Đang tải... (xem toàn văn)
Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề Khoa học tự nhiên (2022)(2) 94 101 94 DOI 10 22144/ctu jvn 2022 125 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BẢN ĐỊA CHO SẢN XUẤT[.]
Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 DOI:10.22144/ctu.jvn.2022.125 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BẢN ĐỊA CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở BẠCH LONG, TỈNH NAM ĐỊNH Đỗ Quang Trung1*, Vũ Văn Hạnh2 Lưu Thế Anh1 Viện Tài nguyên Môi trường, Đại học Quốc gia Hà Nội Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Người chịu trách nhiệm viết: Đỗ Quang Trung (email: trungcnsinh@gmail.com) Thông tin chung: ABSTRACT Ngày nhận bài: 02/05/2022 Ngày nhận sửa: 18/05/2022 Ngày duyệt đăng: 23/05/2022 Probiotic supplements are able to improve animal health and nutrition but respective bacteria have mainly been isolated from terrestrial, warmblooded hosts, limiting an efficient application in shrimp, fish, and clams Probiotics from native bacterial species adapted to the digestive tracts of the respective aquatic species are therefore more effective In this study, 194 bacterial strains were isolated from the digestive systems of clams, shrimp, and fish The strain TON1.4 showed high extracellular enzyme activity and the ability to inhibit the best tested bacterial strains The 16S rDNA gene sequencing results showed that strain TON1.4 is Bacillus amyloliquefaciens Moreover, strain TON1.4 is also able to tolerate pH from to 9, and salt concentration from 0.5 to 6% The strategy of isolation and characterization of native bacterial strains with potential for probiotic production is presented that can be easily adapted to other aquatic species Title: Isolation and characterization of native probiotics for aquaculture farming in Bach Long, Nam Dinh Từ khóa: Bacillus amyloliquefaciens, bổ sung probiotic, nuôi trồng thủy sản, vi khuẩn địa Keywords: Aquaculture, Bacillus amyloliquefaciens, native bacteria, probiotic supplementation TĨM TẮT Thức ăn bổ sung probiotic cải thiện sức khỏe dinh dưỡng vật nuôi, vi khuẩn tương ứng chủ yếu phân lập từ vật chủ máu nóng cạn, hạn chế ứng dụng hiệu tôm, cá ngao Chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn địa thích nghi với đường tiêu hóa lồi thủy sản tương ứng hiệu Trong nghiên cứu này, 194 chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa ngao, tơm, cá Chủng TON1.4 cho thấy hoạt tính enzyme ngoại bào cao khả ức chế chủng vi khuẩn kiểm định tốt Kết giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng TON1.4 Bacillus amyloliquefaciens Hơn nữa, chủng TON1.4 có khả chịu pH từ đến 9, nồng độ muối từ 0,5 đến 6% Chiến lược phân lập xác định đặc điểm chủng vi khuẩn địa trình bày có tiềm cho sản xuất probiotic ,có thể dễ dàng thích nghi với loài thủy sản khác Tuy nhiên, năm gần đây, việc thâm canh hóa với mật độ cao kèm khí hậu thay đổi thất thường làm bùng phát dịch bệnh động vật thủy GIỚI THIỆU Ngành thủy sản Việt Nam nói chung Nam Định nói riêng đầu tư phát triển mạnh 94 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 sản Thêm vào đó, chất lượng nước mơi trường nuôi bị ô nhiễm làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi Mặt khác, việc sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh động vật thủy sản thường xuyên không liều lượng tạo số dòng vi khuẩn kháng thuốc (World Bank, 2013) phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu Các hóa chất ni cấy định tính, định lượng từ hãng Sigma, Merk, Oxoid, Wako (Nhật Bản), Ấn Độ, Trung Quốc Việt Nam Việc sử dụng hoá chất tồn giới ngành cơng nghiệp khác ngày tăng có ảnh hưởng tới sức khoẻ người Ngồi ra, việc thay hố chất độc hại sản phẩm thân thiện với môi trường ngày quan tâm phát triển Do đó, cần phải có giải pháp cải thiện chất lượng môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến động vật thủy sản người (Cabello et al., 2013; Madhana et al., 2021; Mondal et al., 2022) Máy móc, thiết bị sử dụng nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường thạch LB (g/L): peptone 10, cao nấm men 5, NaCl 5, agar 20, nước lít, pH 7,0 ± 0,2 Mơi trường xác định hoạt tính enzyme: mơi trường LB thạch có chứa 0,1% CMC (Carboxymethyl cellulose), môi trường LB thạch chứa 1% tinh bột, môi trường LB thạch chứa 1% casein 1%, môi trường LB thạch chứa 1% phosphate Tất môi trường khử trùng 121°C 20 phút để nguội trước sử dụng 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phân lập định danh vi khuẩn Hiện nay, việc sử dụng vi sinh vật hữu ích vào nuôi trồng thủy sản nhằm khắc phục vấn đề giải pháp ứng dụng rộng rãi Theo Bao and Shen (2005), hệ thống nuôi thủy sản bền vững cần có diện nhóm vi khuẩn có lợi Nhóm vi khuẩn khơng chứa độc tố, không hiệu ứng phụ, không tồn lưu khơng kháng kháng sinh Nhóm vi khuẩn hiệu việc cải thiện môi trường,tăng hệ miễn dịch vật ni, giảm stress trì trạng thái cân hệ sinh thái thủy vực (Hoseinifar et al., 2018; Madhana et al., 2021) Vi khuẩn biết đến đối tượng quan trọng sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học chủng Bacillus sp biết đến chủng có khả phân giải hợp chất hữu đất nhờ hoạt chất enzyme protease, amylase, cellulase, góp phần khép kín vịng tuần hồn vật chất tự nhiên (Madhana et al., 2021) Đặc tính cịn ứng dụng q trình chế biến phân huỷ rác Mẫu ruột từ tôm, cá ngao cho vào ống eppendorf riêng rẽ có chứa 0,9 mL nước muối sinh lí khử trùng Mẫu pha loãng đến nồng độ 10-4 cấy trải đĩa petri chứa mơi trường LB thạch bọc kín túi nilon, ủ 37°C Sau ngày quan sát khuẩn lạc, cấy chuyển để tách dòng vi khuẩn Khi khuẩn lạc sau nhiều lần cấy chuyển, chúng giữ giống bảo quản -80°C glycerol 30% Các khuẩn lạc riêng rẽ sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn sinh tổng hợp enzyme Chủng vi khuẩn chọn lọc định danh phương pháp giải trình tự 16S rRNA: tách chiết gen vi khuẩn kit QIAgen, khuếch đại trình tự 16S rDNA phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự sau: 27 F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′), 1492 R (5′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) Trong trình sống, vi khuẩn tiết nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, có khả kháng lại loài vi sinh vật khác nấm vi khuẩn Việc tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả thích nghi,ứng dụng cao phát triển phục vụ cho nuôi trồng thủy sản cần thiết PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Sản phẩm PCR chạy kiểm tra gel agarose 1% làm kit (QIAquick PCR Purification Kit) gửi giải trình tự hãng First Base (The Gemini, Singapore Science Park II, Singapore) Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh so sánh với ngân hàng sở liệu sinh học (National Center for Biotechnology Information, NCBI) cách sử dụng cơng cụ tìm kiếm trình tự tương đồng (Basic Local Alignment Search Tool, BLAST) Các mẫu phân lập thu nhận Bạch Long, Giao Thủy, tỉnh Nam Định gồm có cá, tơm ngao Vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Vibrio harveyi V parahaemolyticus từ Bộ sưu tập chủng giống 95 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 tán Các đĩa ủ 37°C Sau 24 giờ, đĩa lấy quan sát đo kích thước vịng kháng khuẩn (nếu có) Đối chứng dương Streptomycin 0,1 g/mL Kích thước vịng kháng khuẩn (mm) = D - (D đường kính vịng kháng khuẩn, mm) 2.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính chất kháng khuẩn có chất protein 2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Các đĩa LB thạch đục lỗ thạch đường kính mm Chủng vi khuẩn nuôi qua đêm (106 cfu/mL) ly tâm để thu dịch Năm mươi μL dịch ly tâm hút vào giếng, sau đĩa giữ nhiệt độ phòng để dịch khuếch tán Các đĩa ủ 37°C, 24 giờ, sau đó, chúng quan sát đo kích thước vịng thủy phân (nếu có) Hoạt tính enzyme tính đường kính vịng thủy phân khơng bị nhuộm màu thuốc nhuộm Để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính chất kháng khuẩn có chất protein (bacteriocin), dịch lên men chủng vi khuẩn ủ nhiệt độ khác khoảng từ 40 đến 100°C 30 phút Hoạt tính bacteriocin cịn lại xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kích thước vịng thủy phân (mm) Δ = D - d (D đường kính vịng thủy phân, mm; d: đường kính lỗ thạch, mm) Xác định hoạt tính enzyme amylase: Môi trường xác định hoạt tính amylase mơi trường LB bổ sung tinh bột tan (1%) agar (2%) (Bibi et al., 2017) Ảnh hưởng pH lên bacteriocin xác định cách điều chỉnh giá trị pH dịch sau lên men vi khuẩn HCl NaOH 1N từ đến 12, với bước nhảy ủ 37°C Tất mẫu sau điều chỉnh lại đạt giá trị pH trung tính trước kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 2.4.5 Phương pháp khảo sát đặc tính sinh trưởng vi khuẩn phân lập Xác định hoạt tính enzyme cellulase: môi trường LB bổ sung CMC (1%) agar (2%) (da Cruz Ramos et al., 1985) Xác định hoạt tính enzyme protease: môi trường LB bổ sung casein (1%) agar (2%) (Hung et al., 2007) Khả chịu pH: Các chủng tuyển chọn cấy môi trường LB điều chỉnh pH HCl NaOH theo giá trị pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Nuôi cấy lắc 150 rpm, 37°C, đo OD600nM để xác định mật độ vi khuẩn sau 18 Xác định hoạt tính enzyme phytase: môi trường LB chứa phosphate (1%) agar (2%) (de Oliveira Costa et al., 2012) Khả chịu mặn: Các chủng tuyển chọn cấy môi trường LB bổ sung thêm NaCl với nồng độ: 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6% Nuôi cấy lắc 150rpm, 37°C, đo OD600nM để xác định mật độ vi khuẩn sau 18 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Đĩa xác định hoạt tính enzyme amylase, cellulase sau ủ nhuộm màu Lugol 1,5% đo đường kính vịng thủy phân Đối chứng dương enzyme tương ứng (từ Sigma), nồng độ mg/mL Đĩa xác định hoạt tính enzyme protease sau ủ nhuộm màu TCA 25% đo đường kính vịng thủy phân Đối chứng dương enzyme Neutron protease (Sigma) mg/mL 2.4.3 Khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh Các mẫu phân lập thu thập từ biển ao nuôi xử lý bề mặt thu thập mẫu nội tạng để phân lập vi sinh vật 22 mẫu phân lập 194 chủng vi khuẩn đặc trưng hoạt tính chủng tiến hành kiểm tra Hình ảnh khuẩn lạc màu sắc số chủng vi khuẩn thể Hình Phương pháp đối kháng trực tiếp sử dụng để khảo sát đặc tính đối kháng với chủng vi khuẩn kiểm định Các chủng kiểm định cấy trải bề mặt môi trường thạch LB (100 µL dịch vi khuẩn nồng độ 106 cfu/mL) trước đục lỗ thạch có đường kính mm Các chủng vi khuẩn nuôi qua đêm 37°C 1mL dịch vi khuẩn (106 cfu/mL) ly tâm 4°C, 1000 rpm để thu dịch 50 µL dịch lên men sau ly tâm hút tra vào lỗ thạch, sau đó, đĩa giữ nhiệt độ 4°C để dịch khuếch Hình Hình ảnh số khuẩn lạc với màu sắc hình thái khác 96 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 Căn vào đường kính vịng phân giải chủng vi khuẩn phân giải amylase, cellulase, protease, phytase hoạt tính kháng chủng vi khuẩn kiểm định, chủng TON1.4 với hoạt tính tốt lựa chọn cho thí nghiệm Đặc tính chủng TON1.4 minh họa Hình , trình bày Bảng Bảng Kết phân tích trình tự nucleotide cho thấy chủng TON1.4 lồi Bacillus amyloliquefaciens trình tự đoạn gen 16S rDNA lưu ngân hàng gen với mã số MZ484519 Hình Khả kháng chủng vi khuẩn kiểm định chủng TON1.4 môi trường LB (A-E) khả sinh tổng hợp enzyme môi trường chứa chất đặc hiệu 37°C sau 24 (F-H) Do đó, chủng TON1.4 chọn cho nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, pH, độ mặn đến khả sống chủng Bảng Khả sinh tổng hợp enzyme chủng TON1.4 Tên mẫu ĐC TON1.4 Amylase Kích thước đường kính vịng thủy phân (∆=D-d) (mm) Cellulase Protease 18 11 15 + Phytase + 11 Bảng Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng TON1.4 Tên mẫu ĐC TON1.4 E coli 17 - Kích thước đường kính vịng thủy phân (∆=D-d) (mm) S aureus V harveyi V parahaemolyticus 23 21 20 10 + 3.2 Ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn qua hệ nuôi cấy chủng vi khuẩn TON1.4 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính chủng vi khuẩn TON1.4 Dịch lên men chủng TON1.4 ủ nhiệt độ khác dải từ 40 đến 100°C Sau 30 phút, dịch lên men mang ly tâm 10.000 rpm phút kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính enzyme Kết trình bày Bảng Bảng Dịch lên men chủng vi khuẩn ly tâm 10.000 rpm phút, sau thu dịch Năm mươi µL dịch hút cho vào giếng mơi trường có chủng vi khuẩn kiểm định để kiểm tra khả kháng chủng vi khuẩn kiểm định chủng Kết trình bày Bảng Từ kết nghiên cứu cho thấy, hầu hết chủng khả kháng E coli Trong đó, chủng có khả kháng S aureus ổn định Kết Bảng cho thấy, sau xử lý với nhiệt nhiệt độ khác nhau, hoạt tính kháng chủng vi khuẩn kiểm định Salmonella V paraheamolyticus giảm dần dải nhiệt độ ủ thấp đối chứng, hoạt tính kháng bắt đầu giảm từ 80°C Ngoài ra, kết cho thấy từ 70°C, hoạt tính kháng chủng S aureus tăng khơng đáng kể Chủng TON1.4 có khả kháng hai chủng V harveyi E coli Bảng Khả kháng S aureus chủng TON1.4 từ hệ đến Tên mẫu ĐC TON1.4 Kích thước đường kính vịng kháng khuẩn (∆=D-d) (mm) Thế hệ Thế Thế hệ Thế hệ hệ 22 21 21 22 8 Với kết thử hoạt tính enzyme loại chất khác cho thấy, enzyme amylase, protease, phytase hoạt tính >70°C, với cellulase 100°C (Bảng 5) Kết nghiên cứu cho thấy hoạt tính enzyme amylase trước sau ủ yếu Ở dải nhiệt độ từ 37 đến 70°C, hoạt tính enzyme cellulase khơng có thay 97 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 đổi so với đối chứng (không xử lý nhiệt) giảm dần từ 80°C từ đến 12, dịch lên men chủng phân lập có khả kháng S aureus hoạt tính giảm nhẹ pH cao Trong đó, chủng V paraheamolyticus bị kháng yếu dải pH từ đến 10, khơng kháng pH ngồi khoảng Dịch lên men chủng sau xử lí có khả kháng Salmonella typhi yếu khoảng pH từ đến 10, sau hoạt tính pH cao Kết phù hợp với kết nghiên cứu Ye et al (2017), chủng Bacillus amyloliquefaciens S1 có khả tạo cellulase mạnh với nhiệt độ lên men 37°C Khi nhiệt độ tăng, hoạt động enzym tăng lên sau giảm xuống 3.4 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính chủng vi khuẩn TON1.4 Từ kết nghiên cứu cho thấy, pH có ảnh hưởng đáng kể tới hoạt tính enzyme (Bảng 7) Cụ thể, hoạt tính enzyme amylase yếu có hoạt tính khoảng pH từ đến 10, hoạt tính cellulase giảm mạnh pH thấp (pH ≤4) cao (pH 12) Trong đó, protease có hoạt tính yếu (tương đương với ĐC) khoảng pH từ đến Phytase trì hoạt tính pH rộng, pH >10 hoạt tính phytase bị giảm dần Ye et al (2017) báo cáo giá trị pH môi trường lên men ban đầu tối ưu Bacillus amyloliquefaciens S1 lượng enzyme ổn định khoảng pH từ đến 6, khả tạo enzyme giảm đáng kể pH ban đầu từ đến Dịch lên men chủng TON1.4 điều chỉnh HCl NaOH 1N pH khác dải từ đến 12 ủ 37°C Sau giờ, dịch lên men trung hoà pH ban đầu ly tâm 10.000 rpm phút kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính enzyme Kết trình bày Bảng Bảng Từ kết nghiên cứu cho thấy, hoạt tính kháng chủng vi khuẩn kiểm định có khác chủng (Bảng 6) Sau xử lí dải pH Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả kháng khuẩn chủng TON1.4 Nhiệt độ ĐC (Không ủ) 40 50 60 70 80 90 100 E coli - Kích thước đường kính vịng kháng khuẩn (∆=D-d) (mm) Salmonella S aureus V harveyi V parahaemolyticus + 4 + + 3 8 2 Chú thích: (+): có hoạt tính nhỏ, (-): khơng có hoạt tính Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme chủng TON1.4 Nhiệt độ ĐC (Không ủ) 40 50 60 70 80 90 100 Amylase 12 + + + + - Kích thước đường kính vịng thủy phân (∆=D-d) (mm) Cellulase Protease Phytase 11 10 11 10 10 9 + 8 - Chú thích: (+): có hoạt tính nhỏ, (-): khơng có hoạt tính 98 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 Bảng Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn chủng TON1.4 pH (ĐC) 10 11 12 E coli - Kích thước đường kính vịng kháng khuẩn (∆=D-d) (mm) Salmonella S aureus V harveyi V parahaemolyticus 6 + + + + + + + + - Chú thích: (+): có hoạt tính nhỏ, (-): khơng có hoạt tính Bảng Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme chủng TON1.4 pH (ĐC) 10 11 12 Amylase + + + + - Kích thước đường kính vịng thủy phân (∆=D-d) (mm) Cellulase Protease Phytase 9 + 9 + 9 + 8 - Chú thích: (+): có hoạt tính nhỏ, (-): khơng có hoạt tính 3.5 Ảnh hưởng pH độ mặn lên sinh trưởng chủng vi khuẩn TON1.4 Các nồng độ muối khác thí nghiệm khơng làm thay đổi tốc độ sinh trưởng chủng Kết phù hợp với kết nghiên cứu Sutin (2010), tác giả cho thấy phạm vi độ mặn (0-4%) cần thiết cho phát triển tối ưu loài ven biển Tuy nhiên, kết nghiên cứu có sai khác với kết nghiên cứu Mevel and Prieur (2000) Tác giả báo cáo chủng Bacillus sp MS30 có độ mặn sinh trưởng tối ưu 16 g/L NaCl, phát triển độ mặn tăng lên 28,50 g/L NaCl Theo kết nghiên cứu gần đây, chủng Bacillus tồn đến nồng độ muối 7% (Zulkhairi Amin et al., 2020) Sự khác khác chủng Bacillus sp sử dụng nghiên cứu Giá trị pH môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp vi sinh vật không giống Muốn phát triển sinh tổng hợp enzyme mạnh chủng vi khuẩn chọn lọc địi hỏi phải có khoảng pH thích hợp Thí nghiệm tiến hành mức pH môi trường khác Kết nghiên cứu cho thấy chủng Bacillus sp phân lập phát triển chậm pH từ đến Chúng phát triển tối ưu pH sau tăng trưởng giảm dần từ pH đến 11 (Hình 3b) Kết phù hợp với kết nghiên cứu chủng Bacillus sp công bố (Ijaz et al., 2015) Trong đó, pH trung tính từ đến pH tối ưu cho phát triển vi khuẩn Bacillus sp mơi trường kiềm có lợi cho q trình nitrat hóa dị dưỡng vi khuẩn Bacillus sp (Mevel and & Prieur, 2000) Thêm vào đó, kết nghiên cứu cho thấy mơi trường có tính axit (pH từ đến Hình OD600nM chủng TON1.4 nồng độ muốn NaCl (A) nồng độ pH (B) khác sau 18 nuôi cấy Từ kết Hình 3, chủng TON1.4 có khả chịu pH từ đến (Hình 3a), nồng độ muối từ 0,5 đến 6% (Hình 3b) Ở độ pH 7, nồng độ muối từ 0,5 đến 2% điều kiện sinh trưởng tối ưu 99 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 6) kiềm (pH từ đến 10) làm hạn chế phát triển vi khuẩn Bacillus sp Nhận định phù hợp với nhận định Sheela et al (2014) Tác giả cho thấy phát triển loài Bacillus sp phân lập bị hạn chế pH từ 6đến 6,5 pH 8,5 KẾT LUẬN Salmonella typhi Hơn nữa, chủng TON1.4 có khả chịu pH từ đến 9, nồng độ muối từ 0,5 đến 6% Kết cho thấy chủng TON1.4 phù hợp với điều kiện môi trường nuôi tôm nước lợ nước ta Từ mẫu thu thập vùng nuôi thủy sản Bạch Long, Giao Thủy, Nam Định, 194 chủng vi khuẩn phân lập Chủng TON1.4 chọn có khả thích nghi với điều kiện mơi trường nước ao nuôi Chủng TON1.4 xác định lồi Bacillus amyloliquefaciens Chủng chọn lọc TON1.4 có khả sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, phytase có khả kháng S aureus, V paraheamolyticus, V harveyi Nghiên cứu thực từ nguồn kinh phí đề tài Khoa học Công nghệ cấp tỉnh Nam Định “Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất probiotic - đa enzyme ứng dụng bổ sung thức ăn nuôi trồng thủy sản, xử lý môi trường nuôi nhằm tăng hiệu kinh tế đảm bảo tính bền vững tỉnh Nam Định” Viện Tài ngun Mơi trường, Đại học Quốc gia chủ trì LỜI CẢM ƠN TÀI LIỆU THAM KHẢO Bibi, F., Ullah, I., Alvi, S.A., Bakhsh, S.A., Yasir, M., & Al-Ghamdi, A.A.K (2017) Isolation, diversity, and biotechnological potential of rhizoand endophytic bacteria associated with mangrove plants from Saudi Arabia Genetics and Molecular Research 16(2): 1-12 future perspectives Frontier Microbiology 9:2429 https://doi.org/10.4238/gmr16029657 Bao, X., & Shen, W (2005) Manufacture and application of micro ecological agents In: www BIOX CN 2005-4-16 Cabello, F.C., Godfrey, H.P., Tomova, A., Ivanova, L., Dölz, H., Millanao, A., & Buschmann, A.H (2013) Antimicrobial use in aquaculture reexamined: its relevance to antimicrobial resistance and to animal and human health Environmental Microbiology 15(7):1917–42 https://doi.org/10.1111/1462-2920.12134 da Cruz Ramos, G.F., Ramos, P.L., Passarini, M.R.Z., Vieira Silveira, M.A., Okamoto, D.N., de Oliveira, L.C.G., Zezzo, L.V., Marem, A., Santos Rocha, R.C., da Cruz, J.B., Juliano, L., & de Vasconcellos, S.P (2016) Cellulolytic and proteolytic ability of bacteria isolated from gastrointestinal tract and composting of a hippopotamus AMB Express 6(1): 17 https://doi.org/10.1186/s13568-016-0188-x de Oliveira Costa, L.E., de Queiroz, M.V., Borges, A.C., de Moraes, C.A., & de Araújo, E.F (2012) Isolation and characterisation of endophytic bacteria isolated from the leaves of the common bean (Phaseolus vuglaris) Brazilian Journal of Microbiology 43(4): 1562-1575 https://doi.org/10.1590/S1517838220120004000041 Hoseinifar, S.H., Sun, Y.Z., Wang, A., & Zhou, Z (2018) Probiotics as means of diseases control in aquaculture: A review of current knowledge and future perspectives Frontier Microbiology 9:2429 https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02429 Hung, P.Q., Kumar, S.M., Govindsamy, V., & Annapurna, K (2007) Isolation and characterization of endophytic bacteria from wild and cultivated soybean varieties Biology and Fertility of Soils 44: 155-162 https://doi.org/10.1007/s00374-007-0189-7 Ijaz, A., Shabir, G., Khan, Q.M., & Afzal, M (2015) Enhanced remediation of sewage effluent by endophyte-assisted floating treatment wetlands Ecological Engineering 84: 58–66 https://doi.org/10.1016/j.ecoleng.2015.07.025 Madhana, S., Kanimozhi, G., & Panneerselvam, A (2021) Probiotics in shrimp aquaculture In Advances in Probiotics, Academic Press, p 309325 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-8229095.00020-4 Mondal, S., Mondal, D., Mondal, T., & Malik, J (2022) Application of probiotic bacteria for the management of fish health in aquaculture Bacterial Fish Diseases, Academic Press, p.351378 https://doi.org/10.1016/B978-0-323-856249.00024-5 Mevel, G., & Prieur, D (2000) Heterotrophic nitrification by a thermophilic Bacillus species as influenced by different culture conditions Canadian Journal of Microbiology 46(5): 465473 https://doi.org/10.1139/w00-005 Sutin, S (2010) Water quality of mullet (Liza oligolepis, Bleeker, 1985) at Nakhon Si Thammarat bay, Nakhon Si Thammarat province Wichcha Journal Nakhon Si Thammarat Rajabhat University 29(2): 58-63 Sheela, B., Khasim beebi, S., & Yellaji rao, O (2014) Bioremediation of ammonia using ammonia oxidizing bacteria isolated from sewage International Journal of Environmental 100 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 94-101 Bioremediation & Biodegradation 2(4): 146-150 https://doi.org/10.12691/ijebb-2-4-1 World Bank (2013) The World Bank Annual Report Washington, DC ©World Bank https://openknowledge.worldbank.org/handle/10 986/16091 https://doi.org/10.1596/978-0-82139568-4 Ye, M., Sun, L., Yang, R., Wang, Z., & Qi, K (2017) The optimization of fermentation conditions for producing cellulase of Bacillus amyloliquefaciens and its application to goose feed Royal Society open science, 4(10): 171012 https://doi.org/10.1098/rsos.171012 Zulkhairi Amin, F.A., Sabri, S., Ismail, M., Chan, K.W., Ismail, N., Mohd Esa, N., Mohd Lila, M.A., & Zawawi, N (2020) Probiotic properties of Bacillus strains isolated from stingless bee (Heterotrigona itama) honey collected across Malaysia International Journal of Environmental Research and Public Health 17(1):278.https://doi.org/10.3390/ijerph17010278 101 ... Phân lập định danh vi khuẩn Hiện nay, vi? ??c sử dụng vi sinh vật hữu ích vào nuôi trồng thủy sản nhằm khắc phục vấn đề giải pháp ứng dụng rộng rãi Theo Bao and Shen (2005), hệ thống nuôi thủy sản. .. Khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh Các mẫu phân lập thu thập từ biển ao nuôi xử lý bề mặt thu thập mẫu nội tạng để phân lập vi sinh vật 22 mẫu phân lập 194 chủng vi khuẩn đặc trưng hoạt tính chủng... đến 6% Kết cho thấy chủng TON1.4 phù hợp với điều kiện môi trường nuôi tôm nước lợ nước ta Từ mẫu thu thập vùng nuôi thủy sản Bạch Long, Giao Thủy, Nam Định, 194 chủng vi khuẩn phân lập Chủng