạn ethyl acetat để tiền hành phân lập chất.

Khảo sát và phân lập các hợp chất trong cao ethyl acetat

Mục đích: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để phân lập chất

Tiến hành: Sử dụng sắc ký lớp mỏng với bản mỏng pha thường tráng sẵn silica gel 60 F 254 (Merck) đã hoạt hóa, sử dụng các hệ dung môi khác nhau để khảo sát sự phân tách các chất

Kết quả: hệ 3 dung môi: diclomethan – methanol – nước (8:1:0,1) cho sự phân tách tốt nhất, sắc ký đồ phát hiện bằng cho nhiều vết nhất, các vết tách xa nhau với giá trị hằng số lưu (R f ) khác nhau (hình 3.2)

Hình 3.2 Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của cao ethyl acetat

Hệ dung môi: diclomethan – methanol – nước

1 Không phun TT H 2 SO 4 10% trong ethanol, UV 254

2 Phun TT H SO 10% trong ethanol, t o

Bột phần vỏ quả PPC (0,5 kg)

- Chiết nóng ở 70 o C với ethanol 70% ( 3 lần, 3h/lần), tỷ lệ dƣợc liệu/dung môi (1:10)

- Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

- Phân bố cao trong 600 ml nước

- Chiết lỏng-lỏng lần lƣợt bằng các dung môi: n-hexan, ethyl acetat

- Cất loại dung môi dưới áp suất giảm

Cao phân đoạn ethyl acetat (PE, 27,6 g)

Hình 3.1 Sơ đồ chiết cao phân đoạn vỏ quả bảy lá một hoa

3.3.2 Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột

Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập chất trong phân đoạn, trên cơ sở sự hấp phụ của các chất vào silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp

Sắc ký cột phân đoạn EtOAc

+ Chuẩn bị mẫu: 25,2 g cặn chiết phân đoạn EtOAc cho vào bình cầu thêm lượng tối thiểu EtOAc, thêm khoảng 25 g silica gel, lắc đều Cất quay dưới áp suất giảm loại hết EtOAc thu đƣợc hỗn hợp rắn Nghiền hỗn hợp rắn thu đƣợc bằng cối sứ thành hỗn hợp tơi xốp, đồng đều Cảm quan hỗn hợp khô tơi, màu đồng nhất

+ Chuẩn bị cột sắc ký: Chọn cột sắc ký có đường kính  = 5 cm, chiều cao h

= 30 cm Cân khoảng 250 g silica gel (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) cho vào cốc, thêm ngập DCM, khuấy đều cho hết bọt khí Để yên 12 h Lót ở đáy cột một lớp bông mỏng rồi rót từ từ hỗn dịch DCM lên cột Mở khóa cột hứng dung môi, đồng thời bổ sung dung môi, để ổn định cột Khi cột đã ổn định, để mức DCM khoảng 3-5 mm, đƣa hỗn hợp chất đã trộn silica gel lên cột Sau đó phủ lên phía trên bằng một lớp bông mỏng để tránh xáo trộn bề mặt

+ Giải hấp phụ bằng hệ dung môi DCM-MeOH-H 2 O với tỉ lệ nhƣ trong bảng 3.2, hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm thể tích 50 ml, kiểm tra bằng SKLM

Bảng 3.2 Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột phân đoạn EtOAc

Hệ dung môi DCM (ml) MeOH (ml) H 2 O (ml)

Khảo sát bằng SKLM, gộp các phân đoạn thích hợp và cất thu hồi dung môi thu đƣợc 17 phân đoạn trong đó có 3 phân đoạn chính ký hiệu PE1, PE2, PE3

Tiếp tục tiến hành tách phân đoạn PE1 (1,4 g) bằng sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi DCM – MeOH – H 2 O (10:1:0,1-1:1:0,1) và theo dõi bằng SKLM, gộp các ống chứa chất sạch với nhau và cô loại bỏ dung môi, đến khi xuất hiện chất kết tinh, tiến hành lọc và rửa tủa bằng aceton ta thu đƣợc hợp chất 1

(PE30) (15 mg) và hợp chất 2 (PE33) (7 mg).

Phân đoạn PE2 (2,3 g) đƣợc tách trên cột silica gel thành 3 phân đoạn (PE21

- PE23), hệ dung môi rửa giải là DCM – MeOH – H 2 O (10:1:0,1-1:5:0,1) Hợp chất

3 (PE31) (11 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha đảo phân đoạn PE21, rửa giải bằng Aceton – H 2 O (2:1)

Như vậy, bằng phương pháp sắc ký cột pha thường silica gel và pha đảo RP-

18 đã phân lập đƣợc 3 hợp chất, các hợp chất phân lập đƣợc loại hết dung môi, gửi đi đo phổ, ký hiệu 1 (PE30), 2 (PE33), 3 (PE31) Dưới đây là hình ảnh sắc ký đồ bằng TLC của cao PE và các hợp chất phân lập đƣợc (hình 3.4)

CC: Silica gel, DCM-MeOH-H 2 O (100% DCM-5:1:0,1-100% MeOH)

CC: Silica gel, DCM – MeOH – H2O (10:1:0,1-1:1:0,1)

CC: Silica gel, DCM – MeOH – H 2 O

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn PE phần vỏ quả

Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F 254 (Merck, 20x10 cm) cao phân đoạn

EtOAc và các hợp chất phân lập đƣợc

Hệ dung môi: DCM – MeOH – H2O (8:1:0,1) Trong đó:

1 Hợp chất 1 (PE30), 2 Hợp chất 2 (PE33), 3 Cao PE, 4 Hợp chất 3 (PE31)

A Sắc ký đồ tại bước sóng 254 nm

B Sắc ký đồ tại bước sóng 366 nm

C Sắc ký đồ sau khi phun thuốc thử H 2 SO 4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng, tại bước sóng 366 nm

Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất đã phân lập đƣợc

Hợp chất 1 (PE30): dạng tinh thể hình kim màu trắng, có nhiệt nóng chảy 168-

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ H (ppm): 1,01 (s, H-18), 0,70 (s, H-19), 1,02 (d, J=6,5 Hz, H-21), 0,85 (d, J=6,5 Hz, H-29), 0,82 (d, J=7,5 Hz, H-27) và

Hợp chất 2 (PE33): bột màu vàng, điểm nóng chảy 181-183 o C

1H-NMR (500 MHz, actone-d 6 ) δ H (ppm): 7,82 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2΄), 7,69

Hợp chất 3 (PE31):bột màu nâu xám, điểm nóng chảy: 150-152 o C

1H-NMR (500 MHz-MeOD) δ H (ppm): 7,17 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2, H-6),

3.4.2 Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-3

3.4.2.1 Biện giải cấu trúc hợp chất 1 (PE30)

Hợp chất 1 phân lập đƣợc có dạng tinh thể hình kim màu trắng, có nhiệt nóng chảy 168-170 o C

Tiến hành đo 1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) của hợp chất 1 cho kết quả phổ:

Hình 3.6 Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1

Phổ 1 H- NMR của hợp chất 1 cho các tín hiệu đặc trƣng của một steroid với

6 tín hiệu metyl tại δ H: 1,01 (s, H-18), 0,70 (s, H-19), 1,02 (d, J=6,5 Hz, H-21), 0,85 (d, J=6,5 Hz, H-29), 0,82 (d, J=7,5 Hz, H-27) và 0,80 (d, J=7,5 Hz, H-26) Sự có mặt của nhóm -OH tại vị trí C-3 đƣợc khẳng định bởi tín hiệu của nhóm metin với δ H 3,52 (m, H-3) và một nối đôi nội vòng  H 5,35 (d, J=5,0 Hz, H-6), một nối đôi ngoại vòng tại  H 5,16 (dd, J=9,0, 15,5 Hz, H-22) và 5,02 (dd, J=8,5, 15,0 Hz, H-

23) tín hiệu nối đôi này cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 1 không phải là β-sitosterol

Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F 254 (Merck, 20x10 cm) của hợp chất 1 và chất chuẩn stigmasterol

Mặt khác khi chấm sắc ký đối chiếu hợp chất 1 với chất chuẩn stigmasterol trên bản mỏng silica gel 60 F 254 (Merck) với hệ dung môi là n-hexan –EtOAc (10:1) hiện vệt chất màu hồng trên sắc ký đồ và có R f bằng nhau (hình 3.7) Kết quả TLC và phổ 1 H-NMR cho phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 1 là stigmasterol

3.4.2.2 Biện giải cấu trúc hợp chất 2 (PE33)

Hợp chất 2 có dạng tinh thể màu vàng, có nhiệt nóng chảy: 313-314 ºC

Phân tích phổ 1 H-NMR của hợp chất 2 (hình 3.8) cho các tín hiệu đặc trƣng của một flavonol Phổ 1 H-NMR cho tín hiệu của 5 proton, gồm hai proton ghép cặp meta tại δ H 6,51 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8) và 6,26 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6) ứng với cấu trúc 5,7-dihydroxy của vòng A; 3 tín hiệu proton còn lại kiểu ABX tại δ 7,82 (1H, d,

J=2,0 Hz, H-2′), 6,99 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5′), 7,69 (1H, dd, J=8,5 Hz, 2,0 Hz, H-6′) gợi ý vòng B có các vị trí thế tại C1′, C3′ và C4′ Sự vắng mặt tín hiệu đơn ứng với proton H-3 thuộc nhân thơm còn lại cho dự đoán có nhóm thế gắn vào vị trí C3 Mặt khác trên phổ 13 C-NMR cho tín hiệu cacbon tại δ C 136,7 đặc trƣng cho cấu trúc flavonol có vị trí C3 liên kết với nhóm OH

Hình 3.8 Phổ 1 H-NMR của hợp chất 2

Phổ 13 C-NMR (phụ lục 3.2) và phổ DEPT (hình 3.9) cho thấy hợp chất 2 gồm 15 C thuộc nhân thơm trong đó có 10 cacbon bậc 4 và 5 nhóm metin Tín hiệu cacbon tại δ C 176,5 ppm đặc trƣng cho nhóm chức carbonyl tại C-4, 6 tín hiệu cacbon tại δ C 145,8, 148,3, 162,3, 164,9, 157,7 và 146,9 ppm đặc trƣng cho cacbon thuộc vòng benzen liên kết với oxy tương ứng tại các vị trí C-3′, C-4′, C-5, C-7, C-9 và C-2 5 nhóm CH đặc trƣng cho nhân thơm tại δ C 94,2 (C-6), 99,1 (C-8), 115,7 (C-2′), 116,2 (C-5′) và 121,4 (C-6′) ppm

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2 trùng hợp với dữ liệu phổ của quercetin

Hình 3.9 Phổ DEPT của hợp chất 2

3.4.2.3 Biện giải cấu trúc hợp chất 3 (PE31)

Hợp chất 3 có dạng bột màu nâu xám, điểm nóng chảy: 150-152 o C, có tính quang hoạt với độ quay cực [α] 25 D +39 o (c = 0,40, MeOH)

Phổ ESI-MS của hợp chất 3 (hình 3.10) cho píc ion giả phân tử tại m/z 488,9 [M+Cl] - gợi ý công thức phân tử là C 28 H 22 O 6 (ME4,1)

Hình 3.10 Phổ ESI-MS của hợp chất 3

Phổ 1 H-NMR (hình 3.11) cho tín hiệu đặc trƣng của một dimer stilbenoid với các tín hiệu proton của monomer thứ nhất tại δ H 7,06 (d, J=8,5 Hz, H-2ʹ & H-6ʹ),

8ʹ), 6,27 (d, 1,5 Hz, H-12ʹ), 6,19 (d, 2,0 Hz, H-14ʹ); và tín hiệu các proton của monomer còn lại tại δ H 7,17 (d, J=9,0 Hz, H-2 & H-6), 6,79 (d, J=8,5 Hz, H-3 &

6,19 (d, J=2,0 Hz, H-10 & H-14) Hằng số tương tác J=16,0 Hz giữa H-7ʹ và H-8ʹ chứng minh cấu dạng trans của nối đôi trong cấu trúc hợp chất 3

Hình 3.11 Phổ 1 H-NMR của hợp chất 3

Các phổ 13 C-NMR (phụ lục 4.2) và DEPT (phụ lục 4.3) của hợp chất 3 cho tín hiệu của 28 cacbon đặc trƣng của dimer stilbenoid (gồm 2 hợp phần monomer dạng C 6 -C 2 -C 6 ) với 11 cacbon bậc 4 (6 cacbon nhân thơm liên kết với OH có δ C

158-163 ppm), 17 nhóm CH (13 nhóm CH thuộc nhân thơm; 2 nhóm CH của nối đôi ngoại vòng), một nhóm oxymetin tại δ C 94,8; và một nhóm CH no thế 3 lần tại δ C 58,3)

Trên cơ sở phân tích các phổ 1 H NMR, 13 C NMR (hình 3.12 A), HSQC (hình 3.12 B), ESI-MS, và so sánh chúng với các dữ liệu đã đƣợc công bố, hợp chất 3 đƣợc nhận dạng là (+)-trans-ε-viniferin Các đặc trƣng hóa lý khác của hợp chất 3 nhƣ độ quay cực và điểm nóng chảy cũng hoàn toàn phù hợp [25] Vị trí của carbon được xác định bằng các tương tác H-C trực tiếp trên phổ HSQC hoặc gán các vị trí khi so sánh số liệu phổ ở các vị trí tương ứng của hợp chất viniferin tại δ C 162,8 (C-11ʹ), 160,0 (C-11&C-13), 159,6 (C-13ʹ), 158,4 (C-4ʹ), 158,3 (C-4), 147,3 (C-9),

Hình 3.12 Phổ 13 C-NMR (A) và HSQC (B) của hợp chất 3 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất 3 (500MHz-MeOD) và viniferin

6 C nhân thơm liên kết với OH

Bàn luận

Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara) thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae) Bảy lá một hoa là một loài cây thảo nhiều năm, tàn lụi vào mùa đông và để lại những vết lõm trên thân rễ [20] Ở Việt Nam, cây này tìm thấy nhiều ở Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Phú Thọ, Thái Nguyên, Hà Nội (Ba Vì), Hòa Bình, Ninh Bình [6] Một số nghiên cứu về thành phần hóa học loài Paris polyphylla chỉ ra thành phần chủ yếu là các saponin steroid, ngoài ra có các hợp chất favonol, phenolic, đường, acid amin [1,28,54] Hoạt tính sinh học của loài Bảy lá một hoa đƣợc chỉ ra nhƣ tác dụng chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch, cầm máu, chống oxy hóa và giảm đau [32] Trong dân gian, thân rễ đƣợc dùng chữa rắn độc cắn và sâu bọ đốt, viêm não truyền nhiễm, viêm mủ đặc, lao màng não, hen suyễn, trị yết hầu, bạch hầu, trẻ em lên sởi có viêm phổi, quai bị, lòi dom [6] Qua tổng quan tài liệu hiện tại trên thế giới và trong nước chưa có công bố nào về nghiên cứu phần vỏ quả của Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara, đề tài của chúng tôi về “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ cặn ethyl acetat vỏ quả cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara) trồng ở Lào Cai” là nghiên cứu đầu tiên tiến hành định tính, chiết xuất, phân lập, tinh chế, xác định và nhận dạng cấu trúc hóa học một số hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn ethyl acetat của vỏ quả cây Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai

Kết quả định tính bằng các phản ứng hóa học cho thấy trong phần vỏ quả cây Bảy lá một hoa có chứa các nhóm hợp chất: saponin, flavonid, tanin, glycosid, coumarin, chất béo, caroten, sterol, đường khử Kết quả này là cơ sở cho việc chiết xuất và phân lập các hợp chất trong phần vỏ quả của cây Bảy lá một hoa

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết rắn lỏng, sử dụng dung môi ethanol 70%như đã trình bày ở trên Phương pháp này được lựa chọn vì đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, dung môi ethanol dễ kiếm, rẻ tiền, ít độc, chiết đƣợc hầu hết các chất trong dƣợc liệu Tuy nhiên dung môi này không chọn lọc nên dịch chiết ethanol chứa nhiều nhóm chất khác nhau Vì vậy, để thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất, dịch chiết ethanol từ dƣợc liệu tiếp tục đƣợc chiết lỏng lỏng thành các phân đoạn n – hexan, phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn nước

3.5.3 Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất

Sau khi tiến hành sắc ký cột pha thường và pha đảo thu được 3 hợp chất, đƣợc nhận dạng cấu trúc là: stigmasterol (1), quercetin (2), (+)-trans-ε-viniferin (3)

Việc phân lập đƣợc stigmasterol, quercetin, (+)-trans-ε-viniferin phù hợp với kết quả phân tích hóa học sơ bộ bằng các phản ứng định tính trước đó

Dự tính hoạt tính sinh học 3 hợp chất đã phân lập đƣợc:

Stigmasterol là một phytosterol, có nguồn gốc chủ yếu từ dầu đậu nành, có đặc tính làm giảm sự hấp thu cholesterol trong ruột, làm giảm nồng độ cholesterol huyết thanh và lypoprotein tỷ trọng thấp (LDL) ở người mà lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) và triglycerid không bị ảnh hưởng [46] Stigmasterol có khả năng ức chế triiodothyronin huyết thanh (T 3 ) và throxin (T 4 ) tuyến giáp và tăng insulin làm hạ đường huyết, giảm lipid peroxid trong gan và tăng hoạt tính của catalase, superoxid dismutase và glutathione (GSH) thấy tác dụng chống oxy hóa của stigmasterol [34]

Quercetin là một flavonol, cải thiện sức khỏe tim mạch, giảm nguy cơ ung thư, chống loãng xương, chống viêm, chống dị ứng, chống độc và là chất chống oxy hóa tự nhiên có nguồn gốc thực vật và thường thấy trong thực phẩm và có khả năng hấp thụ các gốc tự do [13]

(+)-trans-ε-viniferin một dimer của resveratrol chủ yếu trong nho, có nhiều tác dụng có lợi, chống oxy hóa, chống viêm, phòng ngừa ung thư, tăng cường trí nhớ và cải thiện nhận thức [23]

Mặc dù hợp chất chính đã đƣợc các nghiên cứu chỉ ra trong Bảy lá một hoa là các hợp chất saponin, tuy nhiên qua nghiên cứu này việc phân lập đƣợc 3 hợp chất stigmasterol, quercetin, (+)-trans-ε-viniferin góp phần khẳng định thêm những tác dụng dân gian đã đƣợc sử dụng từ lâu của Bảy lá một hoa

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc 3 hợp chất là stigmasterol (1), quercetin (2), (+)-trans-ε-viniferin (3) từ vỏ quả cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara) Trong đó hợp chất 3 công bố lần đầu trong chi Paris

Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học và nghiên cứu các tác dụng sinh học vỏ quả cây Bảy lá một hoa trồng ở Lào Cai góp phần làm giàu thêm cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nguồn gen quý này định hướng sử dụng trong tương lai của cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng

Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Pham Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây Thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, NXB khoa học và kỹ thuật, 182 -

2 Bộ môn dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 1, trường Đại học Dược

3 Bộ môn dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 2, trường Đại học Dược

4 Bộ môn dược liệu (2006), Thực tập dược liệu - Phần Hóa học, Trường Đại học Dƣợc Hà Nội, 19

5 Bộ y tế (2007), Thực vật học, NXB Y học, 342, 402

6 Võ Văn Chi (bộ mới), Từ điển cây thuốc Việt Nam Tập I, NXB y học, 134-

7 Nguyễn Thị Đỏ (2007), Thực vật chí Việt Nam 8, NXB Khoa học và kỹ thuật, 311 - 321

8 Nguyễn Duy Thuần (2006), Chiết xuất dược liệu - Nghiên cứu thuốc từ thảo dược (Giáo trình sau Đại học), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 199-

9 Ngô Vân Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học, Tập I, NXB Y học

10 Châu Thị Nhã Trúc, Lâm Bích Thảo, Trần Lê Quan và Trần Công Luận

(2015), "Phân lập một số steroid từ loài bảy lá một hoa thu hái tại KonTum",

Tạp chí dược liệu tập 20, số 2/2015, 82-86

11 Viện Dƣợc liệu (2015), "Nghiên cứu phân loại một số loài thuộc chi Paris

(Họ Trilliaceae) ở Việt Nam sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị PCR- RELP", Báo cáo tổng kết đề tài cơ sở, 41-43

12 Bùi Xuân Vững, Cơ sở phân tích sắc ký, 2-3

13 Bentz, A B (2009), "A review of quercetin: Chemistry, antioxidant properties, and bioavailability", Journal of young investigators 19(10)

14 Chen, C X., Lian, H B., Li, Y C and Zhou, J (1990a), "Steroid saponins of the seed from Paris polyphylla var yunnanensis", Acta Bot Yunnan 12,

15 Chen, C X., Zhang, Y T and Zhou, J (1983a), "Studies on the saponin components of plants in Yunnan VI Steroid glycosides of Paris polyphylla

SM var yunnanenis (FR.) HM (2)", Acta Bot Yunnan 5, 91-97

16 Chen, C X.and Zhou, J (1987), "The steroidal saponins of Paris axialis (2)",

17 Chen, C X., Zhou, J., Nagasawa, H and Suzuki, A (1995b), "Two minor steroidal saponins from the aerial parts of Paris polyphylla var yunnanensis", Acta Bot Yunnan 17, 215-220

18 Chen, C X., Zhou, J., Zhang, Y T and Zhao, Y Y (1990b), "Steroid saponins of aerial parts of Paris polyphylla var yunnanesis", Acta Bot

19 Dutt, A T., Chatterjee, N R., Ghpsh, S and Chopra, R N (1938),

"Chemische Untersuchung der Wurzeln von Paris polyphylla", I Teil Arch

20 Flora of China (2000), " Paris Linnaeus", Sp 24, 89-90

21 Gao, L L., Li, F R., Jiao, P., Yang, M F., Zhou, X J., Si, Y H., Jiang, W J and Zheng, T T (2011), "Paris chinensis dioscin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells", World J Gastroenterol 17(39), 4389-4395

22 Gao, L.L., Li, F R., Jiao, P., Yao, S T., Sang, H and Si, Y H (2011),

"Apoptosis of human ovarian cancer cells induced by Paris chinensis dioscin via a Ca (2+)-mediated mitochondrion pathway", Asian Pac J Cancer Prev

23 Groundwater, P W., Hamid, K., Ng, I., Tallapragada, V J., Hibbs, D E and

Hanrahan, J (2015), "The Differential Effects of Resveratrol and trans-ε-

Expressed in Xenopus Laevis Oocytes", Journal of Pharmacy &

24 Jiang, H., Zhao, P., Feng, J., Su, D and Ma, S (2014), "Effect of Paris saponin I on radiosensitivity in a gefitinib‑resistant lung adenocarcinoma cell line", Oncology letters 7(6), 2059-2064

25 Li, W W., Ding, L S., Li, B G and Chen, Y Z (1996), "Oligostilbenes from Vitis heyneana", Phytochemistry 42(4), 1163-1165

26 Liang Songyunand Soukuppp, V G (2000), "Paris Linnaeus", Flora of

27 Liang Songyunand Victor G.Soukup (2013), Flora of China, 1753

28 Manoheiran K P., Beving T K H and Yang D N (2003), Phytochemitry

29 Matsuda, H., Pongpiriyadacha, Y., Morikawa, T., Kishi, A., Kataoka, S and

Yoshikawa, M (2003), "Protective effects of steroid saponins from Paris polyphylla var yunnanensis on ethanol-or indomethacin-induced gastric mucosal lesions in rats: structural requirement for activity and mode of action", Bioorganic & medicinal chemistry letters 13(6), 1101-1106

30 Mimaki, Y., Kuroda, M., Obata, Y., Sashida, Y., Kitahara, M., Yasuda, A.,

Naoi, N., Xu, Z W., Li, M R and Lao, A N (2000), "Steroidal saponins from the rhizomes of Paris polyphylla var chinensis and their cytotoxic activity on HL-60 cells", Natural Product Letters 14(5), 357-364

31 Miyamura, M., Nakano, K., Nohara, T., Tomimatsu, T and Kawasaki, T

(1982), "Steroidal saponins from Paris polyphylla Sm – supplement", Chem

32 Negi J S., Bisht V K., Bhandari A K., Bhatt V P., Singh P and Singh N

(2014), "Paris polyphylla: chemical and biological prospectives", Anti- Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents) 14(6), 833-839

33 Nohara, T., Ito, Y., Seike, H., Komori, T., Moriyama, M., Gotmita, Y and

Kawasaki, T (1982), "Study on the constituents of Paris quadriforia L", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 30(5), 1851-1856

34 Panda, S., Jafri, M., Kar, A and Meheta, B (2009), "Thyroid inhibitory, antiperoxidative and hypoglycemic effects of stigmasterol isolated from

35 Qin, X J., Yu, M Y., Ni, W., Yan, H., Chen, C X., Cheng, Y C., He, L and

Liu, H Y (2016), "Steroidal saponins from stems and leaves of Paris polyphylla var yunnanensis", Phytochemistry 121, 20-29

36 Qin, X J., Chen, C X., Ni, W., Yan, H and Liu, H Y (2013), "C 22- steroidal lactone glycosides from stems and leaves of Paris polyphylla var yunnanensis", Fitoterapia 84, 248-251

37 Qin, X J., Sun, D J., Ni, W., Chen, C X., Hua, Y., He, L and Liu, H Y

(2012), "Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves of Paris polyphylla var yunnanensis", Steroids 77(12), 1242-1248

38 Selvaraj, K., Chowdhury, R and Bhattacharjee, C (2013), "Isolation and structural elucidation of flavonoids from aquatic fern Azolla microphylla and evaluation of free radical scavenging activity", Int J Pharm Pharm Sci 5(3),

39 Seshadri, T.and Vydeeswaran, S (1972), "Constitution of pariphyllin, a saponin isolated from the tubers of Paris polyphylla", Indian journal of chemistry

40 Shah, S A., Mazumder, P and Choudhury, M D (2012), "Medicinal properties of Paris polyphylla Smith: a review", J herbal med Toxicol 6, 27-

41 Shu, C Y., He, Y., Chun, C., Zeng, Y., Xue, D., Yan, W F., Wang, L., Hao,

Z and Rong, D J (2014), "Growth inhibition by pennogenyl saponin from Rhizoma paridis on hepatoma xenografts in nude mice", Steroids 83, 39-44

42 Singh, S B.and Thakur, R S (1982), "Structure and stereochemistry of paristerone A novel phytoecdysone from the tubers of Paris polyphylla", Phytochemistry 38, 2189–2194

43 Singh, S B., Thakur, R S and Schulten, H R (1980), "Spirostanol saponins from Paris polyphylla, structures of polyphyllin C, D, E and F", Phytochemistry 21(12), 2925-2929

44 Uprety, Y., Asselin, H., Boon, E K., Yadav, S and Shrestha, K K (2010),

"Indigenous use and bio-efficacy of medicinal plants in the Rasuwa District, Central Nepal", Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine 6(1), 3

45 Wang, Q., Xu, G and Jiang, Y (1990), "Analgesic and sedative effects of the Chinese drug rhizoma Paridis", Chinese materia medica 15(2), 109-11,

46 Wester, I (2000), "Cholesterol-lowering effect of plant sterols", European

Journal of Lipid Science and Technology 102(1), 37-44

47 Wu, X., Wang, L., Wang, H., Dai, Y., Ye, W C and Li, Y L (2012),

"Steroidal saponins from Paris polyphylla var yunnanensis", Phytochemistry 81, 133-143

48 Xiao C M., H J., Tan X Y., Tang M., Zhang H (2009), "Chemical constituents of Paris polyphylla var pseudothibetica", West China J Pharm

49 Xu X M.and Zhong Z C (1988), "Studies on chemical constituents of Paris polyphylla var chinensis", Chin Tradit Herb Drugs 15, 138-140

50 Zhang, J Y., Wang, Y Z., Zhao, Y L., Yang, S B., Zuo, Z T., Yang, M Q.,

Zhang, J., Yang, W Z., Yang, T M and Jin, H (2011), "Phytochemicals and bioactivities of Paris species", Journal of Asian Natural Products Research

51 Zhao, Y., Kang, L P., Liu, Y X., Zhao, Y., Xiong, C Q., Ma, B P and

Dong, F T (2007), "Three new steroidal saponins from the rhizome of Paris polyphylla", Magnetic Resonance in Chemistry 45(9), 739-744

52 Zhou, Anhuan, Huang, Yongming, Li, Xun, Ni and Dazhou (1984),

"Identification and quantitative determination of amino acids in Yun Mu Xiang (Sausurea lappa) and manyleaf paris (Paris polyphylla)",

53 Zhou, L.and Yang, C Z (2003), "Heptasaccharide and octasaccharide isolated from Paris polyphylla var yunnanensis and their plant growth- regulatory activity", Plant Sci 165, 571–575

54 Yun, H., Lijian, C., Wenhong, Z., Yuhong, D., Yongli, W., Qiang, W and

Ding, Z (2007), "Separation and identification of steroidal compounds with cytotoxic activity against human gastric cancer cell lines in vitro from the rhizomes of Paris polyphylla var chinensis", Chemistry of Natural Compounds 43(6), 672-677.