LUẬN văn THẠC sĩ bào chế và đánh giá một số tác dụng của gel mật ong trong hỗ trợ chăm sóc vết thương

TỔNG QUAN

Thuốc điều trị vết thương hở

1.1.1 Giới thiệu chung về vết thương

Vết thương xảy ra nhiều lần trong cuộc sống, kèm theo sự chảy máu

Do đó, việc chữa lành vết thương là cần thiết để tránh chảy máu và mất nước từ các mạch và mô Các cơ quan có thể bị thương do các tác động bên ngoài (vật lý, hoá học) hay rối loạn nội bộ (bệnh) Vết thương có thể đơn giản hoặc phức tạp, vô trùng hoặc nhiễm trùng, cấp tính hoặc mạn tính [41] Các vết thương mạn tính liên quan đến khả năng tự phục hồi của bệnh nhân, nguyên nhân gây bệnh như các bệnh nhiễm trùng mạn tính hoặc rối loạn chuyển hoá

Các rối loạn chuyển hoá như tiểu đường có thể dẫn đến nhiễm trùng, những biến chứng phức tạp và làm các vết thương lâu hồi phục [37] Có rất nhiều lý do như nghèo đói, vệ sinh kém, suy dinh dưỡng, côn trùng và ô nhiễm môi trường có thể gây ra các vết thương và làm trầm trọng thêm hậu quả của vết thương [23] Chữa lành vết thương là một quá trình phức tạp liên quan đến nhiều loại tế bào chuyên biệt, chúng hoạt động tương tác với nhau dưới sự điều khiển của các phân tử do chúng ta tiết ra Quá trình phức tạp này diễn ra theo các giai đoạn và có sự trùng lặp lẫn nhau [25] Quá trình liền vết thương trải qua 4 giai đoạn cơ bản: giai đoạn cầm máu, giai đoạn viêm, giai đoạn tăng sinh và giai đoạn tái tạo [17] Điều trị vết thương hở là quá trình khôi phục lại tình trạng lành mạnh của bất kì chấn thương nào gây ra gián đoạn trong sự liên tục của bề mặt bên ngoài cơ thể Quá trình này phục hồi nguyên vẹn các mô bị tổn thương bằng cách thay thế mô chết bằng các mô mới Việc này bắt đầu ngay sau khi bị thương, có thể tiếp tục trong nhiều tháng hoặc nhiều năm, và về cơ bản là giống nhau đối với tất cả các loại vết thương Việc sửa chữa các tế bào bị tổn thương và mô diễn ra trong quá trình tái tạo Trong đó, các cấu trúc được thay thế bởi sự gia tăng các tế bào tương tự, như xảy ra với da và xương; và bằng cách hình thành sẹo, bao gồm các cấu trúc sợi với một số mức độ co lại Vì hầu hết các vết thương liên quan đến nhiều mô, sự hồi phục hoàn toàn là không thể Do đó, sự hình thành sẹo là một kết quả của việc chữa lành vết thương [15]

1.1.2 Các thuốc được sử dụng trong điều trị vết thương hở

Các yêu cầu của một thuốc bôi vết thương hở tốt bao gồm: Có tác dụng với các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn vết thương với tỷ lệ kháng thuốc thấp nhất, không hoặc ít gây hại cho mô lành và tế bào lành, không hoặc ít có tác dụng phụ, thấm sâu vào các mô [12] Dưới đây là một số thuốc bôi vết thương hở được sử dụng phổ biến hiện nay:

Oxi già là dung dịch màu trong suốt, có tác dụng oxi hóa khá mạnh Ở nồng độ lớn hơn 3% dung dịch oxi già có thể gây bỏng Oxi già thông thường dùng để sát khuẩn vết thương mới, có mủ, vết thương có hiện tượng nhiễm trùng và đặc biệt là các vết thương có dị vật Dung dịch oxy già không được sử dụng cho vết thương đang lành vì nó có thể làm tổn thương mô mới Khi sử dụng oxi già có hiện tượng sủi bọt, làm sạch mô chết và loại trừ mủ, đẩy dị vật ra ngoài [46]

Cồn 70 độ (cồn có nồng độ cao hơn không có khả năng sát trùng) được sử dụng rộng rãi để diệt khuẩn các dụng cụ chăm sóc vết thương, sát trùng trước khi tiêm và sát trùng vết thương trước khi băng bó [1]

Cồn i-ốt là dung dịch có khả năng sát khuẩn mạnh nhờ khả năng sát khuẩn của i-ốt (cồn chỉ có tác dụng hòa tan i-ốt) Dung dịch này không những có khả năng sát trùng, nó còn có khả năng phá hủy chất hữu cơ (da), gây nhiễm độc i-ốt nếu dùng lâu, đặc biệt là với trẻ em Vì vậy không nên dùng cồn i-ốt với những vết thương sâu, vùng da nhạy cảm, với trẻ nhỏ [43]

Thuốc đỏ có khả năng làm khô, chống lở loét vết thương Tuy nhiên dung dịch này không tốt vì nó có chứa thủy ngân Vậy nên dung dịch này chỉ nên dùng với vết thương nhỏ, không gần mạch máu vì thủy ngân nếu ngấm vào máu có thể gây chết người [22]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Thuốc tím được pha loãng trước khi bôi lên vết thương Dung dịch này dùng để thấm dịch và tiêu diệt một số vi khuẩn, sát trùng vết thương Tuy nhiên một số vi khuẩn dung dịch này không tiêu diệt được [8]

Bạc sulfadiazine là sự kết hợp của bạc với một sulfamide Nhiều phối hợp của bạc với các sulfamide khác nhau đã được nghiên cứu thử nghiệm in vitro, kết quả cho thấy bạc sulfadiazin cho tác dụng tốt nhất Điều này có thể được giải thích là do sự liên kết mạnh của bạc sulfadiazin với DNA của vi sinh vật Thuốc có phổ kháng khuẩn rộng, tiêu diệt được nhiều loại vi sinh vật như S aureus, E coli, Klebsiella, P aeruginosa, Proteus, Enterobacteraceae và cả C albicans Bạc sulfadiazine có thể gây giảm bạch cầu Tác dụng phụ này gặp ở 5 - 15% bệnh nhân, thường xảy ra khi sử dụng trên diện tích rộng, 2 - 3 ngày sau khi bắt đầu dùng thuốc Bạc sulfadiazine được sản xuất từ năm 1960, dưới dạng kem nồng độ 1% màu trắng không tan trong nước, ít thấm sâu vào hoại tử, khó vệ sinh vết thương, thời gian tác dụng ngắn Sản phẩm có thể làm giảm khả năng tái tạo biểu mô còn độc tính đối với tủy xương chủ yếu là do propylen glycol có trong dạng thuốc gây nên

Sự đề kháng của vi khuẩn trên dòng sản phẩm này cũng đã được ghi nhận [2]

 Madecassol oil Đây là dạng thuốc mỡ được bào chế từ dịch chiết của cây rau má (Centella asiatica) Ngoài ra, sản phẩm này còn chứa kháng sinh neomycin và chất kháng viêm hydrocortisol Madecassol oil được sản xuất từ năm 1970, dùng để bôi lên vết thương hở nhằm tránh nhiễm khuẩn, tăng cường khả năng hồi phục vết thương, hạn chế để lại sẹo Sản phẩm này không dùng cho những vết thương bị nhiễm thứ cấp hoặc các bệnh nhân nhạy cảm với neomycin và hydrocortisol [45].

Tổng quan về mật ong và tác dụng của mật ong trong điều trị vết thương hở

1.2.1 Giới thiệu chung về mật ong

Mật ong là chất lỏng đặc sánh, hơi trong và dính nhớt, màu vàng nhạt hoặc vàng cam đến nâu hơi vàng Khi để lâu hoặc để lạnh sẽ có những tinh thể dạng hạt dần dần tách ra Mùi thơm, vị rất ngọt [10] Mật ong là một dung dịch bão hòa có nguồn gốc từ ong bao gồm chủ yếu là fructose và glucose

Ngoài ra, mật ong còn chứa các protein, các axit amin, vitamin, enzym, khoáng chất và các thành phần thiết yếu khác như:

 Nước: Trong mật ong, nước thường chiếm từ 16% đến 21%, còn các chất keo chiếm khoảng 80% [11]

 Đường: Là thành phần chính trong mật ong Có tất cả ba loại đường chủ yếu là:

 Glucose: Chiếm 50% tổng số đường trong mật ong và 35% trong khối lượng mật [11]

 Fructose: Đường fructose khó kết tinh, loại mật ong nào chứa nhiều đường frutose sẽ để được lâu hơn mà vẫn giữ được ở thể lỏng Đường fructose ngọt hơn đường glucose Cả hai loại đường này đều dễ hấp thụ vào cơ thể [11]

 Sacarose: Chỉ có khoảng 2%, thuộc loại đường kép khó hấp thụ vào cơ thể Mật ong non có thể chứa tới 6% sacarose [11]

 Protein: Có từ 0,04 - 3%; gốc protein từ mật hoa (protein thực vật) và từ dịch do chính con ong tiết ra (protein động vật) [10]

 Các hợp chất phenolic: Mật ong có chứa khoảng 0,1% - 0,5% các hợp chất phenolic Các hợp chất này có nhiều tác dụng như chống oxy hoá, chống vi khuẩn, chống vi rút, chống ung thư và nhiều hoạt tính sinh học khác [11]

 Enzym: Trong mật ong có chứa nhiều loại enzym có vai trò quan trọng đối với hệ tiêu hoá của con người như amylase, invertase, catalase và phosphorylase [4, 35]

 Axit hữu cơ: Axit hữu cơ chiếm một tỷ lệ nhỏ khoảng 0,57% (theo tổng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU axit hữu cơ như formic, oxalic, malic, maleic, succinic, citric, gluconic, glutaric và fumaric đã được phát hiện ở nhiều loại mật ong khác nhau ở các nồng độ khác nhau [24]

 Chất khoáng: Tổng hàm lượng khoáng chất của mật ong xấp xỉ 0,04% - 0,2%, bao gồm kali, canxi, natri, magie, photpho, lưu huỳnh, i-ốt Đặc biệt hàm lượng muối khoáng trong mật ong tương tự như trong máu người [7]

 Vitamin: Hàm lượng vitamin trong mật ong không nhiều nhưng có nhiều loại Nguồn gốc vitamin này do phấn hoa trong mật mà ra Viện Nghiên cứu Liên Xô phân tích 1 kg mật ong giàu vitamin B2 bằng 10 lần hàm lượng vitamin B2 có trong nho, táo Ngoài ra, trong mật còn có chứa các vitamin như vitamin PP, B6, C, E, K và caroten [7]

1.2.2 Tác dụng sinh học của mật ong

Mật ong có một số đặc tính sinh học đáng lưu ý như:

 Tác dụng kháng khuẩn : Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh mật ong hay dung dịch chứa từ 30% mật ong trở lên là môi trường mà đa số vi khuẩn và nấm không thể phát triển được Những vết thương, vết mổ được băng bó bằng mật ong sẽ chóng khô, sạch và không có mùi hôi, vì mật ong đã hút nước và chống được sự lây lan của vi khuẩn [33] Mật ong có tác dụng kháng khuẩn là nhờ sự có mặt của glucose oxidase và nhiều chất có tác dụng kháng khuẩn, áp suất thẩm thấu cao, pH axit Mật ong có phổ kháng khuẩn rộng, được chứng minh là có khả năng ức chế hơn 80 loại vi khuẩn, ví dụ như

S aureus, Enterococcus kháng vancomycin, và P aeruginosa [27, 40]

 Tác dụng chống oxi hóa : Các axit phenolic và flavonoid có trong mật ong đóng vai trò quan trọng đối với khả năng chống oxi hóa Mật ong sử dụng một mình hoặc phối hợp có khả năng phòng chống và ngăn ngừa một số bệnh như xơ vữa động mạch và ung thư [14, 27, 36]

 Tác dụng làm lành vết thương : Nhiều nghiên cứu cho thấy mật ong có hiệu quả trong chữa lành các vết thương do tác dụng kháng khuẩn, chống viêm, và chống oxy hóa Mật ong có độ nhớt cao, do đó hình thành hàng rào vật lý và tạo môi trường ẩm lý tưởng cho vết thương mau lành [26] Mphande và cộng sự đã so sánh tác dụng của mật ong và đường trên 40 bệnh nhân bị loét, viêm màng phổi mạn tính, hoặc có vết thương sau phẫu thuật Tốc độ lành vết thương trung bình là 1,43 ngày/cm 2 đối với nhóm dùng mật ong và 1,62 ngày/cm 2 đối với nhóm dùng đường [44] Trong một nghiên cứu khác, điều trị vết bỏng bằng mật ong giúp cải thiện rõ rệt tình trạng của vết thương sau 7 và 14 ngày Đến ngày thứ 14 có 74,11% (229/302) bệnh nhân đã được chữa lành với mật ong, trong khi chỉ có 57,89% (154/266) bệnh nhân được chữa lành bằng các phương pháp khác [7] Ingle và cộng sự so sánh tác dụng của mật ong và chế phẩm IntraSite Gel trên bệnh nhân bị rách hoặc trầy xước da Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong thời gian hồi phục trung bình và kích thước vết thương giữa các nhóm được điều trị với mật ong và chế phẩm hydrogel [32]

 Tác dụng dưỡng da: Mật ong được kí hiệu trong Danh mục Thành phần Mỹ phẩm Quốc tế (INCI) dưới tên gọi "Honey" hoặc "Mel" (số CAS 8028-66-8), và được xếp vào nhóm làm mềm da/làm ẩm/dưỡng ẩm Tác dụng dưỡng ẩm của mật ong chủ yếu liên quan đến hàm lượng fructose và glucose cao, có khả năng tạo cầu hydro với nước và duy trì độ ẩm của lớp sừng [39]

Khả năng tái tạo da xuất phát từ sự có mặt của các axit amin (chủ yếu là prolin) và các axit hữu cơ (chủ yếu là axit gluconic) Mật ong thường được sử dụng trong mỹ phẩm với tỷ lệ từ 1 - 10% [13]

 Tác dụng dưỡng tóc : Mật ong tỉ lệ 3 - 20% trong dầu gội đầu có tác dụng làm giảm tóc rối, giúp tóc suôn mượt, giữ độ ẩm và dễ chải [28] Nhờ đặc tính kháng khuẩn và chống nấm, mật ong cũng được sử dụng để trị gàu

1.2.3 Tính chất, cơ chế tác dụng của mật ong trong quá trình hồi phục vết thương

 Cơ chế của mật ong trong quá trình hồi phục vết thương

Sự hiện diện của axit ascorbic trong mật ong có thể thúc đẩy hoạt động diệt khuẩn của hydro peroxit Ở vi khuẩn gram âm, hỗn hợp của hydro peroxit và axit ascorbic làm tăng sự ly giải và sự chết của chúng bằng lysozym

Hydro peroxit có thể thu hút bạch cầu tới vết thương thông qua cơ chế gradien

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU trưởng nội mô mạch (VEGE) và kích thích hình thành thành mạch Trong giai đoạn viêm cấp tính, bạch cầu trung tính sẽ giải phóng các loại oxy hoạt tính diệt khuẩn, hydro peroxit có khả năng diệt khuẩn và ngăn ngừa nhiễm trùng

Việc sử dụng hydro peroxit thường không thuận lợi cho việc chữa lành vết thương vì nó gây viêm và tổn thương mô quá mức Tuy nhiên, mật ong bằng cách vô hiệu hóa sắt tự do, hạn chế hydro peroxit hình thành gốc oxy tự do, làm giảm tác hại của hydro peroxit Mặt khác, mức hydro peroxit trong mật ong rất ít, thấp hơn khoảng 1000 lần so với dung dịch 3% thường được sử dụng như một chất khử trùng Ngoài hoạt tính kháng khuẩn, hydro peroxit kích thích sự gia tăng nguyên bào sợi, sự hình thành mạch và tăng cường lưu thông máu trong các vết loét thiếu máu cục bộ [31]

Khái niệm, phân loại, phương pháp tạo gel

Medihoney® Gel chứa 80% mật ong Manuka được phân tán trong các chất nền tạo gel từ thiên nhiên Sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên, có thể được sử dụng cho nhiều loại vết thương khác nhau như: bỏng nhẹ, vết cắt, trầy xước, loét Gel có tác dụng làm sạch vết thương, ngăn ngừa nhiễm khuẩn

Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả hồi phục vết thương đáng kể của Medihoney® Gel trên các vết bỏng nhẹ, trầy xước, loét, vết cắt, bong da và Eczema Gel đòi hỏi phải thay băng hằng ngày Khi thay băng, gel sẽ được loại bỏ cùng với miếng gạc Phần gel còn lại có thể dễ dàng được rửa trôi bằng các chất rửa vết thương thông thường [3]

Chưa thấy có tác dụng phụ thường gặp nào của thuốc được báo cáo

Thuốc không gây độc, không gây kích ứng, không làm ảnh hưởng đến mô lành ở các vết thương cấp hoặc mạn tính Không được sử dụng sản phẩm trên các bệnh nhân dị ứng với mật ong [3]

Hình 1.2 Thuốc điều trị vết thương hở Medihoney® Gel [3]

1.3 Khái niệm, phân loại gel, phương pháp tạo gel 1.3.1 Khái niệm gel

Gel là một hệ phân tán có môi trường phân tán ở thể rắn và chất phân

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU dịch nhưng không bằng chất rắn Gel bôi da và niêm mạc là những chế phẩm có thể chất mềm, trong đó có một hay nhiều dược chất được hoà tan hay phân tán trong tá dược polyme thiên nhiên hoặc tổng hợp [29]

Theo Dược điển Việt Nam IV, gel được phân thành 2 loại:

 Gel thân dầu (Olegels): Trong thành phần sử dụng tá dược tạo gel, bao gồm dầu paraffin phối hợp với tá dược thân dầu khác, có thêm keo silic, xà phòng nhôm và xà phòng kẽm [1]

 Gel thân nước (Hydrogels): Thành phần bao gồm nước, glycerin, propylen glycol, có thêm tá dược tạo gel như polysaccharid (tinh bột, tinh bột biến tính, axit alginic và natri alginat), dẫn chất cellulose, polyme của axit acrylic (carbomer, carbomer copolyme, carbomer interpolyme, methyl acrylat) [1]

Hydrogel là hệ gel có cấu trúc mạng ba chiều thu được bằng phương pháp tổng hợp các polyme tự nhiên mà có thể hấp thụ và giữ lại lượng nước đáng kể [20]

 Hydrogel cố định/hoá học:

Mạng lưới gel khi đồng hoá trị liên kết chéo (thay thế liên kết hydro bằng một liên kết hoá trị mạnh) [20]

 Hydrogel hồi phục/vật lý:

Mạng lưới gel được tổ chức lại bằng rối loạn phân tử hoặc các năng lượng thứ cấp bao gồm liên kết ion, liên kết hydro và tương tác kỵ nước

Trong các gel có liên quan đến thể chất, sự phá huỷ được ngăn ngừa bởi các tương tác vật lý tồn tại giữa các chuỗi polyme khác nhau [20]

 Khả năng giữ nước và thấm là những tính chất đặc trưng quan trọng nhất của một hydrogel Các nhóm ưa nước là yếu tố đầu tiên bị hydrat hoá khi tiếp xúc với nước dẫn tới sự hình thành ràng buộc với nước [19]

 Sự tương thích sinh học: Hydrogel có khả năng tương thích với hệ thống miễn dịch và các sản phẩm phân hủy của nó không độc hại Bề mặt ưa nước của hydrogel có năng lượng tự do thấp khi tiếp xúc với dịch cơ thể, protein và các tế bào Bản chất mềm mại và đàn hồi của hydrogel giảm thiểu kích ứng đối với các mô xung quanh [19]

 Các liên kết chéo giữa các chuỗi polyme: Do trong cấu trúc có lượng nước đáng kể nên hydrogel có mức độ linh hoạt như mô tự nhiên [9]

 Yếu tố ảnh hưởng đến hydrogel:

Hydrogel có thể bị kích thích, nhạy cảm và phản ứng với môi trường xung quanh bởi các yếu tố như nhiệt độ, độ pH và sự có mặt của chất điện phân Nồng độ và tính chất của dược chất cũng ảnh hưởng trực tiếp đến thể chất và tình trạng của hydrogel [30]

Hydrogel của nhiều loại polyme tổng hợp và tự nhiên được sản xuất ứng dụng chủ yếu trong kỹ thuật cấy mô, dược phẩm, và các lĩnh vực y sinh

[21] Do khả năng hấp thụ nước cao và sự tương thích sinh học, hydrogel đã được sử dụng cho mục đích băng vết thương, phân phối thuốc, nông nghiệp, băng vệ sinh, vật liệu nha khoa, cấy ghép, ứng dụng mắt, các cơ quan lai ghép (đóng gói các tế bào sống) [33]

Bảng 1.2 Ứng dụng của hydrogel và ví dụ các polyme [33] Ứng dụng Polyme

- Chăm sóc vết thương - Polyurethan, polyethylen glycol, polypropylen glycol, xanthan

- Phân phối thuốc, dược phẩm - Starch, polyvinylpyrrolidon, polyacrylic axit, carboxymethyl cellulose

- Vật liệu nha khoa - Hydrocolloid Ghatti, Karaya

- Kỹ thuật nuôi cấy mô, cấy ghép

- Poly vinylalcohol, polyacrylic axit, collagen

- Hệ thống polyme tiêm - Polyester, polyphosphazen, polypeptid, chitosan

- Kỹ thuật sản xuất (mỹ phẩm, dược phẩm)

- Tinh bột, gôm Arabic, pectin, carrageenan

- Khác (nông nghiệp, xử lý chất thải, tách, …)

- Poly vinyl methyl ether, poly (N-isopropyl acrylamid), polyvinyl alcohol

 Cơ chế hình thành gel:

 Làm nóng/làm lạnh một dung dịch polyme:

Sự hình thành gel là do sự hình thành các liên kết xoắn ốc và tạo thành các đường giao nhau Polyme trong dung dịch nóng trên nhiệt độ nóng chảy chuyển tiếp xuất hiện dưới hình dạng cuộn dây ngẫu nhiên Khi làm lạnh nó chuyển đổi thành cuộn xoắn cứng Với sự hiện diện của muối (K + , Na + ), do sàng lọc đẩy nhóm sulfonat (SO3 2-), các xoắn đôi kết hợp lại để hình thành các gel ổn định [19]

Các polyme ion có thể được liên kết chéo bằng cách thêm các phản ứng di- hoặc tri-valent Phương pháp này phù hợp với nguyên tắc của một dung dịch polyelectrolyt (ví dụ Na + alginat-) với một ion đa trị của các điện tích đối diện (ví dụ Ca 2+ + 2Cl - ) Một số ví dụ khác là chitosan-polylysin, muối phosphat chitosan-glycerol, chitosan-dextran [19]

Các gel đông đặc có thể được tạo ra bằng cách trộn một polyanion với polycation Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là các polyme có điện tích ngược nhau gắn kết và tạo thành các phức hòa tan và độ hòa tan tùy thuộc vào nồng độ và độ pH của các dung dịch tương ứng Một ví dụ như vậy là polyanionic xanthan với polycationic chitosan Protein dưới điểm đẳng điện của nó tích điện dương và có thể kết hợp với các hydrocoloid anion và tạo phức hydrogel polyion [19]

NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

 Bào chế gel mật ong:

Gel mật ong được bào chế từ những nguyên liệu sau:

Bảng 2.1 Nguyên liệu bào chế gel mật ong STT Nguyên liệu Xuất xứ Tiểu chuẩn

1 Mật ong Việt Nam DĐVN V

3 Na CMC Trung Quốc DĐVN V

6 Natri benzoat Trung Quốc DĐVN V

7 Propylen glycol Trung Quốc DĐVN V

11 Nước cất Việt nam DĐVN IV

 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn: Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của gel mật ong sử dụng:

 Giống vi sinh vật kiểm định: Do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

Proteus mirabilis BV 108 (P mirabilis) Shigella flexneri DT 112 (S flexneri)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (B subtilis) Sarcina lutea ATCC 9341 (S lutea)

• Môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định:

NaCl 0,5%; Pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; nước vừa đủ 100 ml

NaCl 0,5%; Pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; thạch 1,6%; nước vừa đủ 100 ml; pH = 7,2 - 7,4

 Mẫu kháng sinh chứng (KSC)

• Streptomycin: 20 àg/ml đối với vi khuẩn Gram (-)

• Benzathin penicillin G: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gram (+)

 Mẫu so sánh: Mật ong hoa nhãn (Công ty Cổ phần ong trung ương, số lô: 100889)

 Đánh giá khả năng chống oxy hoá:

Các mẫu gel mật ong được thử tác dụng chống oxy hoá bằng những nguyên liệu được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Nguyên liệu thử tác dụng oxy hoá gel mật ong STT Nguyên liệu Xuất xứ Tiêu chuẩn

 Máy đo độ nhớt MRC VIS-8

 Máy đo quang phổ Shimadzu UV-2600

 Máy khuấy từ IKA-WERKE

 Cân phân tích, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, buret, …

2.2 Nội dung nghiên cứu Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

Nội dung 1: Khảo sát khả năng tạo gel của một số polyme với mật ong bằng phương pháp hoà tan

 Đánh giá một số đặc tính của hệ gel: Cảm quan, pH, độ nhớt

 Khảo sát độ ổn định của hệ gel bào chế được

Nội dung 2: Bào chế gel mật ong 60%

 Nghiên cứu xây dựng công thức bào chế gel mật ong 60%

 Viết quy trình bào chế gel mật ong 60%

 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel mật ong trên một số chủng vi sinh vật

 Đánh giá khả năng chống oxy hoá của gel bào chế được

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát khả năng tạo gel của một số polyme với mật ong

Mật ong được đưa vào dạng thuốc dùng qua da nhằm mục đích hỗ trợ chăm sóc vết thương tại chỗ, có tác dụng kéo dài Để đạt được điều đó, mật ong phải ổn định sau khi đưa vào dạng bào chế Vì vậy cần khảo sát một số tá dược tạo gel khác nhau như: NaCMC, HEC, Carbopol, Chitosan tại một số nồng độ khác nhau Theo dõi độ ổn định, trạng thái của mật ong trong các gel tạo thành Theo dõi ít nhất 2 tuần trong điều kiện phòng

2.3.2 Xây dựng quy trình bào chế gel mật ong 60%

Bào chế gel chứa mật ong theo quy trình bào chế được trình bày tại hình 2.1

Nước cất Chất bảo quản, điều chỉnh pH

Tá dược tạo gel Hoà tan hoàn toàn

Propylen glycol, Glycerin Đồng nhất

Hình 2.1 Quy trình bào chế gel mật ong 60%

2.3.3 Đánh giá một số đặc tính của sản phẩm bào chế được

Lấy khoảng 50 g mẫu cho vào cốc thuỷ tinh Dùng mắt để quan sát mẫu, tiến hành ở nơi có đủ ánh sáng, tránh ánh sáng trực tiếp, không có màu sắc khác ở gần Quan sát các đặc tính sau:

 Trạng thái: Mô tả trạng thái quan sát được, đặc biệt về tính đồng nhất của sản phẩm

 Màu sắc: Mô tả màu sắc quan sát được

Hoà loãng khoảng 1 g gel trong 25 ml nước cất Hoà tan hoàn toàn rồi

Khuấy trộn, gia nhiệt nếu cần

Khuấy trộn Điều chỉnh thể chất

 Độ nhớt: Đo độ nhớt của gel bằng máy đo độ nhớt MRC VIS-8, sử dụng kim số 4

 Theo dõi độ ổn định của gel:

 Phương pháp: Khảo sát sự thay đổi về cảm quan và độ nhớt của các mẫu theo thời gian

 Nguyên tắc: Sự tương tác và những phản ứng của các chất có trong sản phẩm có khả năng ảnh hưởng đến độ nhớt và trạng thái

 Tiến hành: Gel bào chế theo các công thức lựa chọn được bảo quản trong cốc thuỷ tinh đậy kín ở điều kiện phòng Đánh giá cảm quan và đo độ nhớt của các mẫu tại các thời điểm: Ngay sau khi bào chế,

2.3.4 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel mật ong

 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán

Mẫu thử là các gel (có chứa hoạt chất thử) được thấm 01 lần vào khoanh giấy lọc D = 6,2 - 6,5 mm (đã khử trùng và sấy khô) rồi đem đặt vào giếng thạch (D = 6,5 mm) trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi khuẩn kiểm định theo sơ đồ định sẵn Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

• Các mẫu gel thử được ký hiệu lần lượt là:

Mẫu 1: Mật ong Mẫu 2: Gel mật ong 40% (tá dược carbopol) Mẫu 3: Gel mật ong 60% (tá dược carbopol) Mẫu 4: Gel mật ong 40% (tá dược chitosan) Mẫu 5: Gel mật ong 60% (tá dược chitosan) Mẫu 6: Kháng sinh chứng (KSC)

• Các khoanh giấy lọc vô trùng đã được sấy khô, được tẩm một lần với gel thử, đảm bảo gel bám vào bề mặt khoanh giấy lọc

• Chuẩn bị môi trường và cấy vi sinh vật kiểm định:

Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi ủ cho phát triển trong tủ ấm 36,5 - 37,0 o C trong thời gian 18 - 24 giờ đến nồng độ

10 8 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn) Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118 o C/30 phút) được làm lạnh về 45 – 50 o C và được cấy giống vi khuẩn kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml Lắc tròn để vi sinh vật kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại

• Đặt mẫu thử và chứng:

Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử đã được xử lý như trên được dùng panh kẹp đưa vào giếng thạch trên bề mặt môi trường thạch thường chứa vi sinh vật kiểm định theo sơ đồ định sẵn

• Dung dịch kháng sinh chứng chuẩn được nhỏ 0,05 ml vào giếng thạch trên môi trường kiểm định theo sơ đồ định sẵn

• Ủ các đĩa Petri có mẫu thử và chứng được đặt như trên trong tủ ấm ở t o C = 36,0 - 37,0 o C trong 18 - 24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả Đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có bằng thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm

Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:

(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song (n =3)

2.3.5 Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của gel mật ong

Hợp chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Khả năng chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với chất chứng dương axit ascorbic, khi đo ở bước sóng 517 nm

Tác dụng chống oxy hoá của gel mật ong được đánh giá theo phương pháp của Velazquez (2003) [42] với một số thay đổi như sau:

 Pha dung dịch DPPH 0,02 mg/ml trong methanol (dụng cụ đựng được bọc trong giấy bạc, tránh ánh sáng)

 Pha mẫu thử theo dãy nồng độ 50, 100, 150, 200, 250, 300 mg/ml trong methanol Sau đó lấy 0,75 ml mỗi mẫu thử trộn với 1,5 ml dung dịch DPPH, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm

 Pha dung dịch axit ascorbic với dãy nồng độ 0,5, 1, 2, 4, 8 mg/l

Sau đó lấy 0,75 ml mỗi mẫu dung dịch axit ascorbic trộn với 1,5 ml dung dịch DPPH, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng rồi đo độ hấp thụ ở 517 nm

 Mẫu chứng được pha như sau: 1,5 ml dung dịch DPPH 0,02 mg/ml trong methanol rồi thêm 0,75 ml methanol, đo độ hấp thụ ở bước sóng

517 nm Mẫu trắng là methanol

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kết quả được tính theo công thức:

• AOA: hoạt tính chống oxy hóa (Antioxidative activity)

• Ac : độ hấp thu của mẫu chứng

• At : độ hấp thu của mẫu thử

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính dưới sự trợ giúp của phần mềm Microsoft Excel 2016, Sigma Plot 12

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát khả năng tạo gel của một số polyme với mật ong Để xác định được loại và nồng độ tá dược tạo gel với mật ong có thể chất thích hợp, cần tiến hành bào chế gel chứa mật ong với một số polyme như NaCMC, HEC, Carbopol, Chitosan ở các nồng độ khác nhau Quan sát trạng thái thể chất của các gel tạo thành

Khảo sát NaCMC (2%, 2,4%, 2,8%), HEC (6%, 8%), Carbopol 940 (0,6%, 0,8%, 1%), Chitosan (2,5%, 3%, 3,5%) được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Trạng thái thể chất của gel mật ong bào chế được với một số polyme ở các nồng độ khác nhau

Công thức Polyme Nồng độ

Bảng 3.2 Độ nhớt gel mật ong bào chế được với một số polyme ở các nồng độ khác nhau sau bào chế và sau 2 tuần

Công thức Polyme Nồng độ

(%kl/kl) Độ nhớt (cPs) Sau bào chế Sau 2 tuần

Từ bảng 3.2, sau thời gian theo dõi 2 tuần trong điều kiện phòng, gel mật ong được bào chế từ tá dược tạo gel NaCMC ở cả 3 nồng độ (2%, 2,4%, 2,8%) có độ nhớt loãng dần theo thời gian, các công thức khác giữ nguyên trạng thái thể chất

Từ các kết quả thu được, trong các polyme khảo sát, các công thức phù hợp để bào chế gel mật ong là CT7 và CT10

3.2 Xây dựng quy trình bào chế gel mật ong 60%

Công thức và quy trình bào chế 100 g gel mật ong 60% được trình bày trong bảng 3.3 và 3.4, hình 3.1 và 3.2

Bảng 3.3 Công thức bào chế 100 g gel mật ong 60% (kl/kl) (tá dược carbopol 940)

STT Thành phần Tỷ lệ Khối lượng (g)

7 Nước cất Vừa đủ 100% Vửa đủ 100 g

Carbopol 940 Hoà tan hoàn toàn

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình bào chế gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940)

Phân tán đều, ngâm trương nở

Khuấy trộn, phân tán đều Điều chỉnh thể chất bằng TEA

Bảng 3.4 Công thức bào chế 100 g gel mật ong 60% (kl/kl) (tá dược chitosan)

STT Thành phần Tỷ lệ Khối lượng (g)

7 Nước cất Vừa đủ 100% Vừa đủ 100 g

Chitosan Hoà tan hoàn toàn

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ quy trình bào chế gel mật ong 60% (tá dược chitosan)

Phân tán đều, ngâm trương nở

Khuấy trộn, phân tán đều

3.3 Đánh giá một số đặc tính của gel mật ong 60%

Bào chế gel mật ong theo công thức được mô tả ở mục 3.2 Xác định một số đặc tính của gel như cảm quan, pH, độ nhớt, độ ổn định

 Gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940)

• Trạng thái: Đặc sánh, đồng nhất, không tách lớp, không phân tầng và không kết tủa

• Màu sắc: Gel bào chế được có màu vàng nâu

Tiến hành đo pH của mẫu gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940) theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3 Kết quả pH thu được là 6,2

 Độ nhớt, độ ổn định: Đánh giá độ ổn định của gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940) theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3 Kết quả về độ nhớt theo thời gian của sản phẩm được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Bảng thay đổi độ nhớt gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940)

Thời gian Nhiệt độ ( o C) Độ nhớt (cPs)

Từ bảng 3.5, có thể thấy gel mật ong 60% (tá dược carbopol) sau khi bào chế có độ nhớt khoảng 23000 cPs Gel bào chế được có độ ổn định cao, độ nhớt của gel ít thay đổi sau 2 tháng (khoảng 22750 cPs)

 Gel mật ong 60% (tá dược chitosan)

• Trạng thái: Đặc sánh, đồng nhất, không tách lớp, phân tầng và không kết tủa

• Màu sắc: Gel bào chế được có màu vàng nâu

Tiến hành đo pH của mẫu gel mật ong 60% (tá dược chitosan) theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3 Kết quả pH thu được là 4,3

 Độ nhớt, độ ổn định: Đánh giá độ ổn định của gel mật ong 60% (tá dược chitosan) theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3 Kết quả độ nhớt theo thời gian của sản phẩm được trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Bảng thay đổi độ nhớt gel mật ong 60% (tá dược chitosan) Thời gian Nhiệt độ ( o C) Độ nhớt (cPs)

Từ bảng 3.6, có thể thấy gel mật ong 60% (tá dược chitosan) sau khi bào chế có độ nhớt khoảng 14200 cPs Gel bào chế được có độ ổn định cao, độ nhớt của gel ít thay đổi sau 2 tháng (khoảng 13600 cPs)

Hình 3.3 (A) Gel mật ong 60% carbopol 940, (B) Gel mật ong 60% chitosan 3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của gel mật ong 60%

Các kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.2

Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Bắt màu Vi khuẩn Kết quả Mẫu

( (mm): đường kính trung bình vòng vô khuẩn, s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh), Mẫu 1: Mật ong, Mẫu 2: Gel mật ong 40% (tá dược carbopol), Mẫu 3: Gel mật ong 60% (tá dược carbopol), Mẫu 4: Gel mật ong 40% (tá dược chitosan), Mẫu 5: Gel mật ong 60% (tá dược chitosan), Mẫu 6: Kháng sinh chứng

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của gel mật ong so với kháng sinh chứng và mật ong trên 1 số vi khuẩn Gram âm: (A) E coli, (B) P mirabilis, (C) S flexneri và một số vi khuẩn Gram dương: (D) B subtilis, (E) S lutea,

Từ bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy:

 Nhìn chung các mẫu thử có hoạt tính kháng khuẩn tương đối yếu đối với các vi khuẩn thử Tuy nhiên khả năng ức chế vi khuẩn của tất cả các mẫu thử tương đối lớn

 Đối với 3 vi khuẩn Gram âm (E coli, P mirabilis, S flexneri) 4/5 mẫu thử có tác dụng, nhưng khả năng tác dụng khác nhau

 Trong số các vi khuẩn Gram dương thì đối với B subtilis, S aureus thì có 3 và 4 mẫu thử có tác dụng, còn đối với S lutea tất cả các mẫu thử đều có tác dụng.

3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hoá của gel mật ong 60%

Hợp chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một chất có khả năng tạo gốc tự do bền vững, tạo dung dịch màu tím (hấp thụ ở bước sóng

517 nm) Khi các gốc tự do bị quét bởi các chất có khả năng chống oxy hóa, DPPH sẽ tạo ra dung dịch màu vàng Chúng tôi sử dụng phương pháp thử nghiệm này để đánh giá khả năng quét các gốc tự do của mẫu gel mật ong 60% được bào chế theo công thức mô tả ở mục 3.2 theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.5

Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hoá của gel mật ong 60 %

Nồng độ % chống oxy hoá

(%) Độ hấp thụ trung bình IC 50

Gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940) (mg/ml)

Gel mật ong 60% (tá dược chitosan) (mg/ml)

(IC50: nồng độ mẫu có khả năng quét 50% gốc tự do do DPPH tạo ra)

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hoá của gel mật ong 60%

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hoá của gel mật ong 60%

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hoá của axit ascorbic

Từ các kết quả thu được, có thể thấy tác dụng chống oxy hóa của cả 2 mẫu thử tương đối thấp Gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940) có khả năng chống oxy hóa cao hơn gel mật ong 60% (tá dược chitosan) So với tác dụng chống oxy hoá của axit ascorbic (IC50 là 2,565 mg/l), hàm lượng axit ascorbic có khả năng chống oxy hoá tương đương với 100 g mẫu gel mật ong 60% (tá dược carbopol 940) là 1,277 mg So với tác dụng chống oxy hoá của axit ascorbic (IC50 là 2,565 mg/l), hàm lượng axit ascorbic có khả năng chống oxy hoá tương đương với 100 g mẫu gel mật ong 60% (tá dược chitosan) là 0,866 mg

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ nghiên cứu, ảnh hưởng của một số tá dược tạo gel như NaCMC, HEC,

Carbopol 940, Chitosan đến thể chất và độ nhớt của gel mật ong đã được đánh giá, từ đó lựa chọn được tá dược tạo gel để xây dựng công thức và quy trình bào chế phù hợp Gel mật ong 60% với tá dược tạo gel carbopol và chitosan có độ ổn định cao sau 2 tháng kể từ khi bào chế Với tá dược tạo gel carbopol, pH có giá trị là 6,2, độ nhớt khoảng 23000 cPs Với tá dược tạo gel chitosan, pH có giá trị là 4,3, độ nhớt khoảng 13600 cPs

Sản phẩm bào chế được có tính kháng khuẩn tương đối yếu đối với các vi khuẩn thử, tuy nhiên khả năng ức chế vi khuẩn tương đối lớn Gel mật ong có tác dụng chống oxy hóa thấp, hàm lượng axit ascorbic có khả năng chống oxy tương đương với 100 g mẫu xấp xỉ khoảng 0,886 - 1,277 mg

Tiêu đề	Bào chế và đánh giá một số tác dụng của gel mật ong trong hỗ trợ chăm sóc vết thương
Tác giả	Nguyễn Bá Lực
Người hướng dẫn	ThS. Trịnh Ngọc Dương, PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,83 MB