Microsoft Word 00 a loinoidau TV (moi thang1 2016) docx 94 Lê Thị Phượng KHUẾCH ĐẠI ĐẶC HIỆU VÙNG GEN ITS2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƯƠNG SPECI[.]
94 Lê Thị Phượng KHUẾCH ĐẠI ĐẶC HIỆU VÙNG GEN ITS2 XÁC ĐỊNH SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƯƠNG SPECIFIC AMPLIFICATION OF THE ITS2 REGION FOR FUNGAL DETECTION IN GASTRIC PATIENTS AT HAI DUONG PROVINCIAL GENERAL HOSPITAL Lê Thị Phượng Trường Đại học Hải Dương; Phuongsinh@ymail.com Tóm tắt - 180 bệnh nhân viêm dày đến khám điều trị tự nguyện bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương đáp ứng tiêu chuẩn nghiên cứu Các bệnh nhân thu thập thông tin như: tuổi, giới tính, nơi ở, cơng việc, số lần điều trị, đau thượng vị, đầy bụng, khó tiêu, chán ăn sụt cân sinh thiết mẫu vị trí hang vị, thân vị rìa ổ loét tổ chức thâm nhiễm nghi ung thư dày Tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm, khếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 phân tích trình tự gen, đồng thời ni cấy sinh thiết môi trường máu để xác định có mặt loại nấm dày người bệnh Kết cho thấy, tỷ lệ nhiễm nấm 70/180, chiếm 38,9% Abstract - 180 gastric patients who met the standards of the study, voluntarily came to Hai Duong Provincial General Hospital for examination and treatment Information about patients such as age, gender, residence, occupation, numbers of treatment, epigastric pain, bloating, indigestion, poor appetite and weight loss was collected These patients were taken for endoscopy to have endoscopic biopsy samples at the antrum, body and edge of the gastric ulcer, organizations suspected of infiltrating stomach cancer DNA was extracted from samples, specific amplification of the ITS2 region and gene sequence analysis Simultaneously, blood and biopsy cultures were used to detect the presence of fungi in patients’ stomach The results have showed that fungal infection rate account for 38.9% (70/180) Từ khóa - bội nhiễm nấm; gen ITS2; khuếch đại; nuôi cấy; viêm dày Key words - fungal super-infection; ITS2 gen; amplification; culture; gastritis Đặt vấn đề Trong năm gần đây, công tác điều trị bệnh dày kèm nhiễm Helicobacter pylori (H.pylori) Việt Nam có tiến nhờ sử dụng kết hợp loại kháng sinh chất giảm tiết axit Tuy thời điểm tại, tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, bệnh nhân phải điều trị nhiều lần với phác đồ điều trị khác nhau, tốn tiền bạc nhiều thời gian điều trị Helicobacter pylori trở nên kháng thuốc kèm tượng bội nhiễm loại vi sinh vật khác nấm vi khuẩn non-H.pylori Nhiễm vi sinh vật dày tạo nguy cho sức khỏe người, rõ ung thư dày, nhiễm trùng xâm lấn nấm dẫn tới nhiễm nấm máu, gây tử vong tàn phế Trong y văn giới, tượng dự đoán nhiều năm trước Zboril V Corea gọi phát triển vượt trội vi sinh vật dày, bao gồm C albicans, C tropical C parapsilosis, C glabrata C krusei [7] Ở Việt Nam, tượng nhiễm vi sinh vật dày bắt đầu nghiên cứu từ năm 2000 Nấm Candida tìm thấy đáy ổ loét dày bệnh nhân Việt nam Tạ Long Trịnh Tiến Dũng [5] Các nghiên cứu hợp tác với nhà khoa học Trường Đại học Tổng hợp New York xác nhận có mặt nhiều vi khuẩn non-H.pylori dày người bệnh gây chảy máu dày [8] ITS2 coi thị phân tử để xác định tình trạng nhiễm nấm dày người bệnh [3] Hiện nay, tất đơn vị Bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh tuyến huyện Hải Dương, nghiên cứu bội nhiễm nấm dựa công nghệ gen chưa tiến hành Nghiên cứu nhằm mục đích: Thiết lập phương pháp khuếch đại PCR đặc hiệu vùng gen ITS2 để xác định có mặt nấm mẫu bệnh phẩm dày Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng 180 bệnh nhân viêm dày khám, điều trị tự nguyện Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương đáp ứng tiêu chuẩn: i) Tuổi từ 18- 80; ii) Bị viêm dày mạn tính, loét ung thư dày; iii) Không dùng kháng sinh thời gian 01 tháng nội soi 2.2 Phương pháp Lấy mẫu bảo quản mẫu Mẫu bệnh phẩm lấy tự nguyện người bệnh gia đình bệnh nhân Trước lấy mẫu bác sĩ có giải thích cho bệnh nhân gia đình bệnh nhân cần thiết phải tiến hành thí nghiệm Các kết nghiên cứu công bố không ghi rõ họ tên người bệnh gia đình bệnh nhân Bệnh nhân tự nguyện tham gia làm xét nghiệm rút khỏi chương trình nghiên cứu lúc cần thiết 180 bệnh nhân tiến hành vấn yếu tố dịch tễ, sau nội soi, chụp ảnh xác định thể bệnh viêm mạn, loét, ung thư dày Vị trí sinh thiết dày gồm hang vị, thân vị, rìa ổ loét, tổ chức thâm nhiễm nghi ung thư Mỗi bệnh nhân lấy mảnh niêm mạc dày: mảnh hang vị mảnh thân vị Mảnh sinh thiết cần phải có kích thước - mm, mô sống, tổ chức hoại tử, khơng dính máu khơng dính mật Thủ thuật nội soi thực bác sĩ Khoa Thăm dò chức Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương Mẫu sinh thiết lưu trữ bình nitơ lỏng, sau bảo quản -700 C tách chiết DNA Tách chiết DNA từ bệnh phẩm 180 mẫu bệnh phẩm tách chiết DNA qua bước: phân hủy Proteinase K; loại protein mỡ ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(108).2016, Quyển Phenol/chloroform/isoamylalcohol; tủa DNA cồn nồng độ cao isopropanol Mẫu DNA đánh giá chất lượng hàm lượng tách chiết điện di gel agarose, nhuộm EtBr, quan sát chụp ảnh ánh sáng tử ngoại; độ tinh đánh giá đo phổ hấp thụ bước sóng 260/280 nm DNA hịa 100-200µl 1x TE Nồng độ độ tinh chế phẩm DNA kiểm tra thiết bị đo quang phổ hai bước sóng 260nm 280nm máy NanoDrop1000, Thermo Scientific Phản ứng PCR khuếch đại gen ITS2 xác định mức độ nhiễm nấm 1-10 ng ADN sử dụng để khuếch đại vùng ITS2 có kích thước khoảng 350bp phương pháp PCR thể tích phản ứng 20µl với cặp mồi: ITS3 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’; ITS4 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl DNA khuôn; 2,5 µl cặp mồi (ITS3-ITS4); 2,5 µl dNTP; 2,5 µl đệm PCR10x; 1,0 µl DNA polymerase (1 U/µl); 9,0 µl nước cất PCR Các thành phần phản ứng PCR trộn nhẹ nhàng ống Eppendorf thực phản ứng với chu trình nhiệt sau: phút hot-start; 35 chu kỳ (94°C 60 giây, 58°C 45 giây, 72°C 60 giây); 72°C phút; hạ nhiệt độ phản ứng PCR xuống 14°C đến lấy mẫu Sau phản ứng kết thúc, lấy 5µl sản phẩm PCR trộn với 1µl đệm tra mẫu (loading buffer), hỗn hợp nhỏ vào giếng gel Tiến hành điện di mẫu DNA với mẫu đối chứng dương thang DNA chuẩn để ước lượng kích thước phân tử DNA Các băng DNA hình dạng vệt sáng gel điện di So sánh kích thước ước đốn mẫu nghiên cứu với mẫu chứng dương marker phân tử để xác định có mặt gen ITS2 Đọc trình tự đoạn ITS2 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen ITS2 đặc hiệu làm QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, USA) gửi đọc trình tự gen trực tiếp từ sản phẩm PCR máy đọc giải trình tự ABI 3730XL (Macrogen, Korea) Kết đọc trình tự xử lý, chỉnh so sánh với trình tự gen có ngân hàng gen phần mềm BioEdit 7.1.3; trình tự gen thu được dóng hàng cột ứng dụng BLAST ngân hàng liệu NCBI Kết thảo luận 3.1 Tách chiết xác định nồng độ DNA bệnh phẩm Tách chiết DNA từ 180 mẫu mô bệnh phẩm bệnh nhân viêm dày Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương Sau tách chiết, tiến hành kiểm tra nồng độ độ tinh DNA phương pháp đo mật độ quang điện di gel agarose 1,5% Kết thể Hình DNA tách chiết theo quy trình phenol/chloroform để phân tích trình tự gen 16S rRNA Hình ảnh điện di cho thấy băng giếng gọn, đẹp có kích thước phân tử lớn 10 kb chứng tỏ DNA tách chiết có độ 95 tinh cao, bị đứt gãy sử dụng cho thí nghiệm Hình Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm Giếng 1-16: Các mẫu tách chiết DNA; Giếng 17: Thang DNA chuẩn kb 3.2 Phân tích trình tự gen ITS2 phát nấm mẫu nghiên cứu Sau hàng loạt thử nghiệm tối ưu hoá cách thay đổi nhiệt độ gắn mồi (Ta) mồi với DNA khuôn mẫu, nhiệt độ gắn mồi tối ưu phản ứng PCR khuếch đại đặc hiệu đoạn gen ITS2 chọn 58oC Hệ vi sinh vật dày người (động vật) hệ lụy chúng gây nên người phức tạp hình dung Theo Zboril, thơng thường loại vi sinh vật kị khí khơng có dày người khỏe mạnh [7] Năm 2001, giáo sư người Nga Bondarenko nuôi cấy vi khuẩn điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dày nhận diện loài vi sinh vật thuộc 32 chi Helicobacter pylori, nấm Candida, Bacteroides, Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium [2] Ngoài việc nhiễm loại vi khuẩn, việc nhiễm nấm bệnh viêm dày vấn đề quan tâm, ảnh hưởng đến kết điều trị [4] Các loại nấm nhiễm tìm thấy bệnh nhân viêm dày là: Ascomycete sp., Engyodontium album,…[1] Tình trạng nhiễm loại nấm phát phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen ITS2 kích thước khoảng 350 bp, kết hợp đọc phân tích trình tự gen (Hình 2) Hình Kết khuyếch đại vùng ITS2 nấm từ DNA sinh thiết dày M: Marker DNA chuẩn 100 bp (Invitrogen); Giếng 1-9: Mẫu nghiên cứu; Giếng CA: Đối chứng âm; Giếng CD: Đối chứng dương Kết Hình cho thấy, giếng 3,4 không xuất băng DNA giống giếng CA - mẫu chứng âm Còn giếng 1,2,3,5,6,7,8,9 mẫu nghiên cứu, xuất băng DNA gel điện di, vị trí băng trùng với vị trí băng DNA mẫu chứng dương (CD - mang đoạn ITS2) So sánh với marker phân tử 100 bp băng DNA mẫu xét nghiệm có kích thước ước đoán khoảng 350 bp Chứng tỏ mẫu nghiên cứu mang trình tự ITS2 96 Lê Thị Phượng Để khẳng định chắn mẫu xét nghiệm nhiễm nấm, chúng tơi tiến hành đọc trình tự gen vùng ITS2, đối chiếu Genbank, đồng thời nuôi cấy sinh thiết môi trường thạch máu Kết cho thấy, nấm gây chảy máu dày Trachypithecus cristatus, Engyodontium album, Ascomycete sp, BMP2899 (chưa định tên) tìm thấy mẫu bệnh phẩm số bệnh nhân Một số loài nấm khác Macaca arctoides, Ascomycete, Trachypithecus obscurus, Engyodontium tìm thấy sinh thiết dày bệnh nhân, vai trò gây bệnh chúng chưa biết rõ Kết Hình cho thấy hình ảnh bội nhiễm loại nấm Hình Bội nhiễm nấm nuôi cấy sinh thiết môi trường thạch máu Sản phẩm PCR vùng gen ITS2 làm phân tích trình tự Kết thể Hình Một số kết trình tự gen ITS2 bệnh nhân: Hình Trình tự gen đoạn ITS2 số mẫu nghiên cứu Trong số loại nấm tìm thấy, có loại nấm định tên là: Nấm Macaca arctoides; Nấm Engyodontium album, loài gây bệnh cho người, gây chảy máu dày; Nấm Ascomycete sp, loài gây bệnh cho người; Nấm Trachypithecus obscurus; Nấm Ascomycete sp; Nấm Trachypithecus cristatus gặp, gây chảy máu dày loại nấm chưa định tên (This fungus, rarely seen as a human pathogen dealing with gastric bleeding - nấm thấy, coi tác nhân gây chảy máu dày người) Theo kết phân tích PCR, số 180 mẫu bệnh nhân viêm dày, có 70 mẫu dương tính với cặp mồi ITS2, tương ứng với tỷ lệ nhiễm nấm 38,9% Kết tương tự kết nghiên cứu Mallory (2015) sử dụng phương pháp phân tích trình tự gen ITS2 cho thấy có mặt hàng loạt loại nấm Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium Penicillium [6] Kết luận Qua nghiên cứu 180 mẫu DNA từ bệnh nhân viêm dày đến khám điều trị Bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dương, khuếch đại đặc hiệu vùng gen ITS2 xác định có mặt nấm, đồng thời ni cấy sinh thiết môi trường thạch máu, kết cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm cao 70/180 (chiếm 38,9%) Trong số loại nấm tìm thấy, nấm Macaca arctoides Trachypithecus obscurus chiếm tỷ lệ cao loại nấm khác TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alga Zuccaro, Conrad L Schoch, Joseph W Spatafora, Jan Kohlmeyer, Siegfried Draeger,and Julian I Mitchell, 2008 Detection and Identification of Fungi Intimately Associated with the Brown Seaweed Fucus serratus Appl Environ Microbiol 74(4): 931–941 [2] Bondarenko VM, 2001 Bacterial pathogenicity islands Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol (4):67-74 [3] Consuelo Ferrer, Francisca Colom, Susana Frasés, Emilia Mulet, José L.Abad, and Jorge L Alió, 2001 Detection and Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S Ribosomal DNA Typing in Ocular Infections J Clin Microbiol; 39(8): 2873–2879 [4] Nguyen Thi Hong Hanh, Nguyen Van Thinh, Nguyen Thi Nguyet, Ta Long, Nguyen Quoc Khang, Tran Van Hop, 2008 Fungi – status and gastritis in Viet Nam 7th congress on gastroenterology of Shouth East Asian nations joint 14th VNGE Annual Scientific Meeting, pp 742 – 748 [5] Tạ Long, Nguyễn Văn Thịnh, Trịnh Tiến Dũng cs, 2007, ”Phát nấm Candida parapsilosis mảnh sinh thiết dày bệnh nhân viêm dày mạn tính“, Tạp chí Khoa học tiêu hóa Việt Nam, II(6), pp 355 – 361 [6] Mallory J Suhr, 2015 Characterization and investigation of Fungi inhabiting the gastrointestinal tract of healthy and diseased humans University of Nebraska - Lincoln Dissertations & Theses in Food Science and Technology Food Science and Technology Department [7] Prucek R., Tuček J, Kilianová M, Panáček A, Kvítek L, Filip J, Kolář M, Tománková K, Zbořil R., 2011 The targeted antibacterial and antifungal properties of magnetic nanocomposite of iron oxide and silver nanoparticles, Biomaterials Jul;32(21): 4704-13 [8] Nguyễn Văn Thịnh, Tạ Long, Trần Văn Hợp, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2009, „Nghiên cứu mật độ Helicobacter pylori tổn thương mô bệnh học viêm dày mạn“, Báo cáo Hội nghị nghiên cứu khoa học lần thứ III - Hội khoa học Tiêu hóa Hà Nội (BBT nhận bài: 19/8/2016, phản biện xong: 03/10/2016) ... nấm 1-1 0 ng ADN sử dụng để khuếch đại vùng ITS2 có kích thước khoảng 350bp phương pháp PCR thể tích phản ứng 20µl với cặp mồi: ITS3 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’; ITS4 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ Thành...ISSN 185 9-1 531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(108).2016, Quyển Phenol/chloroform/isoamylalcohol;... 100 bp (Invitrogen); Giếng 1-9 : Mẫu nghiên cứu; Giếng CA: Đối chứng âm; Giếng CD: Đối chứng dương Kết Hình cho thấy, giếng 3,4 khơng xuất băng DNA giống giếng CA - mẫu chứng âm Còn giếng 1,2,3,5,6,7,8,9