NGHIÊN cứu QUÁ TRÌNH tự PHÂN bã nấm MEN BIA để THU NHẬN CHẾ PHẨM INVERTASE

T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 9, S 12 -2006 NGHIÊN C U QUÁ TRÌNH T PHÂN BÃ N M MEN BIA Đ THU NH N CH PH M INVERTASE Lê Văn Vi t M n, Tr n Th m Minh Hoàng, Nguy n Ng c Tuy t S ng Tr ng Đ i Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 03 tháng 08 năm 2005, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 13 tháng 11 năm 2006) TÓM T T: Nghiên cứu khảo sát trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase Đầu tiên, sử dụng phương pháp thực nghiệm thay đổi giá trị yếu tố cố định giá trị yếu tố lại để xác định điều kiện thích hợp cho trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase Kết thu sau: tỉ lệ khối lượng nấm men/dung môi (dung dịch đệm acetate): 1/6, nhiệt độ tự phân: 50oC, pH ban đầu: 5,5 thời gian tự phân: 50 Khi hoạt tính invertase thu 94,7 đơn vị hoạt tính/g chất khơ nấm men Tiếp theo, chúng tơi tối ưu hóa hai yếu tố nhiệt độ pH ban đầu trình tự phân bã nấm men bia phương pháp trực giao bậc hai cấu trúc có tâm Kết cho thấy giá trị nhiệt độ pH tối ưu trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase 45oC 5,5 Khi đó, tổng hoạt tính hoạt tính riêng enzyme invertase thu dịch tự phân 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khơ nấm men 0,7 đơn vị hoạt tính/mg protein GI I THI U Nấm men bia thuộc lồi Saccharomyces cerevisiae, có ho t tính enzyme invertase (EC 3.2.1.26) Enzyme th ng tập trung ch yếu lớp không gian chu chất c a tế bào nấm men [3,4] Ngành công nghi p s n xuất bia hàng năm th i l ợng lớn bã nấm men bia Trung bình s n xuất 100 lít bia thu đ ợc lít bã nấm men với độ ẩm 88% Hi n nay, bã nấm men bia đ ợc sử dụng để s n xuất bột chiết nấm men (yeast extract) làm th c ăn gia súc [5] S n xuất chế phẩm invertase từ bã nấm men bia h ớng nghiên c u t i Vi t Nam Trong công nghi p thực phẩm nh s n xuất n ớc gi i khát, kẹo… chế phẩm invertase th ng đ ợc sử dụng để th y phân đ ng sucrose t o s n phẩm đ ng nghịch đ o [3] Dung dịch đ ng nghịch đ o có độ cao h n bị hi n t ợng tái kết tinh đ ng h n so với dịch đ ng sucrose [3] Trong nghiên c u này, kh o sát trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase thô Chúng sử dụng ph ng pháp qui ho ch thực nghi m trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để xác định điều ki n tối u c a trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase [2] NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1.Nguyên li u Bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiae đ ợc sử dụng nghiên c u nhà máy bia Hịa Bình (402 – 404 Tùng Thi n V ng, quận 8, Thành phố Hồ Chí Minh) cung cấp 2.2.Ph ng pháp nghiên c u Qui trình cơng nghệ: Bã nấm men bia → Rửa với n ớc vô khuẩn n ớc muối → Tách cặn → Tự phân → Ly tâm tách cặn không tan → Chế phẩm invertase thơ Trong q trình tự phân nấm men, h enzyme tự phân có sẵn tế bào nấm men đ ợc ho t hóa Chúng xúc tác ph n ng phân gi i chất có thành tế bào nấm men gi i phóng enzyme invertase tế bào Mục tiêu c a nghiên c u xác định thông số Trang 49 Science & Technology Development, Vol 9, No.12 - 2006 kỹ thuật tối u c a trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase có ho t tính cao Tr ớc thực hi n trình tự phân, bã nấm men bia d ng s t thu đ ợc từ nhà máy bia đ ợc đem phối trộn với n ớc vô khuẩn theo tỉ l nấm men/n ớc 1/3 (w/w), để lắng gi g n bỏ phần n ớc bên Tiếp tục phối trộn sinh khối nấm men với dung dịch n ớc muối NaCl (0,5%) theo tỉ l 1/3 (w/w) Sau gi , g n n ớc tiến hành ly tâm (3000 vòng/phút) để thu nhận sinh khối nấm men Tiếp theo, sinh khối nấm men đ ợc phối trộn với dung dịch đ m để thực hi n trình tự phân Sau trình tự phân, mẫu đ ợc ly tâm (7000 vịng/phút) để tách bỏ phần khơng tan, phần dịch lỏng thu đ ợc chế phẩm invertase thô Ph ng pháp qui ho ch thực nghi m: sử dụng ph ng pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để xác định thơng số kỹ thuật tối u c a trình tự phân Các h số hồi qui đ ợc kiểm tra tiêu chuẩn Student, t ng thích c a ph ng trình hồi qui với thực nghi m đ ợc kiểm tra tiêu chuẩn Fisher [2] 2.3 Các ph ng pháp phân tích [1] L ợng sinh khối nấm men đ ợc xác định ph ng pháp sấy khô đến khối l ợng không đổi đ ợc biểu di n số g chất khô nấm men Hàm l ợng đ ng khử đ ợc xác định ph ng pháp so màu quang phổ, sử dụng thuốc thử 3, DiNitroSalycylic acid (DNS) L ợng protein hòa tan đ ợc xác định ph ng pháp Lowry Ph ng pháp xác định ho t tính invertase: cho vào erlen 4ml dung dịch đ m acetate pH 4,5; 4,6 ml n ớc cất 0,4ml dịch ch a enzyme Thêm vào 1ml dung dịch đ ng sucrose nồng độ 20g/l Cho ph n ng enzyme x y xác 15 phút Sau xác định l ợng l ợng đ ng khử t o thành ph ng pháp DNS, từ suy số mol sucrose bị th y phân Một đ n vị ho t tính invertase l ợng enzyme cần thiết để th y phân micromol đ ng sucrose phút điều ki n pH 4,5 nhi t độ 30oC K T QU TH C NGHI M 3.1.Kh o sát y u t nh h ng đ n trình t phân bã n m men bia 3.1.1.Tỉ lệ nấm men dung môi (w/w) Thực hi n trình tự phân với tỉ l nấm men/dung môi (w/w) thay đổi từ 1/1 đến 1/7 Để ổn định giá trị pH trình tự phân, dung môi đ ợc chọn dung dịch đ m acetate Trong mẫu thí nghi m này, nhi t độ, pH ban đầu th i gian tự phân lần l ợt 50oC, 4,5 50 gi Kết qu đ ợc trình bày hình Theo hình 1, ta tăng tỉ l dung môi sử dụng trình tự phân bã nấm men bia ho t tính invertase thu đ ợc dịch tự phân tăng theo Có lẽ tăng l ợng dung môi sử dụng nên kh khuếch tán c a enzyme invertase từ lớp không gian chu chất bên màng tế bào d dàng h n Tuy nhiên, tỉ l dung môi sử dụng q trình tự phân q cao pha lỗng nồng độ enzyme invertase dịch tự phân thu đ ợc Khi q trình tách n ớc tinh s ch chế phẩm enzyme khó khăn h n tốn nhiều chi phí So với tỉ l nấm men/dung mơi 1/6 (w/w) ho t tính invertase thu đ ợc tỉ l 1/7 (w/w) tăng thêm 3% Còn so sánh với tỉ l 1/5 (w/w), ho t tính invertase thu đ ợc tỉ l sinh khối nấm men/dung mơi 1/6 (w/w) tăng 5% Vì vậy, để thuận lợi cho b ớc tinh s ch enzyme, chọn tỉ l nấm men/dung môi 1/6 (w/w) Khi đó, ho t tính invertase thu đ ợc dịch tự phân 91.0 đ n vị ho t tính/g chất khơ nấm men Trang 50 Hình nh h 100 (ĐVHT/g chất khô nấm men) Họat tính invertase T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 9, S 12 -2006 80 60 40 20 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 Tỉ lệ nấm men/dung môi (w/w) ng c a tỉ l nấm men/dung mơi (w/w) đến ho t tính invertase thu nhận từ bã nấm men bia 3.1.2.Nhiệt độ tự phân (ĐVHT/g chất khô nấm men) Hoạt tính invertase Tiếp theo, chúng tơi kh o sát nh h ng c a nhi t độ tự phân đến ho t tính chế phẩm invertase thu đ ợc Bốn giá trị nhi t độ đ ợc kh o sát 30, 40, 50 60oC Sinh khối nấm men đ ợc phối trộn với dung dịch đ m acetate pH 4,5 theo tỉ l 1/6 (w/w), th i gian tự phân đ ợc chọn 50 gi 100 80 60 40 20 30 40 50 60 Nhiệt độ (o C) Hình nh h ng c a nhi t độ tự phân đến ho t tính invertase thu đ ợc từ bã nấm men bia Kết qu thực nghi m hình cho thấy ta tăng nhi t độ tự phân từ 30 đến 50oC, ho t tính invertase thu đ ợc dịch tự phân tăng dần đ t giá trị cực đ i 92.0 đ n vị ho t tính/g chất khơ nấm men 50oC Khi nhi t độ tự phân nấm men tăng đến 60oC, ho t tính invertase thu đ ợc gi m m nh 8,5% so với giá trị cực đ i Có lẽ nhi t độ q trình tự phân cao làm vô ho t enzyme tự phân enzyme invertase nấm men Nh vậy, nhi t độ thích hợp để tự phân bã nấm men bia thu nhận invertase 50oC 3.1.3 pH ban đ u c a m u n m men t phân T ng tự nh nhi t độ, pH yếu tố nh h ng lớn đến ho t tính c a enzyme tự phân, nh h ng đến m c độ phá vỡ màng tế bào nấm men kh gi i phóng invertase từ lớp khơng gian chu chất bên ngồi tế bào Chúng tơi thay đổi giá trị pH ban đầu c a mẫu nấm men tự phân từ 2,0 đến 6,5 cách sử dụng dung dịch đ m acetate Mẫu đối ch ng sử dụng n ớc cất dung môi (Sau phối trộn sinh khối nấm men với n ớc cất theo tỉ l qui định, pH ban đầu c a mẫu đối ch ng 6,23) Các thơng số khác c a q trình tự phân đ ợc giữ cố định: tỉ l nấm men/dung môi: 1/6 w/w, nhi t độ tự phân: 50oC, th i gian tự phân: 50 gi Trang 51 Hoạt tính invertase (ĐVHT/g chất khô nấm men) Science & Technology Development, Vol 9, No.12 - 2006 Hình nh h 100 80 60 40 20 2.0 2.5 3.0 3.5 4.5 5.5 6.0 6.5 6.23 pH (Đối chứn g) ng giá trị pH ban đầu c a mẫu bã nấm men bia tự phân đến ho t độ chế phẩm invertase thu đ ợc Theo kết qu hình 3, pH 2,0 2,5 chúng tơi khơng tìm thấy ho t tính invertase dịch tự phân Có lẽ, giá trị pH thấp c chế ho t tính enzyme tự phân invertase c a nấm men bia Trong kho ng pH tự phân từ 3,0 đến 5,5, ho t tính invertase tăng dần đ t giá trị cực đ i 94,7 đ n vị ho t tính/g chất khơ pH tự phân 5,5 kho ng pH tự phân – 6,5, ho t tính invertase gi m xuống cách rõ r t Có lẽ giá trị 5,5 pH tối thích cho xúc tác c a enzyme tự phân c a nấm men để gi i phóng invertase bên tế bào 3.1.4.Th i gian t phân Trong thực tế s n xuất, th i gian tự phân yếu tố quan trọng nh h l ợng c a trình suất ho t động c a thiết bị tự phân ng đến chi phí (ĐVHT/g chất khô nấm men) Hoạt tính invertase Chúng tiến hành tự phân nấm men với th i gian tự phân thay đổi từ 24 đến 144 gi Các thông số kỹ thuật khác đ ợc chọn từ kết qu trên: tỉ l nấm men/dung môi 1/6 (w/w), nhi t độ pH tự phân lần l ợt 50oC 5,5 100 80 60 40 20 0 50 100 150 Thời gian (giờ) Hình nh h ng c a th i gian tự phân đến ho t tính chế phẩm invertase thu nhận từ bã nấm men bia Từ kết qu hình 4, ta nhận thấy kho ng th i gian đầu c a trình tự phân, ho t tính invertase thu đ ợc tăng nhanh đ t giá trị cực đ i 94,7 đ n vị ho t tính/g chất khơ nấm men sau 50 gi tự phân Nếu ta kéo dài thêm th i gian tự phân, ho t tính c a chế phẩm invertase không tăng thêm nữa, ng ợc l i bị gi m nhẹ Có lẽ th i gian tự phân dài Trang 52 T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 9, S 12 -2006 t o điều ki n cho enzyme protease có sẵn tế bào nấm men đ ợc gi i phóng nhiều h n th y phân số phân tử invertase có dịch tự phân 3.2.T i u hố u ki n t phân bã n m men bia đ thu nh n ch ph m invertase b ng ph ng pháp tr c giao b c hai c u trúc có tâm (2 y u t ) Trong thực tế, ho t tính chế phẩm invertase thu đ ợc không bị nh h ng b i yếu tố riêng lẻ mà bị nh h ng b i t ng tác yếu tố với Vì dựa nghiên c u r i r c để đ a giá trị tối u cho thông số kỹ thuật c a trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase kết qu khơng đ t độ xác cao Chúng tơi tiến hành qui ho ch thực nghi m, chọn yếu tố có nh h ng nhiều đến ho t tính invertase nhi t độ pH ban đầu c a mẫu nấm men tự phân Chúng sử dụng ph ng pháp trực giao bậc 2, cấu trúc có tâm để đ a ph ng trình hồi qui biểu di n mối quan h định l ợng ho t tính invertase với yếu tố kh o sát Các thí nghi m đ ợc tiến hành nh b ng 1, đó: - X1 nhi t độ tự phân (kho ng kh o sát: 45 – 55oC, m c tâm: 50oC, b ớc nh y: 5oC) - X2 pH ban đầu c a mẫu nấm men tự phân (kho ng kh o sát: 5,0 – 6,0, m c tâm 5,5, b ớc nh y 0,5) - Y ho t tính invertase (đ n vị ho t tính/g chất khơ nấm men) Số thí nghi m phần tối u hóa 9, có thí nghi m tâm ph ng án (thí nghi m số 9) Chúng tơi thực hi n thêm thí nghi m khác tâm để kiểm tra ý nghĩa h số c a ph ng trình hồi qui B ng Ma trận qui họach thực nghi m theo ph ng pháp qui ho ch trực giao bậc 2, hai yếu tố (ph ng án cấu trúc có tâm) kết qu Thí nghi m số X1 (Nhi t độ, oC) X2 (pH) Ho t tính invertase (đ n vị ho t tính/g chất khô nấm khô) 45 5,0 105,1 45 6,0 109,8 45 5,5 119,7 55 5,0 68,1 55 6,0 29,2 55 5,5 65,1 50 5,0 96,3 50 6,0 86,0 50 5,5 100,0 Ba thí nghi m t tâm 10 50 5,5 109,1 11 50 5,5 109,1 12 50 5,5 102,3 Sau tính toán kiểm tra ý nghĩa c a h số ph ng trình hồi qui kiểm tra ng thích c a ph ng trình hồi qui với thực nghi m, thu đ ợc ph ng trình sau: Y = 94.9856–28.7155X1 – 7.427X2 –10.9352X1X2 – 12.4925X22 Trang 53 Science & Technology Development, Vol 9, No.12 - 2006 150 100 50 X2 0 -1 -0.5 0.5 1 0.5 X1 -0.5 -1 (ĐVHT/g chất khô nấmmen) Hoạt tính invertase Dựa vào mặt phẳng hình 5, nhận thấy X1 gi m ho t tính invertase thu đ ợc dịch tự phân tăng ng với giá trị nhỏ c a X1 vùng kh o sát (X1 = -1), mối quan h Y X2 đ ng cong có điểm cực đ i Từ hình vẽ, chúng tơi nhận thấy giá trị Y đ t cực đ i X2 nằm kho ng từ -0,25 đến 0,25 Trong kho ng này, thay đổi giá trị X2 không làm thay đổi đáng kể giá trị Y Trên c s đó, chúng tơi chọn giá trị X1 X2 tối u lần l ợt -1 Các giá trị t ng ng với nhi t độ pH ban đầu c a mẫu tự phân lần l ợt 45oC 5,5 Trong điều ki n này, thực hi n thí nghi m với quy mơ 5kg bã nấm men bia Kết qu cho thấy ho t tính tổng c a enzyme invertase thu đ ợc 120,9 đ n vị ho t tính/g chất khơ nấm men Giá trị tăng 27,7% so với kết qu thu đ ợc phần 3.1 không sử dụng ph ng pháp qui ho ch thực nghi m trực giao bậc Ho t tính riêng c a enzyme invertase dịch tự phân thu đ ợc 0,7 đ n vị ho t tính/mg protein Hình Đồ thị biểu di n mối quan h c a X1 (nhi t độ tự phân, oC), X2 (pH ban đầu c a mẫu tự phân) Y (ho t tính invertase, ĐVHT/g chất khơ nấm men) K T LU N Q trình tự phân bã nấm men bia giai đọan quan trọng qui trình cơng ngh thu nhận chế phẩm invertase Nó định đến giá trị hi u suất thu hồi enzyme từ bã nấm men Sử dụng ph ng pháp qui ho ch thực nghi m trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm, chúng tơi xác định đ ợc thông số công ngh tối u cho trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase nh sau: tỉ l nấm men/dung môi: 1/6 (w/w), nhi t độ tự phân: 45oC, pH ban đầu: 5,5 th i gian tự phân: 50 gi Trong điều ki n này, tổng ho t tính ho t tính riêng c a chế phẩm invertase thu đ ợc lần l ợt 120,9 đ n vị ho t tính/g chất khơ nấm men 0,7 đ n vị ho t tính/mg protein STUDY OF BREWER YEAST AUTOLYSIS FOR INVERTASE EXTRACTION Le Van Viet Man, Tran Tham Minh Hoang, Nguyen Ngoc Tuyet Suong University of Technology, VNU-HCM ABSTRACT: This research focussed on brewer yeast autolysis for invertase extraction Firstly, classical method was used for determination of autolytic conditions of brewer yeast One parameter was varied while the others were fixed The results were as follows: ratio of Trang 54 T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 9, S 12 -2006 yeast and solven (acetate buffer): 1/6 (w/w), autolytic temperature: 50oC, initial pH: 5.5 and autolytic time: 50 hours In these conditions, the recovery invertase activity was 94.7 activity units/gram of yeast dry matter Then, the central composite design method was used to optimize the temperature and initial pH factors of brewer yeast autolysis for invertase extraction Our results showed that optimal temperature and pH for yeast autolysis were 45oC and 5.5 respectively The obtained invertase activity in the autolysate was 120.9 units/gram of yeast dry matter; the specific activity of the crude invertase was 0.7 units/mg protein TÀI LI U THAM KH O [1] Helrich K., Official methods of analysis of Association of official Analytical Chemist, AOAC publisher, Virgina (1992) [2] Goupy J., La methode des plans d’experiences, Bordas, Paris (1988) [3] Gratreva I M., Công nghệ enzyme, Agropromizdat, M c t khoa (1987) – tiếng Nga [4] Kunz W., Technology malting & brewing, VLB publisher, Berlin (1999) [5] Halász A., Use of yeast biomass in food product, CRC Press (1991) Trang 55 ... Development, Vol 9, No.12 - 2006 kỹ thu? ??t tối u c a trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase có ho t tính cao Tr ớc thực hi n trình tự phân, bã nấm men bia d ng s t thu đ ợc từ nhà máy bia. .. tự phân, oC), X2 (pH ban đầu c a mẫu tự phân) Y (ho t tính invertase, ĐVHT/g chất khơ nấm men) K T LU N Quá trình tự phân bã nấm men bia giai đọan quan trọng qui trình cơng ngh thu nhận chế phẩm. .. công ngh tối u cho trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase nh sau: tỉ l nấm men/ dung môi: 1/6 (w/w), nhi t độ tự phân: 45oC, pH ban đầu: 5,5 th i gian tự phân: 50 gi Trong