ĐIỀU CHẾ VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU A VÀ C CỦA MELOXICAM

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu ĐIỀU CHẾ VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU A VÀ C CỦA MELOXICAM Võ Minh Thắng1, Nguyễn Đức Tuấn2 TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tạp A tạp C có nguồn gốc từ trình tổng hợp meloxicam Trong chuyên luận nguyên liệu thành phẩm meloxicam dược điển Việt Nam V dược điển tham chiếu có quy định kiểm tra tạp A tạp C Trong danh mục chất chuẩn quốc gia chưa có tạp A tạp C chuẩn Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nước cơng bố quy trình điều chế tạp A tạp C meloxicam Mục tiêu: Điều chế thiết lập tạp chất đối chiếu A C meloxicam Đối tượng phương pháp: Tạp A điều chế từ ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3carboxylat 1,1-dioxid phương pháp kết tinh với ethanol Tạp C tổng hợp phản ứng SN2 meloxicam methyl iodid môi trường dimethyl sulfoxid/kali hydroxyd tinh chế phương pháp kết tinh dimethylformamid Các sản phẩm điều chế xác định cấu trúc kỹ thuật phổ nghiệm, định lượng HPLC-PDA thiết lập chất đối chiếu Kết quả: Tạp A tinh chế với hiệu suất 87% Tạp C tổng hợp tinh chế với hiệu suất 67% Sản phẩm điều chế có hàm lượng 99% tính nguyên trạng, đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu Kết luận: Tạp A C meloxicam điều chế thiết lập chất đối chiếu sử dụng kiểm tra tạp chất meloxicam Từ khoá: tạp chất meloxicam, ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat 1,1-dioxid, (Z)-N-methyl meloxicam, N-[(2Z)-3,5-dimethylthiazol-2(3H)-ylidene]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2benzothiazin-3-carboxamid 1,1-dioxid ABSTRACT SYNTHESIS AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE SUBSTANCE AS RELATED COMPOUNDS A AND C OF MELOXICAM Vo Minh Thang, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 26 - No - 2022: 37 - 51 Background: Meloxicam impurity A and impurity C, the related compounds of meloxicam, are processrelated impurity The Vietnamese V and reference Pharmacopoeias require testing impurity A and impurity C in meloxicam pharmaceutical substances and finished products However, the reference standards of impurity A and impurity C are not in the national list of reference standards There have been no published local studies on chemical synthesis and reference substance establishment of impurity A and impurity C so far Objectives: This study was conducted with the aim of synthesis and establishment of reference substance as related compounds A and C of meloxicam Methods: Impurity A was purified from ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxylate 1,1-dioxide by recrystallization with ethanol Impurity C was synthesized from meloxicam by SN2 reaction with iodomethane in dimethyl sulfoxide/potassium hydroxide, then purified by recrystallization with dimethylformamide The products were structurally determined by spectroscopic techniques, assayed by HPLC-PDA, and finally established as reference substance Results: Impurity A was purified with yield of 87% Impurity C was synthesized and purified with total yield Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Tiền Giang Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: GS.TS.DS Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 B - Khoa học Dược Email: ductuan@ump.edu.vn 37 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 of 67% The products had HPLC purity over 99% on the basis and conformed to establish reference substance Conclusion: Impurity A and C were successfully synthesized and established as the reference substances for related compound test of meloxicam Keywords: meloxicam impurity, ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazine-3-carboxylate 1,1-dioxide, (Z)-N-methyl meloxicam, N-[(2Z)-3,5-dimethylthiazol-2(3H)-ylidene]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide ĐẶT VẤNĐỀ ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Tạp A (ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2benzothiazine-3-carboxylat 1,1-dioxid) tạp C (N-[(2Z)-3,5-dimethylthiazol-2(3H)-yliden]4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3carboxamid 1,1-dioxid hay (Z)-N-methyl meloxicam) meloxicam tạp xuất q trình tổng hợp gây ảnh hưởng khơng nhỏ đến hiệu điều trị đặc tính an tồn chế phẩm chứa meloxicam(1,2) Vì vậy, chuyên luận nguyên liệu thành phẩm meloxicam dược điển Việt Nam V dược điển tham chiếu (BP 2020, USP 43 EP 10.0) có quy định kiểm nghiệm tạp A C meloxicam(3-6) Tuy nhiên, danh mục chất chuẩn hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa có tạp chuẩn này(7,8) Mặt khác, tạp A tạp C chuẩn thương mại hóa với giá thành cao (khoảng 355 SGD/lọ 15 mg với tạp A 293 SGD/lọ 10 mg với tạp C) thường phải liên hệ trước nhiều tháng với nhà cung cấp mua nên gây khơng khó khăn cho cơng tác kiểm tra tạp chất nguyên liệu thành phẩm meloxicam(9,10) Vì tạp A nguyên liệu để điều chế thuốc thuộc dẫn xuất oxicam meloxicam, piroxicam… nên có nhiều cơng trình nghiên cứu tổng hợp tạp chất này(11-13) thương mại hóa dạng hóa chất Đối với tạp C, có 01 nghiên cứu có đề cập đến quy trình tổng hợp(2) Trong đó, Việt Nam chưa có tác giả cơng bố cơng trình điều chế tạp A C meloxicam Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, báo cơng bố quy trình điều chế thiết lập tạp chất đối chiếu A C meloxicam Đối tượng nghiên cứu 38 Tạp A tạp C meloxicam Nguyên vật liệu Chất chuẩn nguyên liệu Tạp A meloxicam EP-CRS, số lô: 2, hàm lượng 100,0% tính nguyên trạng, bảo quản ± 3oC, tránh ánh sáng đựng lọ kín Tạp C meloxicam EP-CRS, số lơ: 4, hàm lượng 100,0% tính nguyên trạng, bảo quản ± 3oC, tránh ánh sáng đựng lọ kín Ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazine-3carboxylat 1,1-dioxid nhà sản xuất SigmaAldrich, hàm lượng 97% tính nguyên trạng, số lô: MKCK0124, bảo quản tránh ánh sáng Nguyên liệu meloxicam sản xuất Ấn Độ, hàm lượng 99,51% tính ngun trạng, số lơ: TD/ML/016/03/16-17, bảo quản tránh ánh sáng Dung mơi, hóa chất Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng Acid phosphoric, aceton, cloroform, ethyl acetat, hexan, methanol, acid acetic băng, dimethyl sulfoxid (DMSO), ethanol, kali hydroxyd, methyl iodid, dimethylformamid (DMF) đạt tiêu chuẩn phân tích Thiết bị dụng cụ phân tích Các thiết bị phân tích hiệu chuẩn theo yêu cầu GLP ISO/IEC 17025, bao gồm: hệ thống LC/MS IT-TOF Shimadzu LCMS-8040, hệ thống HPLC-PDA Shimadzu CBM 20A, cân phân tích Mettler Tolendo XP62, máy đo pH Mettler Toledo B50146045, máy IR Shimadzu iS50FT-IR, máy NMR Bruker Advance III Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu xác dùng phân tích B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Phương pháp nghiên cứu Điều chế tạp A Tạp A điều chế phương pháp kết tinh ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazine-3carboxylat 1,1-dioxid ethanol Tổng hợp tinh chế tạp C Theo tài liệu tham khảo tạp C tổng hợp từ phản ứng methyl hóa meloxicam methyl iodid môi trường dimethyl sulfoxid với diện kali hydroxyd(2) Trong trình tổng hợp, tiến hành khảo sát Meloxicam Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thời gian phản ứng, tỷ lệ mol meloxicam kali hydroxyd, tỷ lệ mol meloxicam methyl iodid Sản phẩm tổng hợp kiểm tra phương pháp sắc ký lớp mỏng Chọn điều kiện phản ứng cho hiệu suất phản ứng cao sản phẩm tổng hợp kiểm tra sắc ký lớp mỏng cho vết Sản phẩm tổng hợp tinh chế phương pháp kết tinh dung mơi (Hình 1) Tạp C Hình Sơ đồ tổng hợp tạp C meloxicam Thử tinh khiết sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế thử tinh khiết sắc ký lớp mỏng (SKLM) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định cấu trúc Sản phẩm tinh chế xác định cấu trúc phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS NMR Xác định độ tinh khiết tạp A C HPLC-PDA Độ tinh khiết tạp A C xác định phương pháp HPLC với đầu dò PDA Điều kiện sắc ký: Cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm; µm), nhiệt độ cột 40oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl, tốc độ dịng ml/phút, bước sóng phát tạp A 313 nm tạp C 359 nm Pha động: acetonitril – dung dịch diamoni hydrophosphat 0,20% điều chỉnh đến pH 7,0 H3PO4 (40:60, tt/tt) Đánh giá tạp A C Tạp A C đánh giá theo tiêu tính chất, nhiệt độ nóng chảy, định tính, độ ẩm, định lượng tạp chất liên quan B - Khoa học Dược Thiết lập chất đối chiếu tạp A C Đánh giá độ đồng q trình đóng lọ Các mẫu lấy ngẫu nhiên theo cơng thức N +1 N tổng số lọ Việc xác định hàm lượng tạp A C lọ tiến hành theo phương pháp HPLC, lọ xác định lần Loại giá trị bất thường trắc nghiệm Dixon(14) Việc đánh giá độ đồng q trình đóng lọ dựa theo hướng dẫn ISO Guide 35(15) Đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm Tạp A C sau đóng gói đánh giá đồng lọ đạt yêu cầu lấy mẫu ngẫu nhiên tiến hành xác định hàm lượng ba phịng thí nghiệm độc lập Các phịng thí nghiệm lựa chọn để gửi mẫu phải đạt GLP ISO/IEC 17025 Mỗi phịng thí nghiệm nhận sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo quy trình phân tích tài liệu liên quan Trước phân tích, phịng thí nghiệm kiểm tra tính phù hợp hệ thống với yêu cầu hệ số bất đối pic tạp nằm khoảng 0,8 – 1,5 RSD lần đo lặp lại không 2% Nếu đạt yêu cầu, tiến hành xác định hàm 39 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 lượng tạp A C mẫu nhận, mẫu xác định lần Các phịng thí nghiệm lựa chọn để gửi mẫu Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu (PTN1), Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm (PTN2) Khoa Nghiên cứu phát triển (PTN3) thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Việc đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm tiến hành theo hướng dẫn ISO 13528(16), sử dụng phép phân tích phương sai yếu tố ANOVA carboxylat 1,1-dioxid 50 ml ethanol nhiệt độ sôi (khoảng 78oC) Sau để nguội đến nhiệt độ phịng làm lạnh, lọc thu tủa Sấy tủa 80oC đến chênh lệch khối lượng lần cân liên tiếp không 0,5 mg (khoảng giờ), thu 1,89540 g sản phẩm tinh chế A Thử tinh khiết sản phẩm tinh chế A Kết thử tinh khiết SKLM cho thấy sản phẩm tinh chế A cho vết hệ dung mơi có sức rửa giải khác Kết Xác định giá trị ấn định độ không đảm bảo đo: thử tinh khiết sản phẩm tinh chế A Việc xác định giá trị ấn định phiếu kiểm nghiệm tạp A, tạp C độ không đảm bảo đo thực theo hướng dẫn ISO 13528(16), dựa theo 18 kết xác định hàm lượng tạp A C phịng thí nghiệm phương pháp HPLC, áp dụng phương pháp quy 100% diện tích pic cho thấy sắc ký đồ chiều sắc ký đồ chiều bước sóng hấp thụ cực đại 313 nm xuất pic KẾT QUẢ nhất, pic đạt độ tinh khiết theo phổ Điều chế tạp A UV-Vis, sản phẩm tinh chế A có độ tinh khiết sắc Việc tinh chế tạp A thực phương pháp kết tinh lại với ethanol nóng sau: Hịa tan hồn tồn 2,18106 g ethyl 4hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3- ký 99% Hình hình minh họa (1) sắc ký đồ SKLM HPLC kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm tinh chế A (Hình 2) (2) (3) Hình Sắc ký đồ SKLM kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm tinh chế A Điều kiện sắc ký: Bản mỏng silica gel 60 F254 (10 x cm); Phát hiện: UV 254 nm; Hệ dung môi: (1) hexan – ethyl acetat (2:1), Rf = 0,36; (2) hexan – ethyl acetat (1:1), Rf = 0,52; (3) cloroform – methanol (9:1), Rf = 0,76 Dung dịch sản phẩm tinh chế A pha cloroform có nồng độ 0,1 mg/m 40 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu • (a) (b) Hình Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tinh chế A nồng độ 500 µg/ml pha acetonitril Điều kiện sắc ký: Cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm; µm); Tốc độ dịng: ml/ phút; Thể tích tiêm: 10 μl; Bước sóng phát hiện: 313 nm; Pha động: acetonitril nước, rửa giải gradient: 0’(1:99), 2’(1:99), 62’(99:1), 65’(99:1), 74’(1:99), 90’(1:99) (a): sắc ký đồ bước sóng 313 nm, (b): sắc ký đồ chiều Áp dụng phương pháp quy 100% diện tích pic để xác định độ tinh khiết sản phẩm tinh chế A: Trong đó: Ssp: diện tích pic sản phẩm tinh chế A ∑S: Tổng diện tích tất pic (trừ pic dung môi) B - Khoa học Dược Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế A Kết phổ UV-Vis cho thấy sản phẩm tinh chế A (được pha acetonitril) có bước sóng hấp thụ cực đại 313 nm tương đồng với phổ UV-Vis tạp A chuẩn Phổ IR sản phẩm tinh chế A có độ tương đồng 99,52% so với phổ IR tạp A chuẩn có đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức cấu tạo tạp A [max (cm-1)]: 1651 41 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Tổng hợp tinh chế tạp C 1605 (C=C), 1381 (O-H phenol), 1339 (O=S=O), 1170 (C-O) Phổ ESI-MS(-) sản phẩm tinh chế A có tín hiệu ion tựa phân tử [M-H]- với m/z = 282,0444, phù hợp với khối lượng phân tử tạp A meloxicam (C12H13NO5S, M = 283,3020) Như vậy, dựa vào phổ MS liệu phổ UV-Vis IR sản phẩm tinh chế A tương đồng với tạp A chuẩn nên kết luận sản phẩm tinh chế A ethyl 4hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazine-3carboxylat 1,1-dioxid (tạp A meloxicam) Bảng 1, Bảng khảo sát thời gian meloxicam kali meloxicam methyl ứng tổng hợp tạp C Bảng trình bày kết phản ứng, tỷ lệ mol hydroxyd, tỷ lệ mol iodid đến hiệu suất phản Bảng Kết khảo sát thời gian phản ứng Thời gian giờ Hiệu suất (%) - 12 24 giờ giờ - - 32,12 32,25 32,50 32,88 Bảng Kết khảo sát tỷ lệ mol meloxicam kali hydroxyd (thời gian phản ứng giờ) Tỷ lệ mol meloxicam 1:0 1:0,5 kali hydroxyd Hiệu suất (%) Hình Cơng thức cấu tạo tạp A meloxicam - - 1:1 1:2 1:3 1:4 32,40 32,21 32,35 32,15 Bảng Kết khảo sát tỷ lệ mol meloxicam methyl iodid (thời gian phản ứng giờ, tỷ lệ mol meloxicam kali hydroxyd 1:1) Tỷ lệ mol meloxicam methyl iodid Hiệu suất (%) 1,1 2,3 3,4 4,5 5,6 6,8 7,9 9,0 10,2 11,3 32,25 35,61 45,75 50,62 61,48 68,32 76,28 75,86 76,61 77,65 Với thời gian phản ứng từ đến giờ, kết kiểm tra sắc ký lớp mỏng cho thấy sắc ký đồ xuất vết chứng tỏ meloxicam chưa phản ứng hết Với thời gian phản ứng từ đến 24 giờ, sắc ký đồ xuất vết có giá trị Rf khác với vết meloxicam hiệu suất phản ứng gần tương đương nhau, cho thấy tủa sản phẩm gần tinh khiết sắc ký lớp mỏng hiệu suất phản ứng gần đạt tối đa Vậy thời gian phản ứng tổng hợp tạp C lựa chọn Khi không thêm kali hydroxyd hay tỷ lệ meloxicam kali hydroxyd 1:0, sản phẩm phản ứng xuất (thể vết mờ sắc ký đồ vết meloxicam) Với tỷ lệ mol từ 1:1 đến 1:4, sắc ký đồ xuất vết có giá trị Rf khác với vết meloxicam, hiệu suất phản ứng gần khơng thay đổi Vì vậy, tỷ lệ mol meloxicam kali hydroxyd lựa chọn 1:1 Hiệu suất phản ứng tăng phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ mol meloxicam methyl 42 iodid với kết kiểm tra sắc ký lớp mỏng xuất vết có giá trị Rf khác với vết meloxicam Hiệu suất phản ứng đạt cao thay đổi không đáng kể tỷ lệ mol meloxicam methyl iodid 1:7,9 Vì vậy, tỷ lệ lựa chọn Như vậy, quy trình tổng hợp tạp C sau: Hòa tan khoảng 0,5 g (1,42 mmol) meloxicam vào 5,0 ml DMSO, thêm 0,1 ml (1,43 mmol) dung dịch KOH (0,8 g/ml nước) Sau thêm 0,7 ml (11,25 mmol) dung dịch methyl iodid khuấy Trung hòa hỗn hợp sau phản ứng 2,5 ml acid acetic băng tiếp tục khuấy giờ, lọc lấy tủa, rửa tủa với ml ethanol, sấy tủa 80oC giờ, thu sản phẩm tổng hợp C Tiến hành tổng hợp lần theo quy trình thu khoảng 1,95 g sản phẩm với hiệu suất 75% Toàn sản phẩm tổng hợp tinh chế cách hòa tan vào 20 ml DMF nhiệt độ sôi (khoảng 153 oC), để nguội cho tủa tinh thể hình thành, lọc lấy tủa rửa tủa với 10 ml B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 ethanol Cho tủa vào 300 ml nước khuấy giờ, lọc áp suất giảm rửa tủa với 20 ml ethanol Sấy tủa 80 oC khoảng giờ, thu 1,75 g sản phẩm tinh chế C (hiệu suất tồn quy trình 67%) Thử tinh khiết sản phẩm tinh chế C Kết thử tinh khiết SKLM cho thấy sản phẩm tinh chế C cho vết hệ dung mơi có sức rửa giải khác Kết thử tinh khiết sản phẩm tinh chế C phương pháp HPLC, áp dụng phương pháp quy 100% diện tích pic cho thấy sắc ký đồ chiều sắc ký đồ chiều bước sóng hấp thụ cực đại 359 nm xuất pic nhất, pic đạt độ tinh khiết theo phổ UV-Vis, sản phẩm tinh chế C có độ tinh khiết sắc ký 99% Hình Hình minh họa sắc ký đồ SKLM HPLC kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm tinh chế C Áp dụng phương pháp quy 100% diện tích pic để xác định độ tinh khiết sản phẩm tinh chế C: Trong đó:Ssp: diện tích pic sản phẩm tinh chế C ∑S: Tổng diện tích tất pic (trừ pic dung môi) Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế C Kết phổ UV-Vis cho thấy sản phẩm tinh chế C (được pha acetonitril) có bước sóng hấp thụ cực đại 359 nm tương đồng với phổ UV-Vis tạp C chuẩn Phổ IR sản phẩm tinh chế C có độ tương đồng 97,48% so với phổ IR tạp C chuẩn có đỉnh đặc trưng phù hợp với công thức cấu tạo tạp C [max (cm-1)]: 1586 (C=O), 1401 (O-H phenol), 1335 (O=S=O), 1170 C-N) Phổ ESI-MS(-) sản phẩm tinh chế C có tín hiệu ion tựa phân tử [M-H] - với m/z = 364,0434, phù hợp với khối lượng phân tử tạp C meloxicam (C15H15N3O4S2, M = 365,0504) B - Khoa học Dược Nghiên cứu Phân tích liệu phổ NMR (Bảng Bảng 5) cho thấy số lượng vị trí proton carbon sản phẩm tinh chế C phù hợp với tạp C chuẩn Như vậy, sản phẩm tinh chế C có cơng thức cấu tạo N-[(2Z)-3,5-dimethylthiazol-2(3H)yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin3-carboxamid 1,1-dioxid (tạp C meloxicam) Các liệu phổ UV, IR, MS phù hợp với tạp C meloxicam, có cơng thức phân tử C15H15N3O4S2, khối lượng phân tử 365,43 Cấu trúc tạp C trình bày Hình Bảng Dữ liệu phổ 1H-NMR sản phẩm tinh chế C tạp C chuẩn 1H-NMR Vị trí (DMSO-d6, TMS, 400 MHz) δH (ppm) Sản phẩm tinh chế C 14,956 (s; 1H) 8,048 – 8,024 (m; 1H) Tạp C chuẩn OH 14,956 (s; 1H) H-5 8,049 – 8,025 (m; 1H) H-6 H-7 7,892 – 7,794 (m; 3H) 7,892 – 7,794 (m; 3H) H-8 H-4’ 7,432 (d; J = 1,36 Hz; 1H) 7,431 (d; J = 1,36 Hz; 1H) N3’-CH3 3,735 (s; 3H) 3,735 (s; 3H) N2-CH3 2,909 (s; 3H) 2,909 (s; 3H) C5’-CH3 2,322 (d; J = 1,32 Hz; 3H) 2,322 (d; J = 1,32 Hz; 3H) Bảng Dữ liệu phổ 13C-NMR sản phẩm tinh chế C tạp C chuẩn Vị trí C-4 C-9 C-2’ C-8a C-6 C-7 C-4a C-5 C-4’ C-8 C-5’ C-3 N2-CH3 N3’-CH3 C5’-CH3 (DMSO-d6, TMS, 100 MHz) δC (ppm) Sản phẩm tinh chế C Tạp C chuẩn 168,82 168,78 163,85 163,85 155,21 155,21 134,26 134,26 132,83 132,83 132,04 132,04 129,00 129,00 125,90 125,90 125,66 125,66 123,07 123,06 122,15 122,16 115,06 115,06 37,56 37,56 35,85 35,85 11,80 11,80 13C-NMR 43 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 (1) (2) (3) Hình Sắc ký đồ SKLM kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm tinh chế C Điều kiện sắc ký: Bản mỏng silica gel 60 F254 (12 x cm); Phát hiện: UV 254 nm; Hệ dung môi: (1) cloroform 100%, R f = 0,15; (2) cloroform – methanol (49:1), Rf = 0,55; (3) Cloroform – ethanol (1:1), Rf = 0,74 Dung dịch sản phẩm tinh chế C pha cloroform có nồng độ 0,1 mg/ml (a) (b) Hình Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tinh chế C nồng độ 250 μg/ml pha acetonitril Điều kiện sắc ký: Cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm; µm); Tốc độ dịng: ml/ phút; Thể tích tiêm: 10 μl; Bước sóng phát hiện: 359 nm; Pha động: acetonitril nước, rửa giải gradient: 0’(1:99), 2’(1:99), 62’(99:1), 65’(99:1), 74’(1:99), 90’(1:99) (a): sắc ký đồ bước sóng 359 nm, (b): sắc ký đồ chiều 44 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Xác định độ tinh khiết tạp A C HPLCPDA Hình Cơng thức cấu tạo tạp C meloxicam Quy trình xác định độ tinh khiết tạp A tap C HPLC-PDA thẩm định theo ICH(17), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác, độ Kết thẩm định thể Bảng Bảng Hình minh họa sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu Bảng Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp (n = 6) Mẫu Chuẩn tạp A Thử tạp A Chuẩn tạp C Thử tạp C Giá trị thống kê Trung bình RSD Trung bình RSD Trung bình RSD Trung bình RSD tR (phút) 4,534 0,06% 4,536 0,04% 8,259 0,14% 8,271 0,10% S (µV*giây) 6026145 0,08% 6029464 0,07% 6849242 0,07% 6849824 0,08% Nbk 3245 0,21% 3228 0,40% 4615 0,80% 4641 0,55% As 1,10 0,05% 1,10 0,07% 1,23 0,04% 1,24 0,12% Giá trị RSD (Relative Standard Deviation) thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) tất mẫu nhỏ 2%, hệ số bất đối (As) pic tạp A pic tạp C nằm khoảng 0,8 - 1,5 Như quy trình định lượng tạp A tạp C đạt tính phù hợp hệ thống Pic tạp A pic tạp C tinh khiết theo phổ Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính, độ UV-Vis Như quy trình định lượng tạp A xác độ tạp C có tính đặc hiệu Tạp A Tạp C Phương trình hồi quy ŷ = 15198,51x - ŷ = 15198,51x 53179,80 + 251940,60 Khoảng tuyến tính (µg/ml) 300 - 500 150 – 250 Hệ số tương quan (R) 0,9999 0,9999 Độ xác (RSD, n=12) 0,08% 0,15% 99,56% 99,33% Tỷ lệ phục hồi 100,38% 101,19% Hàm lượng* 99,91% 99,88% Được xác định từ kết khảo sát độ xác * Kết khảo sát tính đặc hiệu cho thấy điều kiện phân tích: sắc ký đồ mẫu trắng khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng với pic sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn, pic tạp A pic tạp C tách hoàn toàn pic meloxciam Sắc ký đồ mẫu thử mẫu phân hủy xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu tạp A/tạp C sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu phân hủy có xuất pic phân hủy, pic tách hoàn toàn với pic tạp A/tạp C B - Khoa học Dược Giá trị R > 0,999 nên có tương quan tuyến tính nồng độ tạp A/tạp C diện tích pic Sử dụng trắc nghiệm F cho thấy phương trình hồi quy có tính tương thích, sử dụng trắc nghiệm t cho thấy hệ số B Bo có ý nghĩa Giá trị RSD hàm lượng phần trăm tạp A tạp C xác định từ 12 mẫu ngày nhỏ 2,0% nên quy trình định lượng tạp A tạp C đạt độ xác Tỷ lệ phục hồi tạp A tạp C mức nồng độ 75%, 100% 125% nồng độ định lượng nằm khoảng 98% đến 102% với giá trị RSD không 2% nên quy trình định lượng tạp A tạp C đạt độ Như vậy, quy trình định lượng tạp A tạp C phương pháp HPLC-PDA có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, đạt độ xác độ Hàm lượng phần trăm tạp A tạp C 99,91% 99,88% tính nguyên trạng 45 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 (a) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (b) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) Hình Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu tạp A (a) tạp C (b) (1) Mẫu trắng; (2) Hỗn hợp chuẩn; (3) Hỗn hợp thử; (4) Mẫu chuẩn tạp A C; (5) Mẫu thử tạp A C; Các mẫu phân hủy tạp A C: (6) HCl 0,1 N/24 giờ, (7) NaOH 0,1 N/24 giờ, (8) H2O2 3%/24 giờ, (9) chiếu ánh sáng mặt trời/8 giờ, (10) sấy 120oC/24 (11) chiếu UV 254 nm/8 46 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Nghiên cứu Đánh giá tạp A C Bảng 10 minh họa kết đánh giá độ đồng Bảng trình bày kết đánh giá tạp A C Với độ tinh khiết 99% nên tạp A C đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu trình đóng lọ độ đồng lọ liên Thiết lập chất đối chiếu tạp A C đồng nhất, điều kiện đóng gói ổn định phù phịng thí nghiệm Dựa vào kết phân tích ANOVA cho thấy lọ đóng gói có hàm lượng Tạp A (1,16 g) tạp C (1,15 g) tạp hợp, kết định lượng phịng thí nghiệm đóng 76 lọ/15 mg 10 lọ lấy ngẫu nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, quy trình kiểm tra độ đồng Kết xác định tính phù phân tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết chất hợp hệ thống ba phịng thí nghiệm phân tích khơng phụ thuộc vào phịng thí nghiệm đạt yêu cầu hệ số bất đối pic tạp A, pic tạp tham gia đánh giá Giá trị ấn định tạp A C C RSD diện tích pic tạp A C nên tiếp xác định từ 18 kết ba phịng thí tục tiến hành xác định độ tinh khiết Bảng Bảng Kết đánh giá tạp A tạp C nghiệm tham gia đánh giá (Bảng 11) Chỉ tiêu Mức chất lượng Tạp A Tạp C Bột màu trắng Bột màu vàng nhạt Phương pháp Cảm quan Tính chất Dễ tan methanol, acetonitril, cloroform; tan ethanol Độ tan Kết Tạp A Tạp C Tan acetonitril; tan DMF; khó tan DMSO max (cm-1) 1651, 1605 (C=C), max (cm-1) 1586 (C=O), 1335 1453 (C-H), 1339 (O=S=O), 1270 (O=S=O), 1177 (C-N) (C-N) Đạt Đạt Đúng Đúng Định tính Phổ hồng ngoại Điểm chảy DSC Độ ẩm Tạp chất liên quan Karl-Fischer ≤ 0,5% Đạt Đạt (142,2oC) (294,9oC) Đạt (0,10%) Đạt (0,21%) HPLC ≤ 1,0% Đạt (0,10%) Đạt (0,09%) Định lượng HPLC ≥ 99,0% tính nguyên trạng 142 ± oC 295 ± oC Đạt (99,91%) Đạt (99,88%) Bảng Kết phân tích ANOVA đánh giá độ đồng q trình đóng lọ (n=2) Tổng bình phương 0,03680 0,03360 0,07040 0,04641 0,02865 0,07506 Nguồn sai số Tạp A Tạp C Giữa lọ Trong lọ Tổng cộng Giữa lọ Trong lọ Tổng cộng Bậc tự 10 19 10 19 Bình phương trung bình 0,00409 0,00336 0,00516 0,00287 Ftn Fc 1,21693 3,02038 1,79969 3,02038 Nhận xét Ftn < Fc Các lọ trình đóng đồng Bảng 10 Kết đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm Mẫu Trung bình PTN1 99,85% 99,93% 100,02% 99,87% 99,86% 100,01% 99,92% B - Khoa học Dược Hàm lượng tạp A PTN2 99,90% 99,96% 99,82% 100,01% 100,00% 99,95% 99,94% PTN3 99,84% 100,01% 99,83% 99,87% 99,89% 99,87% 99,89% PTN1 99,97% 99,95% 99,81% 99,76% 99,93% 99,91% 99,89% Hàm lượng tạp C PTN2 100,02% 99,83% 99,90% 100,01% 99,94% 99,77% 99,91% PTN3 99,96% 99,96% 99,86% 99,78% 99,82% 100,01% 99,90% 47 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 Bảng 11 Kết xác định giá trị ấn định (n=18) HL (%) x*-δ x*+δ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 x* s* δ 99,82 99,83 99,84 99,85 99,86 99,87 99,87 99,87 99,89 99,90 99,93 99,95 99,96 100,00 100,01 100,01 100,01 100,02 99,90 0,082 0,122 CK1 xi*1 99,77 100,02 99,82 99,83 99,84 99,85 99,86 99,87 99,87 99,87 99,89 99,90 99,93 99,95 99,96 100,00 100,01 100,01 100,01 100,02 99,92 0,080 0,120 Tạp A CK2 xi*2 99,80 100,04 99,82 99,83 99,84 99,85 99,86 99,87 99,87 99,87 99,89 99,90 99,93 99,95 99,96 100,00 100,01 100,01 100,01 100,02 99,92 0,080 0,120 CK3 xi*3 99,80 100,04 99,82 99,83 99,84 99,85 99,86 99,87 99,87 99,87 99,89 99,90 99,93 99,95 99,96 100,00 100,01 100,01 100,01 100,02 99,92 0,080 0,120 |Z| GTAĐ 1,20 1,08 0,95 0,83 0,70 0,58 0,58 0,58 0,33 0,20 0,18 0,43 0,55 1,05 1,18 1,18 1,18 1,30 99,82 99,83 99,84 99,85 99,86 99,87 99,87 99,87 99,89 99,90 99,93 99,95 99,96 100,00 100,01 100,01 100,01 100,02 99,92 0,080 CK1 HL (%) xi*1 99,75 100,09 99,76 99,76 99,77 99,77 99,78 99,78 99,81 99,81 99,82 99,82 99,83 99,83 99,86 99,86 99,90 99,90 99,91 99,91 99,93 99,93 99,94 99,94 99,95 99,95 99,96 99,96 99,96 99,96 99,97 99,97 100,01 100,01 100,01 100,01 100,02 100,02 99,92 99,90 0,111 0,098 0,167 0,147 Tạp C CK2 CK3 xi*2 xi*3 99,75 99,75 100,05 100,05 99,76 99,76 99,77 99,77 99,78 99,78 99,81 99,81 99,82 99,82 99,83 99,83 99,86 99,86 99,90 99,90 99,91 99,91 99,93 99,93 99,94 99,94 99,95 99,95 99,96 99,96 99,96 99,96 99,97 99,97 100,01 100,01 100,01 100,01 100,02 100,02 99,90 99,90 0,098 0,098 0,147 0,147 |Z| GTAĐ 1,42 1,32 1,22 0,91 0,81 0,71 0,40 0,01 0,11 0,31 0,41 0,51 0,62 0,62 0,72 1,12 1,12 1,23 99,76 99,77 99,78 99,81 99,82 99,83 99,86 99,90 99,91 99,93 99,94 99,95 99,96 99,96 99,97 100,01 100,01 100,02 99,90 0,098 *HL: Hàm lượng; CK: Chu kỳ; GTAĐ: Giá trị ấn định Sau lần thay đổi, s*(tạp A) = 0,080 s*(tạp C) = 0,098 khơng thay đổi, giá trị x*(tạp A) chọn 99,92% x*(tạp C) chọn 99,90% Từ kết tính Z-score, kết 18/18 giá trị tạp có |Z| < 2,0 Từ đó, giá trị ấn định tạp A 99,92% với độ không đảm bảo đo: giá trị ấn định tạp C 99,90% với độ không đảm bảo đo: Như vậy, tạp A tạp C đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng xác định là 99,92% 99,90% tính nguyên trạng Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn kèm theo phiếu kiểm nghiệm Bảo quản lọ chuẩn nhiệt độ 2-8oC, tránh ánh sáng BÀNLUẬN Ethanol dung môi lựa chọn để tinh chế tạp A tạp A tan ethanol nhiệt độ thường lại tan tốt ethanol 48 nhiệt độ cao Ngoài ra, ethanol dễ bay hơi, nhiệt độ sôi khoảng 80oC thấp nhiều so với nhiệt độ nóng chảy tạp A (khoảng 142 oC) Điều tạo thuận lợi cho việc hạn chế tạp A bị biến đổi cấu trúc trình tinh chế trình sấy Sử dụng ethanol tinh chế tạp A có ưu điểm sau: ethanol độc người thí nghiệm môi trường; thời gian chờ kết tinh ngắn (khoảng giờ); hiệu suất kết tinh cao (khoảng 87%); tinh thể tạo lớn đồng (tinh thể hình kim dài khoảng cm điều kiện thử nghiệm); tính chất, cấu trúc tạp A không bị thay đổi sau trình tinh chế; độ tinh khiết sản phẩm kết tinh cao (trên 99%) Do việc điều chế trải qua giai đoạn kết tinh nhiệt độ không cao từ hóa chất ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3carboxylat 1,1-dioxid có độ tinh khiết 97%, gây ảnh hưởng đến việc thay đổi cấu trúc, nên sản phẩm tinh chế A định danh dựa việc so sánh liệu phổ UV-Vis, IR MS sản phẩm tinh chế tạp A chuẩn đo B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 điều kiện Kết cho thấy phổ UV-Vis phổ IR sản phẩm tương đồng với phổ UVVis phổ IR tạp A chuẩn, phổ ESI-MS(-) sản phẩm có ion tựa phân tử [M-H]- với m/z = 282,0444, sai lệch 0,71 ppm với m/z lý thuyết ion [M-H]- tạp A Như vậy, sản phẩm tinh chế A tạp A meloxicam Meloxicam Nghiên cứu Phản ứng tổng hợp tạp C diễn theo chế nhân SN2 môi trường dung môi hữu aprotic DMSO Tác nhân nhân nguyên tử nitrogen có đơi điện tử tự phân tử meloxicam Trong môi trường kiềm, sản phẩm trung gian chuyển vị nối đôi để tạo thành tạp C Cơ chế phản ứng mơ tả Hình Tạp C Hình Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp C meloxicam tăng số lượng phân tử methyl iodid (tăng tỷ Trong trình tổng hợp tạp C, số đặc lệ mol methyl iodid so với meloxicam), khả điểm phản ứng tổng hợp ghi nhận tiếp xúc với trung tâm phản ứng tăng sau: cải thiện hiệu suất phản ứng Khi thêm nước vào dung dịch DMSO sau phản ứng (lặp lại thí nghiệm theo tài liệu tham khảo(2)) thu nhiều tủa làm tăng hiệu suất, tủa ngồi tạp C cịn có sản phẩm khác (thể nhiều vết sắc ký mỏng) dẫn đến giảm hiệu suất kết tinh Nếu thay nước acid acetic băng tủa thu tạp C (thể vết sắc ký mỏng), tạp C khó tan acetic băng thành phần khác tan hỗn hợp DMSO - acetic băng Vì vậy, quy trình tổng hợp theo tài liệu tham khảo có hiệu suất thấp phản ứng tổng hợp chưa tối ưu, dẫn đến hiệu suất tồn quy trình (hiệu suất tổng hợp tinh chế) thấp Trong nghiên cứu này, tạp C tổng hợp tạp theo tài liệu tham khảo(2) thay nước acetic băng Vì phản ứng tổng hợp tạp C diễn theo chế SN2 với tác nhân nucleophin phân tử meloxicam với cấu trúc lớn cồng kềnh nên trung tâm phản ứng ngun tử nitrogen vịng thiazol khó tiếp cận phân tử methyl iodid dẫn đến hiệu suất phản ứng thấp Do đó, B - Khoa học Dược Khi hòa tan meloxicam vào DMSO cho thêm KOH, meloxicam hịa tan nhanh so với khơng thêm KOH, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang vàng cam Điều giải thích môi trường kiềm, phần meloxicam chuyển sang dạng anion dễ tan DMSO Ngồi ra, KOH cịn có vai trị trung hịa HI sinh sau phản ứng, làm tăng tốc độ phản ứng Khi thực phản ứng tổng hợp tạp C dung môi khác nhau, có khác biệt sản phẩm tạo thành dung môi aprotic protic Với dung môi aprotic DMSO, DMF, acetonitril, aceton, diethy ether ethyl acetat, tủa thu có nhiều vết sắc ký mỏng, có vết có giá trị Rf tương đương với tạp C chuẩn Với dung môi protic methanol, ethanol propanol, tủa thu khơng có vết sắc ký có giá trị Rf tương đương với tạp C chuẩn Điều chứng minh dung môi có vai trị quan trọng việc định hướng vị trí gắn nhóm methyl vào phân tử 49 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 meloxicam Dung môi DMSO lựa chọn có khả hịa tan meloxicam cao so với dung môi aprotic khác (trong điều kiện thí nghiệm, độ tan meloxicam DMSO khoảng 0,12 g/ml, dung môi khác, độ tan meloxicam khoảng 0,002 – 0,050 g/ml) lượng tạp A tạp C lựa chọn hoàn toàn phù hợp với mục tiêu xác định hàm lượng tạp thể qua việc đáp ứng tiêu thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, miền giá trị, độ xác độ Tạp C khó tan DMSO, tan DMF nhiệt độ thường tan tốt nhiệt độ cao DMSO (khoảng 189oC), DMF (khoảng 153oC) Việc sử dụng DMSO DMF cho hiệu suất kết tinh chất lượng sản phẩm gần tương đương Tuy nhiên, nhiệt độ hòa tan DMF thấp DMSO khả hòa tan DMF cao DMSO nên kết tinh DMF lựa chọn nhằm hạn chế việc biến đổi cấu trúc sản phẩm nhiệt độ tiết kiệm dung môi Qua trình thử nghiệm, tạp C tinh chế phương pháp kết tinh dung môi DMF đem lại hiệu suất tinh chế cao (khoảng 86%) đồng thời cho sản phẩm tinh chế có độ tinh khiết sắc ký phù hợp với yêu cầu dùng làm chất đối chiếu (trên 99%) Cho đến nay, danh mục phân phối chất chuẩn đối chiếu Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh chưa có tạp A chuẩn tạp C chuẩn Vì sở sản xuất thuốc quan kiểm nghiệm thuốc muốn kiểm tra tiêu tạp chất liên quan meloxicam phải đặt mua tạp chuẩn nước với giá thành cao nhiều thời gian Kết đánh giá thiết lập chất đối chiếu tạp A tạp C meloxicam thực theo hướng dẫn WHO xử lý thống kê theo ISO 13528 cho hàm lượng 99% tính nguyên trạng, phù hợp với yêu cầu đăng ký chuẩn gốc Sản phẩm đề tài 38 lọ 15 mg cho tạp đánh giá độ đồng trình đóng lọ, độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm, xác định giá trị ấn định giá trị công bố dựa kết phịng thí nghiệm đạt GLP-WHO Kết xác định cấu trúc cho thấy phổ UV-Vis phổ IR sản phẩm tinh chế C tương đồng với phổ UV-Vis phổ IR tạp C chuẩn, phổ MS sản phẩm có ion tựa phân tử [M-H]- với m/z = 364,0434, sai lệch 0,82 ppm với m/z lý thuyết ion [M-H]- tạp C Đồng thời, phổ 1H-NMR 13C-NMR sản phẩm có đỉnh có độ dịch chuyển hóa học tương đương với tạp C chuẩn Phổ NOESY cho thấy hydro C(4’) vòng thiazol đỉnh 7,43 ppm không tương tác với hydro nhóm CH3 gắn với C(5’) vịng thiazol đỉnh 2,32 ppm mà tương tác với đỉnh 3,74 ppm tương ứng với hydro nhóm CH3 gắn với N(3’) Điều chứng minh phản ứng tổng hợp gắn nhóm CH3 vào phân tử N(3’), khẳng định sản phẩm tinh chế C có cấu trúc với tạp C meloxicam Quy trình xác định độ tinh khiết tạp A C phương pháp HPLC sử dụng cột C18 (150 x 4,6 mm; µm) phổ biến nên áp dụng rộng rãi phịng thí nghiệm Các kết thử nghiệm chứng minh quy trình định 50 KẾT LUẬN Tạp A tạp C meloxicam điều chế tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng kiểm tra tạp chất liên quan meloxicam Quy trình tinh chế tạp A có hiệu suất 86,90%, khối lượng sản phẩm 1,90 g hàm lượng 99% tính nguyên trạng Quy trình tổng hợp tinh chế tạp C có hiệu suất trung bình tồn quy trình 67,28%, khối lượng sản phẩm 1,75 g hàm lượng 99% tính nguyên trạng Cả tạp đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia TÀI LIỆU THAM KHẢO Vigano E, Landonio E (2010) Process for the purification of meloxicam Patent US7671197B2 Tibor M, Norbert M, Tibor B, et al (2009) Manufacture of highpurity meloxicam via its novel potassium salt monohydrate Organic Process Research & Development, 13:1-6 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 26 * Số * 2022 10 Bộ Y Tế (2017) Dược điển Việt Nam V pp.419-421, 615-617 Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội Bristish Pharmacopoeia Online (2020) Monograph meloxicam, meloxicam tablets URL: https://www.pharmacopoeia.com/ (07/02/2022) The United States Pharmacopeia (2020) United States Pharmacopeia 43-NF 38 Monographs meloxicam meloxicam tablets, pp 2767-2773 The United States Pharmacopeial Convention, USA European Pharmacopoeia 10.0 (2019) Monograph meloxicam, pp 3193-3194 Council of Europe, Europe Danh mục chất chuẩn đối chiếu Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh URL: https://www.idqchcm.gov.vn/dich-vu/cac-danh-muc-chat-doi-chieu/chat-chuandoi-chieu.html (access on 10/02/2022) Danh mục chất chuẩn đối chiếu Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương URL: https://nidqc.gov.vn/tim-kiem-chatchuan?key=&dm=19 (access on 10/02/2022) Sigma-Aldrich Meloxicam impurity A URL: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/y0001035? lang=en®ion=VN (access on 10/02/2022) Sigma-Aldrich Meloxicam impurity C URL: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/y0001037? lang=en®ion=VN (access on 10/02/2022) B - Khoa học Dược Nghiên cứu 11 12 13 14 15 16 17 Moustafa G (2017) An overview of the synthetic routes of 2alkyl-4-hydroxy-2h-1, 2-benzothiazine-3-carboxamides -1, 1dioxides (oxicams) and their analogues Synthetic Communications, 47:1527-1558 Michel P, Marie L, Didier J, Yves R (2015) Derivatives of benzothiazines, preparation thereof and application thereof as drugs Patent US9187438B2 Slobodan S, Nebojsa S, Snezana M, Dejan N (2001) Process for synthesis of 4-hydroxy-2h-1,2-benzothiazine-3-carboxamides Patent WO2001040208A2 TCVN 4548:2009 (2009) Thống kê ứng dụng – loại bỏ giá trị bất thường, pp.8-12 ISO Guide 35:2006 (2006) Reference materials – General and statistical principles for certification, pp 48 ISO 13528:2005 (2005) Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons, pp 66 ICH (2005) Harmonized tripartite guideline, validation of analytical procedures: test and methodology, pp 1-13 Ngày nhận báo: 10/02/2022 Ngày phản biện nhận xét báo: 27/02/2022 Ngày báo đăng: 07/04/2022 51 ... nghiệm chứng minh quy trình định 50 KẾT LUẬN Tạp A tạp C meloxicam điều chế tiêu chuẩn h? ?a để làm chất đối chiếu sử dụng kiểm tra tạp chất liên quan meloxicam Quy trình tinh chế tạp A c? ? hiệu... quy trình điều chế thiết lập tạp chất đối chiếu A C meloxicam Đối tượng nghiên c? ??u 38 Tạp A tạp C meloxicam Nguyên vật liệu Chất chuẩn nguyên liệu Tạp A meloxicam EP-CRS, số lô: 2, hàm lượng... https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/y0001035? lang=en®ion=VN (access on 10/02/2022) Sigma-Aldrich Meloxicam impurity C URL: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/y0001037? lang=en®ion=VN