DI TRUYỀN GIỐNG VẬT NUÔI ĐA HÌNH GEN PROLACTIN TRÊN VÙNG EXON 5 Ở VỊT LAI STAR53 BANG KỸ THUẬT PCR RFLP Lê Tấn Lợi, Phạm Thị Như Tuyết1 2, Nguyễn Thị Khánh Ly1, Hoàng Tuấn Thành2 và Nguyễn Ngọc Tấn1*[.]
DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NI ĐA HÌNH GEN PROLACTIN TRÊN VÙNG EXON Ở VỊT LAI STAR53 BANG KỸ THUẬT PCR-RFLP Lê Tấn Lợi, Phạm Thị Như Tuyết12, Nguyễn Thị Khánh Ly1, Hoàng Tuấn Thành2 Nguyễn Ngọc Tấn1* Ngày nhận báo: 10/12/2021 - Ngày nhận phản biện: 28/12/2021 Ngày báo châ'p nhận đăng: 30/12/2021 TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu khảo sát đa hình gen prolactin vùng exon vịt lai Star53 kỹ thuật PCR-RFLP Tổng số 60 cá thể vịt lai (30 mẫu trống 30 mâu mái) lây mẫu máu đê’ phân tích PCR-RFLP Cặp mồi thiết kế để khuếch đại đoạn gen mục tiêu có kích thước 536 bp thuộc vùng exon gen prolactin Sản phẩm PCR sau phân cắt enzyme Dral, PvuII Pstl Kết cho thâỳ enzyme không phân cắt locus PRL/Dral, phân cắt hình locus PRL/PvuII đa hình locus PRL/Pstl với 02 kiểu alien T c nhận diện, tần số kiểu gen cc CT 0,70 0,30 Kết phân tích thơng số đa hình cho thấy số PIC 0,223 tần số di hợp mong đợi 0,255 Từ kết nghiên cứu đa hình gen PRL locus PRL/Pstl nhóm vịt lai Star53 với alen c kiểu gen cc trội Anh hưởng kiểu gen đến tính trạng sinh sản nhóm vịt lai cần được làm sáng tỏ nghiên cứu Từ khóa: Vịt lai Star53, gen prolactin, exon 5, đa hình gen, PCR-RFLP ABSTRACT Investigation of prolactin gene polymorphism on exon in Star53 crossbred ducks by PCR-RFLP This study aimed to investigate the polymorphism of prolactin gene on exon in crossbred duck (Star53) A total of 60 blood samples were collected for conducting PCR-RFLP The primers were designed to amplify a fragment of 536 bp in exon region of the prolactin gene A total of 60 crossbred ducks were genotypes for Dral, PvuII and PstI restriction sites The monomorphic was found at PRL/Dral and PRL/PvuII sites The polymorphic site at PRL/PstI was observed and allele frequencies for c and T were 0.85 and 0.15 Two genotypes were observed and the genotype frequencies were 0.70 and 0.30 for cc and CT, respectively Additionally, the PIC and expected heterozygoty were 0.223 and 0.255, respectively In conclusion, the polymorphic site at locus PRL/ PstI was detected and c allele and cc genotype were dominant In order to understand more insight the association of PRL/PstI with reproductive traits of Star53 crossbed duck, further study is required Keywords: Star53 crossbred duck, Prolactin gene, exon 5, gene polymorphism, PCR-RFLP 1.BẶTVẤNĐỀ Prolactin (PRL) polypeptide hormone tiết từ thùy trước tuyêh yên có nhiều chức sinh học động vật có xương sơng (Dobolyi ctv, 2020) Ớ động vật có vú, prolactin giữ vai trị quan trọng việc đảm bảo cho q trình tổng hợp tiết sữa (Lacasse Trường Đại học Nông Lâm Tp Hổ Chí Minh TTNC&PT Chăn ni Gia cẩm VIGOVA * Tác giả liên hệ: TS Nguyễn Ngọc Tân, Giảng viên Khoa Khoa học Sinh học - Trường ĐH Nơng Lâm Tp Hổ Chí Minh; Email: nntan@hcmuaf.edu.vn; ĐT: 0948 993 338 ctv, 2016) chim, prolactin ảnh hưởng đến q trình giao phơi hay nuôi dưỡng chim non (Angelier Chastel, 2009) gia cầm thủy cầm, prolactin có ảnh hưởng đến sản xuất trứng tập tính â'p trứng gây nên việc tăng hormone prolactin kết mang lại giảm sản xuất tế bào trứng buồng trứng (Talbot Sharp, 1994), từ làm giảm sản xuâ't trúng Ở gà, trình tự gen prolactin giải mã hoàn chinh (Ohkubo ctv, 2000; Au Leung, 2002) đa hình KHKT Chăn ni sơ 275 - thảng năm 2022 DI TRUYỀN - GIÓNG VẬT NUỐI gen PRL ảnh hưởng đa hình gen nói chung đến thành tích sản xuất trứng báo cáo (Cui ctv, 2005, 2006) đa hình SNPs exon có ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng trứng (Rashidi ctv, 2012) Ở vịt, gen prolactin khoảng lOkb chứa exon intron, mã hóa cho 229 axít amin, vùng exon chứa trình tự mã hóa axít amin nhiều (Li ctv, 2009) Nhiều nghiên cứu cho thây đa hình gen PRL có ảnh hưởng đêh tính trạng suất trứng sô' giông vịt (Wang ctv, 2011; Mohamed ctv, 2017; Purwantini ctv, 2020; Sabry ctv, 2020) Ớ Việt Nam, chăn nuôi thủy cầm vịt lồi ni phơ biến nhâ't đê cung cap thịt trứng cho nhu cầu tiêu dùng người, tổng sô' lượng vịt khoảng 86,5 triệu (Cục Chăn nuôi, 2021) Nhiều nghiên cứu tập trung vào giải pháp chọn lọc lai tạo để kết hợp kiểu gen kiểu hình với mong mn tạo nhiều giơng vịt có suất cao khả chông chịu tô't, đặc biệt phù hợp với vấn đề thay đổi khí hậu Mục tiêu nghiên cứu bước đầu khảo sát đa hình gen prolactin vùng exon nhóm vịt lai vịt Star53 vịt Biển, tạo sở liệu mức phân tử cho định hướng chọn lọc phát triển nhóm vịt lai 2.1 Vật liệu hóa chất Vịt lai Star53 lai tạo nuôi Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Chăn nuôi Gia cầm VIGOVA - Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ, mẫu máu thu thập từ 60 cá thê’ tuần tuổi, giữ ống chông đông chứa EDTA, bảo quản 4°c đưa phịng thí nghiệm sau bảo quản -30°C sử dụng Tách chiết DNA tổng sơ' kít TopPURE® blood DNA exctraction (ABT-Việt Nam) Phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu thực kit MyTaqTM Mix 2X (Bioline-Anh) Phản ứng cắt thực bang enzyme cắt giới hạn Dral, PvuII (Thermo Scientific-Mỹ) Pstl (Biolab-Anh) theo hướng dẫn nhà sản x't Hóa châ't điện KHKTChăn ni sơ 275 - tháng năm 2022 di: Agarose 1,5% (Bioline-Anh), GelRed O,1X (TBR), ladder lOObp (Thermo Scientific-Mỹ), dung dịch đệm TBE 0,5X (Việt Nam) 2.2 Thời gian địa điểm Thí nghiệm (TN) thực từ tháng 8/2021 đến tháng 11/2021, Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học - Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ 2.3 Nội dung phương pháp 2.3.1 Khuếch đại gen mục tiêu bằngPCR ADN tách chiết KIT theo hướng dẫn nhà sản xuâ't Sản phẩm ADN hệ gen kiểm tra thông qua điện di gel agarose 1% đo quang phơ’ hâ'p thụ bước sóng 260 280nm máy Nanodrop Cặp mồi thiết kê' dựa mạch khuôn có mã sơ' truy cập AB158611.1 (Anas platyrhynchos, genbank: https://www ncbi.nlm.nih.gov) Trình tự (5'-3z) mổi xi TGCAAAGTCAGATTCCACCA mồi ngược GCAAAGCAACAAGAACACCA, kích thước khoảng 536bp nằm vùng exon gen PRL từ vị trí 5.558 đến 6.093 Khuếch đại gen mục tiêu với kích thước 536bp máy MasterCycler Pro s (Eppendorf, Đức) Phản ứng PCR (25pl) chứa thành phần: 12,5pl MyTaqTM Mix 2X, 0,8pl môi primer, 2pl DNA khuôn mẫu 8,9 pl H7O Chu trình nhiệt thực theo bữớc: (1) 95°c phút; (2) 95°c 30 giây; (3) 59°c 30 giây; (4) 72°c 30 giây; (5) lặp lại 35 chu kỳ từ bước đến 4; (6) 72°c phút (7) giữ nhiệt độ 4°c 10 phút Các sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose 1,5% (30 phút, 100V), quan sát chụp hình ảnh điện di máy GelDoc It2 (UVP, USA) với thang chuẩn lOObp 2.3.2 Phân tích đa hình bang enzyme cắt giới hạn Sử dụng phần mềm phân tích NEBcutter V2.0 (https://nc2.neb.com/NEBcutter2) đê’ xác định loại enzyme cắt cắt đoạn trình tự gen mục tiêu Kết xác định loại enzyme cắt có khả phù hợp đê khảo sát tính đa hình đoạn gen mục tiêu DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NI Bảng Kích thước sản phârn dự kiến sau phân cắt enzyme quy ước kiêu gen gen PRL Nhiệt độ u(°C) Enzyme Dr«I 37 PuuII 37 Pstl 37 Kích thước đoạn DNA(bp) ■ 313/223 536/313/223 536 478/58 536/478/58 536 536 536/406/130 406/130 ứng gắn mồi, chọn mức nhiệt độ 59°c cho phản ứng PCR khuếch đại vùng gen có kích thước 536bp vùng exon cho tất mẫu vịt lai thu nhận Kết khuếch đại gen mục tiêu trình bày Hình cho thâỳ khuếch đại đoạn gen mục tiêu 536bp tương ứng với kích thước mong đợi theo thiết kế dự kiến Kiểu gen cc GC GG BB AB AA cc L 500bp - Phản ling enzyme cắt giới hạn: Phản ứng enzyme cắt (18gil) gồm: lOpl H2O nuclease-free water, pl sản phẩm PCR, 2pl 10X Buffer en zyme, pl enzyme cat giới hạn Hon hợp phản ring ủ 37°c máy ủ nhiệt khô (Dry block thermostat; Biosan, Latvia) 16 Các sản phẩm sau phân cắt enzyme điện di gel agarose 2.5% (40 phút, 100V), quan sát chụp hình ảnh điện di máy GelDoc It2 (UVP, USA) với thang chuẩn lOObp KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khuếch đại gen mục tiêu kích thước 536bp Sau thực tơi ưu nhiệt độ phản 22 23 24 25 49 50 51 52 53 - — — — — ã ô536 bp Bờn cnh ú, mẫu số 25 chọn giải trình tự đại diện cho sản phẩm 536bp, sau BLAST hệ thống NCBI đê đổì chiếu với mạch khn dùng thiết kế mồi Kê't cho thây tính tương trình tự vị trí chọn làm primer khn khớp với trình tự mẫu phân tích kết trình bày Hình Kết hợp liệu từ Hình chứng tỏ kết khuếch đại sản phẩm mang tính đặc hiệu Xác định tần số alien, kiểu gen trắc nghiệm xz phần mềm POPGENE 1.31 21 Hình Kết điện di sản phâm PCR khuếch đại gen PRL mục tiêu với kích thước 536bp 2.4 Xử lý số liệu _ 20 CT TT 5- —_ 70 —— 00 TGCAAAGTCR gaTTCCACCẠ GACATCGGTT AACACATTAG ATCTTAGAAC ACTGACAGCT GAGCTTCTTA CATATTTTAG GGAAATAAAC TGTAAAATGG 110 120 130 140 ISO l«o 170 180 190 200 AAATTCACTC AAAATCTGCA TGAGGATATA CAACATTGTA CAGAATAATG CAAACCATAA AAGAAAAGAC TTTATGAGCT GTACACTACT ATCTAGCATT 210 220 230 240 250 2«o 270 280 290 300 CCTCAAGGCC 310 AGTATTTCTT AGTTCTCTGT CCTACATCCA GTCAGATTCA TTATTATCTA CTẦCGGTATC ATTTTGTGCC TTTAGGTTCA TTCTGGCGAC 320 330 340 350 340 370 380 390 400 ATTGGAAATG 410 AAATTTATTC TCAGTGGGAA GGCCTTCCAT CCTTGCAACT TGCCGATGAG GACTCCAGAC TCTTTGCCTT TTACAACCTG CTGCATTGCC 420 430 440 4S0 440 470 480 490 500 TCCGCAGAGA 510 TTCCCACAAA ATTGACAACT ATCTCAAGGT TTTGAAGTGC CGCCTAATAC ATGATAGCAA TTGCTAAGTA CTCCTGGGCT TCATCGCTTA 520 530 540 550 CTAAAATCAT ĨCAĨCATGGT GTTCTTGTTG CĨTTGC Hình Giải trình tự đoạn gen PRL khuếch đại cặp primer thiết kê Ghi chú: Trình tự gạch chân vị trí primer Phân tích đa hình enzyme cắt giói hạn 60 mẫu vói enzyme Dral PvuII, kết 3.2.1 Nhận diện đa hình bans enzyme Dral, cho thâỳ locus PRL/Dral cho kết đơn hình (khơng phân cắt) phân cắt hình PvuII locus PRL/PvuII Kết trình bày Hình Tiên hành phân cắt sản phẩm PCR (536bp) 3.2 KHKT Chăn nuôi sô 275 - thảng năm 2022 DI TRUYỀN - GIĨNG VẬT NI Hình Kết phản ứng A: không phân cắt enzyme Dral (GG: 536bp), B: phân cắt đồng hình enzyme PvuII (BB: 478/58bp) Từ Hình 3A nhận thâỳ enzyme Dral khơng phân cắt nên có kiêu gen GG nhận diện Theo Sabry ctv (2020) nghiên cứu giôhg vịt Cambell, Moulard Muscovy Ai Cập đơi vói locus PRL/Dral cho thây cắt đa hình vị trí A5871G exon với tần số alien G 0,15; 0,74 0,85, tần số alen c tương ứng 0,85; 0,26 0,15 Tương tự, Yurnalis ctv (2019) cho thấy đổỉ với locus PRL/Dral giơng vịt Bayang (Indonesia) có tần sô' kiểu gen cc, CT TT 0,684;0,293 0,021 Tương tự, phân cắt sản phẩm PCR (536bp) với enzyme Pstl, kết cho thâỳ có phân cắt đa hình vị trí cắt locus PRL/Pstl (Hình 4) sau phân cắt enzyme Pstl có kiểu alien c T, có hai kiêu gen cc (536) CT(536/406/130) nhận biết L 12 13 18 19 50 51 52 57 58 =a — — - — — — — — — — 5OObp — Đối với enzyme PvuII, kết cắt đồng hình locus PRL/PvuII cho tương ứng với kiểu gen BB (478/58) trình bày Hình 3B Dựa kết thăm dị vị trí enzyme cắt giới hạn phần mềm Nebcutter (V2.0) cho thây enzyme dự kiến cắt đoạn gen khuếch đại có ba kiểu gen Tuy nhiên nghiên cứu cho thây kết xuâ't kiểu gen BB (478/58), điều cần nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ cho locus ’ — CT cc CT 536 bp «- 406 bp —