TIÊU CHUẨN NGÀNH : QUI TRÌNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH STREPTOCOCCUS SUIS

10TCN 819-2006 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 819 - 2006 QUI TRÌNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH STREPTOCOCCUS SUIS 10TCN 819-2006 Hà Nội - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 819-2006 QUI TRÌNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH STREPTOCOCCUS SUIS Procedure for isolation and identification of Streptococcus suis ngày (Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-BNN-KHCN tháng 12 năm 2006 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Phạm vi áp dụng Qui trình áp dụng cho công tác xét nghiệm phong thí nghiệm Khái niệm - Streptococcus suis nguyên nhân nhiều trình bệnh lý viêm màng não, nhiễm trùng huyết thời kỳ sơ sinh, viêm cuống phổi, viêm khớp rối loạn sinh sản (Tarradas C CS., 1994) - Nhiều chủng S suis có khả gây bệnh cho lợn Hai chủng huyết quan S suis typ (nhóm S) typ (nhóm R), - S suis type (S) thường gây bệnh cho lợn từ - tuần tuổi - S suis type (R) gây bệnh cho lợn từ sau cai sữa tháng tuổi - Người làm công tác thú y, tiếp xúc thường xuyên với lợn hoặc thịt lợn tưoi sống có thể bị nhiễm S suis type mắc bệnh viêm màng não, viêm nội tâm mạc nhiễm trùng huyết Nguyên liệu dụng cụ 3.1 máy móc - Tủ ấm 37oC - Tủ sấy - Buồng cấy - Kính hiển vi có vật kính dầu, vật kính khô hoặc phản pha - Nồi hấp ướt - Cân điện - Tủ lạnh - Lò vi sóng 3.2 Dụng cụ - Panh, kéo nhỏ - Đèn cốn - Que cấy 10TCN 819-2006 - Đĩa petri để đổ môi trường - Lam kính - Kính lúp - Lamen (coverslip) 3.3 Môi trường – hoá chất – Nguyên liệu - Môi trường chọn lọc Streptococcus (Edward medium hoặc thạch máu có bổ xung polymicin B crystal violet) - Môi trường thạch máu cừu/bị - Mơi trường đường inulin, mannitol, raffinose, trehalose, - Môi trường Voges- Proskauer (VP) - Môi trường nước thịt có 6,5% Nacl - Huyết chuẩn streptococcus nhóm D (R,S) Sơ đô phân lập giám định vi khuẩn 10TCN 819-2006 Bệnh phẩm Soi kính hiển vi Môi trường chọn lọc Thạch máu Soi kính hiển vi Giám định Định typ huyết Kết luận: (+) (-) Lấy mẫu bệnh phẩm - Mẫu xét nghiệm hạch amidan, phổi, phủ tạng, máu (thể nhiễm trùng huyết), dịch rỉ viêm, dịch khớp mủ Soi kính hiển vi 10TCN 819-2006 - Mủ khuẩn lạc sau phân lập được dùng để phết kính nhuộm gram - Vi khuẩn streptococcus suis bắt màu gram (+) có dạng hình cầu dài hoặc hình trứng thường đứng đơn lẻ, xếp đôi, ít chuỗi ngắn Phân lập - Xử lý vô trùng phía (đối với bệnh phẩm tổ chức) bằng đốt nóng cán panh áp vào bề mặt tổ chức Tổ chức phía được dùng cho phân lập vi khuẩn - Bệnh phẩm được cấy lên loại mơi trường thạch máu (bị, ngựa, cừu) môi trường chọn lọc (chuẩn bị môi trường xem phụ lục), nuôi cấy 37oC, 24 h - Khuẩn lạc S suis mọc sau thời gian ni cấy có dạng nhỏ (khoảng 1-2mm) trịn trơn bóng láng hoặc nhẵn, thường gây dung huyết alfa hoặc không dung huyêt - Các khuẩn lác nghi S.suis cần phải được giám định Giám định vi khuẩn - Để giám định VK S suis có thể dùng số những kit thương mại API 20S, rapid STREP (Analytab Products) hay RapID STR system (Innovative Diagnostic System) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Hoặc không, dựa vào số tính chất sau streptococcus suis (bảng 1) để giám định: (Các phương pháp để kiểm tra tính chất sinh hoá được mơ tả phần phụ lục) nhỏ, + trịn trơn S suis type D(R) α, nhỏ, + (+) - (+) KDH tròn trơn * Theo Tarradas C cộng sự 1994; Quinn P.L Carter G.R., 1994 Mọc 6,5% NaCl Trehalose Raffinose Mannitol Lactose inulin α, β, KDH Thuy phân aesculin D(S) Voges- Proskauer huyếtTính chất dung S suis type H ình thái khuẩn lạc Chủng streptococcus Nhóm huyết Bảng 1: Một số tính chất Streptococcus suis dùng cho giám định + - + - Định typ huyết - Vi khuẩn sau giám định cần phải được kiểm tra tính chất kháng nguyên theo phân nhóm Lancefield bằng kit thương mại Latex Agglutination test cho S suis (Wellcome Diagnostics; Difco laboratories; Scott Laboratories Diagnostic Products Corporation) 10TCN 819-2006 10 Tài liệu tham khảo Quinn P.L Carter G.R 1994 Veterinary clinical microbiology USA Swine disease 1994, USA Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam 2002, Viện thú y quốc gia – JICA Sydney M F and Ellen J B 1986 Bailey Diagnostic and Scott’s Microbiology Ed th The C V Moshy Company, Missouri, USA Richard F 2002 What Happened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and Nomenclature Changes Clinical Microbiology Reviews, 15; 4, p 613-630 Tarradas C., Arenas A., Maldonado A., Luque I., Miranda A and Perea A 1994 identification of Streptococcus suis Isolated from Swine: Proposal for Biochemical Parameters Journal of Clinical Microbiology, 32; p 578-580 Ashish A S., Shreekumar R P and Bhushan M J 2002 Evaluation of five selective media for isolation of catalase-negative gram-positive cocci from bulk tank milk Journal of dairy science, 85, p 1127-1132 Gottschalk M., Higgins R ans Boudreau M 1993 Use of polyvalent coagglutination reagents for serotyping of streptococcus suis Journal of Clinical Microbiology 31; 8, p 2192-2194 Florence B H., Roland C., Annie L., Marcelo G., Jean-Yves C and Marylene K 2001 The Canadian journal of veterinary research 65, p 196-200 Gottschalk M., Lacouture S and Odierno L 1999 Immunomagnetic isolation of streptococcus serotypes and from swine tonsils Journal of clinical microbiology 37; 9, p 2877-2881 KT BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng Phụ lục Chuẩn bị thạch máu 10TCN 819-2006 Nguyên liêu: - Thạch máu bản/ Blood agar base - Máu cừu/bò bệnh - Nước cất Chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất - Thạch máu được hoà với nước cất theo tỉ lệ đun cho tan hết, sau đó hấp 121oC 15 phút Sau hấp để nguội đến khoảng 37oC thi cho thêm 5-7% máu cừu hoặc bò, lắc nhẹ cho đổ đĩa Petri Chuẩn bị môi trường chọn lọc Hiện có rât nhiêu loại môi trường dùng cho phân lập vk Streptococcus nhiên những loại môi trường sau thường hay được dùng a) Edwards modified medium Nguyên liệu: - Edwards modified medium - Máu cừu/bò - Colistin - Oxonlinic acid - Nước cất Chuẩn bi - sau chuẩn theo hướng dẫn nhà sản xuất có thể bổ xung colistin mg/L and oxonlinic acid 2,5 mg/L and 5% máu cừu/bò để làm tăng khả mọc vi khuẩn  Vì môi trường Edward có chứa aesculin nên môi trường có thể dùng để kiểm tra tính chât thuỷ phân aesculin vi khuân có thể nhận biết khuẩn lạc môi trường có màu đen (hay dương tính thuỷ phân aesculin) b) Môi trường thạch máu được bổ xung polymyxin B Crystal violet - Thạch máu bản/ Blood agar base - Máu cừu/bò bệnh - Nước cất - polymyxin B - Crystal violet Chuẩn bị - Môi trường thạch máu sau chuẩn bi theo hướng dẫn nhà sản xuất đă nói phần chuẩn bị thạch máu được bổ xung thêm polymyxin B 10 mg/L Crystal violet 1mg/L sau cho máu vào môi trường Phương pháp kiểm tra khả sản sinh acetoin mơi trường VP Các mơi trường hố chất cần có bao gồm: a) Môi trường VP thương phẩm, có chứa peptoné, glucose buffer Chuẩn bị sau: Buffered peptone 7g Glucose 5g Dipotasium phosphate 5g Nước cất 1000ml b) Thuốc thử A Alpha naphthol (Sigma Chemical Co.) 5g 10TCN 819-2006 Ethyl alcohol (thuần khiết) 100ml Hoà tan Alpha naphthol lượng nhỏ Ethyl alcohol đổ thêm cho đủ 100 ml bình thuỷ tinh tam giác Giữ lọ nâu nhiệt độ 4oC c) Thuốc thử B Potassium hydroxide (KOH) 40g Nước cất 100ml - KOH phải được pha bình thuỷ tinh đặt nước lạnh để tránh sinh nhiệt Khi cân KOH phải cân thật nhanh vì KOH dễ hút ẩm chất ăn da bị ẩm, sau đó cho vào bình thuỷ tinh cho lượng khoảng 90ml nước cất Sau lắc cho tan thì cho thêm 10ml cho đủ lượng Chất thử được giữ bình nhưa nhiệt độ 4oC d) Phương pháp kiểm tra: - Sau nuôi cấy vi khuẩn phân lập được môi trường VP ít 48 nhiệt độ 37oC lấy 2,5 ml canh trùng cho vào ống nghiệm nhỏ vô trùng Sau đó cho 0,6 ml (6 giọt) thuốc thử A 0,2 ml (2 giọt) thuốc thử B Sau cho thuốc thử , lắc nhẹ ống nghiệm để 15 phút đem đọc kết quả: - Nếu môi trường có màu hồng phản ứng dương tính, màu vàng hoặc không màu âm tính Phương pháp kiêm tra khả thuỷ phân aesculin - Có thể dùng môi trường Edward để kiểm tra tính chất đă nói phần chuẩn bị môi trường Edward - Hoặc có thể dùng môi trường lỏng có chứa aesculin được chuẩn bị sau để kiẻm tra Aesculin 1g Peptone water 1000ml Feric cirtate 0,5 g Sau cho thành phần vào với nhau, lắc cho tan hấp 115 oC 10 phút Giữ nhiệt độ oC Nuôi cấy môi trường 37 oC theo dõi ngày môi trường chuyển từ màu nâu sậm sang màu đen dương tính Phương pháp kiểm tra khả lên men đường (inulin, lactose , mannitol, raffinose, trehalose) a) Chuẩn bị môi trường Peptone water 100ml Chỉ thị màu andrade 1ml Sau cho thành phần vào với nhau, lắc cho chia vào ống nghiệm, mỗi ống ml b) Chỉ thị mau andrade Fucsin acid 0,5g Nước cất 100ml Dung dịch NaOH-1N 16ml - Nghiền fucsin cối sứ nhỏ mịn hoà vào nước cất cho tan hết Cho vào từ từ dung dịch NaOH-1N, vừa cho vừa lắc đến mầu từ đỏ tươi chuyển thành đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì (lượng NaOH nhỏ vào thường từ 12-17 ml, trung bình 16 ml vừa) Để lắng 1-2 lọc qua giấy lọc Hấp ướt 120oC 15 phút 10TCN 819-2006 c) Dung dịch đường Trehalose 10g Nước cất 100ml Hoà tan Trehalose (inulin, lactose, mannitol, raffinose) nước cất hấp 110oC vòng 20 - 30 phút Dung dịch đường được giữ nhiệt độ 4oC d) Phương pháp kiểm tra: - Mỗi ống môi trường peptone có chỉ thị màu andrade (4ml) được cho 0,3 ml dung dịch đường Cấy giống vi khuẩn phân lập được vào môi trường để tủ ấm 37 oC sau 24 lấy đọc kết - Nêu môi trường không thay đổi màu màu vẫn vàng tức vk không sinh acid, phản ứng âm tính - Nếu môi trường chuyển từ màu vàng sang đỏ tức vi khuẩn sinh acid, phản ứng dương tính Phương pháp kiểm tra khả mọc môi trường có 6,5% NaCl a) Chuẩn bị môi trường Nước Peptone 100ml NaCl 6,5g - Cho thành phần vào lắc cho tan, chia vào ống (mỗi ống 5ml) sau đó hấp ướt 110oC vòng 20 phút Cất 4oC b) Phương pháp kiểm tra - Cây vi khuẩn vào ống môi trường để 37 oC sau 24 đem ria cấy lại môi trường chọn lọc có vi khuẩn mọc môi trường chọn lọc có nghĩa vi khuẩn sống được môi trường có 6,5% NaCl Ngược lại vi khuẩn không có khả mọc môi trường có 6,5% NaCl ... J B 1986 Bailey Diagnostic and Scott’s Microbiology Ed th The C V Moshy Company, Missouri, USA Richard F 2002 What Happened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and Nomenclature Changes... bằng kit thương mại Latex Agglutination test cho S suis (Wellcome Diagnostics; Difco laboratories; Scott Laboratories Diagnostic Products Corporation) 10TCN 819-2006 10 Tài liệu tham khảo Quinn... số những kit thương mại API 20S, rapid STREP (Analytab Products) hay RapID STR system (Innovative Diagnostic System) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Hoặc không, dựa vào số tính chất