NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 52, 2009 NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CHẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO Trần Quốc Dung Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế TÓM TẮT Cá chạch lồi cá nước Khơng lồi cá khác, chúng đẻ trứng suốt từ mùa xuân mùa thu Vì vậy, cá chạch sử dụng làm đối tượng nghiên cứu chuyển gen phịng thí nghiệm Để làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá phát triển thụ tinh nhân tạo bước bắt buộc kỹ thuật vi tiêm Cá chạch đực phân biệt cách dựa vào khác biệt hình thái vây ngực Sau gây kích thích hormone qua đêm, trứng thành thục tinh dịch thu nhận từ cá bố mẹ Thụ tinh nhân tạo tiến hành đĩa Petri với tỉ lệ 100 l tinh dịch/100 trứng Kết nghiên cứu cho thấy kích thích sinh sản nhân tạo cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần vào xoang thân thụ tinh nhân tạo phương pháp thứ ba (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu tốt Từ khoá: Misgurnus anguillicaudatus, não thùy thể cá chép, thụ tinh nhân tạo, vi tiêm I Mở đầu Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) thuộc lớp Cá chạch, cá nước Ở nước ta, cá chạch loài cá thường gặp ao, hồ, kênh mương, đồng ruộng Khác với loài cá khác, cá chạch đẻ trứng suốt từ mùa xuân đến mùa thu Do vậy, chúng sử dụng phịng thí nghiệm để nghiên cứu chuyển gen [7, 9] Với mục đích làm chủ thời gian chuyển gen vào phơi cá phát triển thụ tinh nhân tạo bước bắt buộc kỹ thuật vi tiêm [10] Để góp phần vào việc hồn thiện phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào cá tiến hành nghiên cứu thu nhận giao tử phôi tế bào chuNn bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá chạch II Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) (Hình 1) sử dụng thí nghiệm nghiên cứu thu thập Nghĩa Ðô, Cầu Giấy, Hà Nội - Não thùy thể cá chép Công ty Dịch vụ Nuôi trồng thuỷ sản trung ương (Ngọc Khánh, Ba Đình, Hà Nội) cung cấp - Phương pháp thu nhận giao tử thụ tinh nhân tạo tiến hành theo Chung Lân cs (1969): 29 + Phân biệt đực, cái: Dựa vào vây ngực (Hình 2) + Chọn cá bố mẹ: chọn cá khỏe mạnh độ tuổi thành thục sinh dục + Liều lượng tuyến yên cá chép dùng để tiêm cho cá chạch 0,5 cho cái, lượng tiêm cho cá đực nửa cá + Phương pháp tiêm: tiêm vào xoang thân tiêm bắp thịt + Số lần tiêm: tiêm lần tiêm hai lần Với cách tiêm hai lần lần đầu tiêm vào buổi trưa, lần thứ hai vào hai sáng để điều khiển cá đẻ lúc rạng đơng Hình 1: Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) + Thụ tinh nhân tạo: thụ tinh khô với phương pháp khác Phương pháp 1: sau lấy trứng, cho tinh dịch lấy sẵn vào cốc nhỏ có nước muối sinh lý (lượng nước muối sinh lý gấp 10 lần tinh dịch) lắc đều, tưới lên trứng Phương pháp 2: đổ tinh dịch hòa với nước muối sinh lý vào khay thụ tinh sau cho trứng vào, lắc nhẹ khay thụ tinh làm cho trứng tinh trùng sớm tiếp xúc với Phương pháp 3: vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch Trong lấy trứng đồng thời có số người khác lấy tinh dịch tưới nhanh vào trứng Phương pháp 4: lấy trứng trước, lấy tinh dịch sau Sau lấy trứng, trực tiếp vuốt tinh dịch cá đực vào trứng Bất kỳ áp dụng phương pháp nào, sau trộn lẫn tinh dịch với trứng cần dùng lông gà khuấy nhẹ để thúc đNy trình thụ tinh Vây ngực cá đực Vây ngực cá Hình 2: Vây ngực cá chạch đực cá chạch 30 III Kết thảo luận 3.1 Số lần tiêm não thùy thể cá chép Ðể chủ động thu nhận trứng, tinh dịch thụ tinh nhân tạo, cá chạch kích thích sinh sản cách tiêm não thùy thể cá chép (bảo quản dịch thể) Hiện nay, phương pháp kích thích sinh sản cá ni người ta tiêm lần hai lần Chúng tơi tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu kích thích sinh sản cách tiêm lần tiêm hai lần để chọn phương pháp cho kết tốt, phù hợp với điều kiện nghiên cứu phịng thí nghiệm Bảng 1: Hiệu kích thích sinh sản cá chạch số lần tiêm não thùy thể cá chép Tiêm lần Tiêm lần Số cá cho trứng (con) Tỉ lệ cá cho trứng (%) Tỉ lệ trứng nở (%) Số cá kích thích (con) 38,46 67,00 13 53,84 69,00 62,50 65,00 75,00 72,00 66,66 68,00 9 100,00 78,00 16 10 62,50 72,00 16 14 87,50 85,00 14 50,00 76,00 14 10 71,42 89,00 12 50,00 80,00 12 10 83,33 91,00 Trung bình 72 39 55,02 71,33 72 56 78,52 80,67 Số cá kích thích (con) Số cá cho trứng (con) Tỉ lệ cá cho trứng (%) Tỉ lệ trứng nở 13 Đợt thí nghiệm (%) Kết bảng cho thấy, tỉ lệ đẻ trứng tỉ lệ nở cá chạch tiêm lần trung bình đạt 55,02% (từ 38,46 - 66,66%) 71,33% (từ 65,00 - 80,00%); tiêm hai lần 78,52% (từ 53,84 - 100%) 80,67% (từ 69,00 - 91,00%) Như vậy, tỉ lệ cho trứng tỉ lệ nở cá chạch tiêm hai lần đạt 142,71% 113,09% so với tỉ lệ cho trứng tỉ lệ nở cá chạch tiêm lần Kết cho thấy hiệu kích thích sinh sản cá chạch cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần cao cách tiêm lần Như biết, trình thành thục trứng từ cuối giai đoạn IV chuyển sang giai đoạn V cần có thời kỳ độ Do đó, trường hợp sử dụng cách tiêm lần toàn lượng thuốc, nhìn chung, định có ảnh hưởng khơng tốt, tạo nên phản ứng sinh lý vội gấp, sinh dục khơng điều hịa, có tượng bụng cá phình lên nhanh, to làm giảm tỉ lệ cho trứng tỉ lệ nở Hơn nữa, dùng cách tiêm hai lần cịn coi lần tiêm thứ lần sát hạch cuối để lựa chọn cá bố mẹ thành thục 31 3.2 Vị trí tiêm não thùy thể cá chép Về phương pháp tiêm cá có hai cách tiêm: tiêm vào xoang thân tiêm vào bắp thịt Kết kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch hai phương pháp tiêm khác trình bày bảng Bảng 2: Hiệu kích thích sinh sản cá chạch phương pháp tiêm khác Đợt thí nghiệm Trung bình Tiêm vào xoang thân Số cá Số cá Tỉ lệ Tỉ lệ cho cá cho trứng tiêm trứng trứng nở (con) (con) (%) (%) 10 70,00 79,00 66,66 85,00 12 66,66 72,00 87,50 70,00 10 80,00 89.00 75,00 84,00 54 40 74,30 79,83 Số cá tiêm (con) 10 12 10 54 Tiêm vào bắp thịt Số cá Tỉ lệ cho cá cho trứng trứng (con) (%) 60,00 66,66 41,66 87,50 70,00 62,50 34 64,72 Tỉ lệ trứng nở (%) 80,00 82,00 68,00 65,00 85,00 80,00 76,67 Bảng cho thấy tỉ lệ cá cho trứng tỉ lệ nở cá chạch tiêm não thùy thể cá chép phương pháp tiêm vào xoang thân 74,30% (từ 66,66 - 87,50%) 79,83% (từ 70,00 - 89,00%); cá chạch tiêm não thùy thể cá chép phương pháp tiêm bắp thịt tương ứng 64,72% (từ 41,66 - 87,50%) 76,67% (từ 65,00 85,00%) Như vậy, tỉ lệ cá cho trứng tỉ lệ nở cá chạch tiêm não thủy thể cá chép vào xoang thân đạt 117,64% 104,13% so với cá chạch tiêm não thùy thể cá chép vào bắp thịt Kết cho thấy kích thích sinh sản cá chạch phương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu tương đối chắn phương pháp tiêm vào bắp thịt 3.3 Phương pháp thụ tinh nhân tạo Bảng 3: Kết thụ tinh nhân tạo cá chạch theo phương pháp thụ tinh khác Phương pháp thụ tinh Phương pháp Đợt thí nghiệm Số trứng thụ tinh (cái) 100 100 100 100 100 ∑ = 500 32 Số trứng nở (cái) 76 68 71 65 82 ∑ = 362 Tỉ lệ nở (%) 76,00 68,00 71,00 65,00 82,00 x = 72,40 Phương pháp 2 100 100 100 100 100 ∑ = 500 69 72 78 64 75 ∑ = 358 69,00 72,00 78,00 64,00 75,00 x = 71,60 Phương pháp 3 100 100 100 100 100 ∑ = 500 86 92 72 80 78 ∑ = 408 86,00 92,00 72,00 80,00 78,00 x = 81,60 Phương pháp 4 100 100 100 100 100 ∑ = 500 83 69 74 78 75 ∑ = 379 83,00 69,00 74,00 78,00 75,00 x = 75,80 Trứng tinh dịch thu nhận vào đầu chu kỳ sáng để tiến hành thụ tinh nhân tạo với tỉ lệ 100 2l tinh dịch/100 trứng Kết thụ tinh nhân tạo cá chạch theo phương pháp khác trình bày bảng Nhìn vào bảng ta thấy phương pháp thụ tinh nhân tạo 1, 2, cho tỉ lệ nở 72,40%; 71,60%; 81,60% 75,80% Như vậy, phương pháp thụ tinh thứ cho tỉ lệ nở cao Trong hai phương pháp thụ tinh lấy tinh trùng trước, thời gian tiến hành thụ tinh dài Ở phương pháp thụ tinh lấy trứng trước vuốt tinh dịch cá đực vào trứng nên giảm bớt thời gian lấy tinh dịch Trong đó, phương pháp thụ tinh 3, vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch, đó, thời gian thụ tinh ngắn Mặt khác, thí nghiệm tiến hành vào mùa nóng (tháng 5, 6, 7) nên trứng sau khỏi thể mẹ khả thụ tinh nhanh Thời gian thụ tinh dài tỉ lệ trứng khả thụ tinh lớn tỉ lệ nở giảm Tóm lại, phương pháp thụ tinh nhân tạo nói trên, phương pháp thứ cho hiệu suất cao IV Kết kuận - Kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) phương pháp tiêm não thùy thể cá chép hai lần cho hiệu cao tiêm lần phương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu cao tiêm vào bắp thịt - Trong phương pháp thụ tinh nhân tạo, phương pháp (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu thu nhận phôi cá chạch tế bào cao 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Cường, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Quyền Đình Thi, Trần Quốc Dung, Tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 9-10/12/1999 NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, (1999), 1429-1437 Trần Quốc Dung, Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) vi tiêm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 2001 Trần Quốc Dung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tinh đánh giá sơ gen hormone sinh trưởng người để chuyển vào cá vàng cá chạch, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, Số 2, (1999), 39-44 Trần Quốc Dung, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tạo cá chạch mang gen hormone sinh trưởng người, Tạp chí Sinh học, 21(3) (1999), 24-28 Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trần Quốc Dung, Kết nghiên cứu khử màng chorion phôi giai đoạn tế bào chu#n bị cho kỹ thuật vi tiêm vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm KHTN CNQG, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, (1997), 267-272 Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth hormone (MThGH) gene microinjection, Proceedings, third Asian Symposium of Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12/1997, (1997), 108-114 Chung Lân, Lý Hữu Quảng, Trương Tùng Đào, Lưu Gia Chiếu, Trần Phấn Xương (Người dịch: Dương Tuấn, Nguyễn Kim Độ, Trần Nguyệt Thu, Trần Nhất Anh), Sinh vật học sinh sản nhân tạo loài cá nuôi, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1969 Patrick J Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to Biotechnological Applications, Published by Singer, The Netherlandsm, 2007 Nguyễn Khoa Diệu Thu, Văn Thị Hạnh, Nguyễn Hằng, Xây dựng phương pháp thu nhận giao tử phôi tế bào chu#n bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá vàng Carassius auratus, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ XXXII, (1994), 6-11 10 Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: Method and mechanism, Transgenic fish, World Scientific, (1993), 93-119 34 THE COLLETION OF GAMETES AND MONOCELLULAR EMBRYOS OF LOACH (Misgurnus anguillicaudatus) Tran Quoc Dung College of Pedagogy, Hue University SUMMARY Loach is a fresh water fish species Unlike other fish species, loach spawns from spring to fall It has been used in the laboratory for the study of transgenesis In order to control the time course of gene introduction into developing fish embryo, artificial fertilzation is required Females and males are identified by the morphology of the pectoral fin After an overnight hormonal induction, the mature eggs and milt were striped from parent fish About one hundred eggs were collected in Pestri dish and mixed with 100 l milt The outcomes show that fish injected intraperitoneally two times by carp pituitary with the third artificial fertilization way (collect eggs and milt at the same time) are better Keywords: Misgurnus anguillicaudatus, carp pituitary, artificial fertilization, microinjection 35