Microsoft Word 00 a loinoidau TV (moi thang1 2016) docx 86 Nguyễn Minh Lý, Lê Văn Kiêm, Ngô Thị Hồng Vân, Lê Thị Mai NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP “STREAMDROP” TRONG CHUẨN BỊ TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ[.]
86 Nguyễn Minh Lý, Lê Văn Kiêm, Ngô Thị Hồng Vân, Lê Thị Mai NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP “STREAMDROP” TRONG CHUẨN BỊ TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ ALLIUM ASCALONICUM L APLICATION OF METHOD “STREAMDROP” FOR CHROMOSOME PREPARATION IN ALLIUM ASCALONICUM L Nguyễn Minh Lý, Lê Văn Kiêm, Ngô Thị Hồng Vân, Lê Thị Mai Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng; Minhlyvn24@gmail.com Tóm tắt - Chuẩn bị tiêu NST bước bước vô quan trọng nghiên cứu di truyền tế bào thực vật Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát tối ưu hóa yếu tố để thu tiêu Nhiễm sắc thể có chất lượng cao theo phương pháp “StreamDrop” Kết cho thấy, trình thu mẫu vào thời điểm từ 8-9 sáng sau xử lý mẫu rễ dung dịch colchicine 0,6% cho phép thu số lượng tế bào kỳ nguyên phân tích lũy cao Cố định mẫu hỗn hợp ethanol: acid acetic theo tỉ lệ 2:1, ủ mẫu dung dịch cellulase 0,6% đảm bảo phân ly toàn vẹn Nhiễm sắc thể, đồng nghĩa với việc tạo tiêu Nhiễm sắc thể có chất lượng cao Abstract - The chromosome preparation is a basic and a keystep in plant cytogenetic studies In this paper, we present results of the research of different conditions for high quality chromosome preparation with “StreamDrop” method The results have showen that samplecollection at time interval from to 9h AM and sample pretreatment in 0,6% colchicine solution for 30 minutes allow obtaining the highest accumulation of mitotic cells in metaphase Root tip fixation in amixture of of part glacial acetic acid and parts of absolute ethanol, and sample incubation in 0,6% cellulase solution provide good chromosome spreading and high quality plant chromosome preparations Từ khóa - nhiễm sắc thể (NST); Allium ascalonicum L.; StreamDrop; cellulase; nguyên phân Key words - Chromosome; Allium ascalonicum L.; StreamDrop; cellulase; mitosis Đặt vấn đề Chuẩn bị tiêu Nhiễm sắc thể (NST) bước bước tảng nghiên cứu di truyền tế bào sinh vật, đặc biệt phương pháp lập đồ NST Hiện nay, có nhiều kỹ thuật chuẩn bị tiêu NST công bố ứng dụng giới [1], [8], [9] Tuy nhiên, yêu cầu ngày cao phương pháp nghiên cứu di truyền đại kỹ thuật tạo NST đồ, GISH (Genomic in situ hybridization), FISH (Fluorescence in situ hybridization), Tyramide FISH chất lượng tiêu NST, mà q trình hồn thiện, cải tiến kỹ thuật sẵn có tìm kỹ thuật làm tiêu nhiệm vụ quan trọng nhà di truyền học tế bào [4], [5], [8], [10] Một tiêu có chất lượng cao tiếp tục sử dụng cho phương pháp nghiên cứu chuyên sâu sau cần đạt số yêu cầu như: NST phải phân bố cách xa tiêu để phân biệt rõ ràng chúng; kích thước NST cần đạt cực đại, cịn ngun vẹn; khơng cịn dấu vết màng tế bào, tế bào chất bào quan; tiêu sạch, khơng cịn tồn dư hóa chất Đặc biệt, quy trình thực tiêu NST thực vật thường gặp nhiều trở ngại khó khăn động vật việc ứng dụng quy trình chung cho đối tượng nghiên cứu khác nhau, thực vật có tồn lớp màng cellulose bao quanh tế bào, khác biệt lớn số lượng kích thước NST [10] Năm 2014 Kirov I đề xuất phương án chuẩn bị NST cải tiến từ phương pháp “Drop” (giọt treo) lấy tên “StreamDrop” [10] Đặc điểm bật kỹ thuật sử dụng nước trình định hình tiêu bản, làm tăng độ phân ly khả kéo dài NST [10] Hơi nước đẩy nhanh trình thủy phân thành cellulose tế bào, rút ngắn thời gian bay ethanol, giảm tối đa thất lạc NST trình chuẩn bị tiêu [5], [10] Bên cạnh đó, phương pháp cho phép ứng dụng tiêu thu phương pháp nghiên cứu hình thái, cấu trúc NST đại khác Trong nghiên cứu, Kirov I tiến hành chuẩn bị tiêu NST đối tượng nhiều loài thực vật, nhiên riêng loài Allium ascalonicum L chưa khảo sát Bài báo trình bày kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu khác đến trình chuẩn bị tiêu NST chất lượng chúng đối tượng Hành tím Allium ascalonicumL Theo phương pháp “StreamDrop” Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Tiêu NST thực từ mơ phân sinh đỉnh rễ Hành tím (Allium ascalonicum L.) Rễ thu ngâm củ hành tím đĩa petri ẩm phịng thí nghiệm Di truyền thuộc Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Dung dịch stock enzyme cellulase 6% bảo quản nhiệt độ -20oC Enzyme hòa tan dung dịch đệm citric 0,1M với pH 4,8 Dung dịch colchicine 0,6% chuẩn bị giữ điều kiện 4oC 2.2 Phương pháp nghiên cứu Để tăng số lượng tế bào hành thu kỳ nguyên phân, mẫu rễ có độ dài - cm sau lấy tiền xử lý dung môi khác ống eppendorf 0,5 ml: nước cất dung dịch colchine với nồng độ khác bảo quản điều kiện lạnh 4oC Sau giai đoạn tiền xử lý, với mục đích cố định mẫu, rễ hành chuyển sang ống eppendorf có chứa hỗn hợp acid acetic: ethanol theo tỉ lệ khác Quan sát số lượng tế bào kỳ nguyên phân (KG-NP) nhuộm dung dịch carmin 2% quan sát vật kính 100x kính hiển vi quang học HSX Pro.Way-BK 5000 – Trung Quốc Phá vỡ màng tế bào màng nhân tiến hành dựa ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(108).2016, Quyển % tế bào KG-NP Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Ảnh hưởng thời gian lấy mẫu đến số lượng tế bào kỳ nguyên phân (KG-NP) Theo số nghiên cứu trước đây, số lượng tế bào kỳ nguyên phân phụ thuộc vào thời gian lấy mẫu [1], [7], [2], [3] Trong thí nghiệm tiến hành khảo sát mốc thời gian ngày, mốc cách tiếng (Hình 1) Mẫu rễ cố định dung dịch ethanol/acid acetic (3:1), trình nguyên phân quan sát phương pháp nhuộm dung dich carmin 2% Số lượng tế bào đếm vât kính 40x 50, số lần lặp lại lần 40 30 20 10 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h Hình Tỉ lệ tế bào KG-NP theo mốc thời gian khác ngày Kết nghiên cứu cho thấy khoảng thời gian từ - 3h tỉ lệ phần trăm tế bào KG-NP không thay đổi đạt 8,3% Sau thời gian số lượng tế bào KG-NP tăng lên, đạt giá trị cực đại vào thời điểm 9h sáng (31,6%) giảm xuống cực tiểu vào 12h (5,6%) Sau tỉ lệ lại tăng đến 17,6% vào 15h tiếp tục giảm vào buổi tối Tiếp theo, khoảng thời gian từ - 9h chọn để khảo sát với khoảng cách mốc lấy mẫu nhỏ tiếng Kết thu cho thấy thời điểm 7h có 22,1% tế bào KG-NP 8h 51,8% - kết cao (Hình 2) Như vậy, thời gian lấy mẫu tối ưu từ - 9h sáng Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả khác trước đây, số lượng tế bào KG-NP lớn thực vật đạt khung thời gian từ 9h, - 10h sáng tùy thuộc vào loài mùa vụ [2], [3] % tế bào KG-NP vào dung dịch enzyme cellulase Tiêu NST quan sát kính hiển vi sau nhuộm màu dung dịch Giemsa 1% Quy trình chuẩn bị tiêu NST theo phương pháp “Stream Drop” với số thay đổi [10] - Xử lý mẫu dung dịch enzyme Sau cố định, mẫu rễ rửa dòng nước chảy thời gian 10 15 phút Cắt mơ phân sinh (chóp rễ) kim mũi mác chuyển vào ống eppendorf có chứa dung dịch đệm citric 0,1M (pH=4,8) thời gian 30 giây Tiếp theo, - chóp rễ chuyển vào ống eppendorf có chứa 20 - 30µl dung dịch enzyme có nồng độ 0,6% Ống nghiệm chứa mẫu enzyme ủ 37oC từ 15 phút đến 2h - Chuẩn bị dịch tế bào Sau ủ 37 oC mẫu nghiền nhỏ cách khuấy trộn máy vortex nghiền tay dùng chày mini Thêm 600µl nước cất vào ống nghiệm li tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút 45s Loại bỏ phần dịch micropipette, thêm 600µl ethanol 96%, trộn li tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút 30s Loại bỏ phần dịch micropipette Bổ sung 40µl ethanol 96% trộn - Chuẩn bị tiêu NST Hút 10µl dung dịch mẫu micropippet nhỏ lên lam kính, đợi 15s Nhỏ 20µl hỗn hợp ethanol/acid acetic (3:1) lên mẫu đợi 20 - 30s bề mặt lam kính khơ Đặt ngược lam kính cách bề mặt bể nước nóng 55oC thời gian - 5s Nhỏ thêm - 6µl ethanol/acid acetic (3:1) lên vệt mẫu vật, xử lý nước - 2s Sấy khô tiêu quạt đợi phút điều kiện phòng Nhuộm tiêu dung dịch Giemsa 10% 10 phút Rửa tiêu cẩn thận nước cất sấy khơ Tiêu quan sát kính hiển vi vật kính 100x 87 60 40 20 6h 7h 8h 9h Hình Tỉ lệ tế bào KG-NP thay đổi theo thời gian thu mẫu từ - 9h 3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ ethanol: acid acetic đến khả phá vỡ thành tế bào, màng tế bào màng nhân Hỗn hợp ethanol: acetic có vai trị quan trọng cố định mẫu vật chuẩn bị tiêu NST Ngoài ra, tỉ lệ chất hỗn hợp ảnh hưởng tới mức độ phân hủy màng tế bào vào thời gian cố định mẫu Trong nghiên cứu tiến hành xử lý mẫu rễ tỉ lệ ethanol: acid acetic khác (0:1, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1) với thời gian 30 phút, sau mẫu nhuộm dung dịch carmin 2% Kết rằng, tỉ lệ acid cao thành tế bào dễ bị phân hủy trình cố định (Hình 3) Bên cạnh đó, cố định mẫu acid acetic 100% dẫn đến số lượng tế bào có thành cellulose bị phá hủy cao Điều cho phép giảm thời gian xử lý mẫu enzyme, nồng độ chúng [6] Tuy nhiên, nồng độ acid cao làm tăng khả thẩm thấu tế bào, tế bào bị trương lên Khi nồng độ acid cao xâm nhập vào bên tế bào dễ ràng làm cho tế bào, NST bị biến tính, làm giảm chất lượng tiêu NST [8] Từ kết khảo sát nhận thấy độ bắt màu nhuộm dung dịch carmin thay đổi theo tỉ lệ hỗn hợp chất cố định mẫu Khi nồng độ acid cao tế bào dễ bắt màu Điều lý giải số lượng tế bào có thành cellulose bị tổn thương nồng độ acid cao dẫn đến khả xâm nhập carmin vào bên tế bào lớn Vấn đề gây khó khăn q trình quan sát tế bào trình nguyên phân Ở tỉ lệ hỗn hợp ethanol:1 acid acetic khơng thể quan sát q trình phân bào Theo kết nghiên cứu tỉ lệ hỗn hợp tối ưu 2:1, nhân tế bào nhuộm rõ, không đậm không gây cản trở cho trình quan sát Với tỉ lệ 3:1 sử 88 dụng để nhuộm mẫu, nhiên tiêu NST tạm thời nhuộm màu nhạt so với tỉ lệ 2:1 khó quan sát Kết phù hợp với kết luận tác giả trước cho cố định mẫu với nồng độ acid cao gây biến tính tế bào, NST [1], [7] Hình Tế bào rễ Hành tím sau cố định hỗn hợp ethanol: acid acetic theo tỉ lệ: A – 0:1, B – 1:2, C – 1:1, D – 2:1, E – 3:1 3.3 Ảnh hưởng nồng độ colchicine đến trình chuẩn bị tiêu NST Tiền xử lý mẫu trước cố định bước cần thiết để tăng số lượng tế bào KG-NP nâng cao chất lượng tiêu NST Các dung môi tiền xử lý thường sử dụng nước cất 4oC, 8-Hydroxyquinoline, colchicine, α-Bromonaphthalene Mỗi hóa chất nêu có phổ tác dụng khác phụ thuộc vào nồng độ xử lý, kích thước NST, cấu tạo tế bào Vì vậy, việc khảo sát điều kiện tối ưu sử dụng với đối tượng thực vật cần thiết Trong nghiên cứu nồng độ tối ưu colchicine khảo sát với phương án khác nhau: 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% Các mẫu rễ trải qua giai đoạn tiền xử lý dung dịch colchicine với nồng độ khác 4oC, sau ủ 30 phút hỗn hợp enzyme 0,6% Kết cho thấy mẫu không xử lý colchicine màng tế bào chưa hoàn toàn bị phá bỏ, NST nằm co cụm quan sát hình thái, số lượng chúng khơng thể xác định (Hình 4A) Tế bào mẫu rễ xử lý dung dịch colchicine 0,2% KG-NP khơng cịn màng, thành tế bào, nhiên NST nằm chồng chéo lên nhau, chưa rõ ràng hình thái số lượng (Hình 4B) Hình Tiêu NST Hành tím tiền xử lý nồng độ colchicine khác nhau: A- 0%, B-0,2%, C-0,4%, D-0,6% Nguyễn Minh Lý, Lê Văn Kiêm, Ngô Thị Hồng Vân, Lê Thị Mai Các tiêu mẫu xử lý dung dịch colchicine 0,4% 0,6% có chất lượng tốt nồng độ trước (Hình 4C, 4D) Dấu vết thành màng tế bào khơng cịn, NST phân bố cách xa nhau, bị chồng chéo, số lượng hình thái NST quan sát Trong nồng độ 0,4% dấu vết tế bào chất quan sát Như việc xử lý colchicine có hiệu cao rễ cây, nồng độ 0,6% nồng độ tối ưu 3.4 Ảnh hưởng thời gian xử lý mẫu enzyme cellulase đến chất lượng tiêu NST Để có tiêu NST chất lượng cao, bước xử lý mẫu enzyme vô quan trọng, thành tế bào, màng tế bào màng nhân bị phá hủy, giải phóng tế bào chất, bào quan, từ giúp NST phân ly tốt hơn, khơng bị co cụm chồng chéo lên [8] Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát trình xử lý tế bào dung dịch enzyme cellulase 0,6% khoảng thời gian khác 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút 3.4.1 Đối với mẫu chưa qua tiền xử lý dung dịch colchicine 0,6% Đối với trường hợp mẫu chưa qua bước tiền xử lý dung dịch colchicine 0,6% thấy rằng, sau 15 phút tế bào gần nguyên vẹn, màng nhân, tế bào chất khơng bị phân hủy có tế bào nằm KG-NP, có NST co cụm với nhau, khơng cho phép quan sát hình thái số lượng chúng (Hình 5A) Như vậy, khoảng thời gian chưa đủ để giải phóng NST khỏi thành phần khác tế bào Sau 30 phút xử lý màng tế bào, màng nhân số tế bào bị phá hủy, nhiên dấu vết thành phần tế bào chất khác bên cạnh NST, chưa thể quan sát đặc điểm hình thái cấu trúc NST (Hình 5B) Mẫu mơ đỉnh rễ xử lý thời gian 60 phút cho phép thu tiêu có chất lượng cao với hình dạng số lượng NST rõ ràng (Hình 5C) Nếu giữ tế bào rễ dung dịch enzyme với thời gian 90 phút, NST bị phân tán thất lạc trình chuẩn bị tiêu bản, bị đứt gãy gây cản trở cho trình xác định đặc điểm chúng (Hình 5D) Như với phương án không tiền xử lý dung dịch colchicine thời gian cần thiết để xử lý tế bào enzyme cellulase 60 phút 3.4.2 Đối với mẫu tiền xử lý dung dịch colchicine 0,6% Sau 15 phút xử lý dung dịch cellulase 0,6% cho thấy thành tế bào, màng tế bào màng nhân bị phá hủy tốt, nhiên dấu vết tế bào chất, đồng thời NST co cụm với Điều không cho phép quan sát số lượng, hình thái chúng (Hình 5A1) Kết xử lý mô phân sinh rễ thời gian 30 phút cho thấy nhiễm sắc thể có hình dạng rõ ràng, số lượng xác định (2n=16) (Hình 5B1) Nếu giữ mẫu lâu dung dịch enzyme (thời gian 60 phút 90 phút) NST bị phân tán thất lạc chuẩn bị tiêu (Hình 5C1, 5D1), gây khó khăn cho việc xác định xác số lượng NST lồi ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(108).2016, Quyển A A1 B B1 C C1 89 nghiên cứu thời gian xử lý rút ngắn 30 phút Điều khẳng định rằng, loài khác thời gian xử lý mẫu dung dich enzyme khác Kết luận Kết nghiên cứu cho phép tối ưu hóa điều kiện ảnh hưởng đến chất lượng tiêu NST Khoảng thời gian tốt để thu số lượng lớn tế bào rễ Hành tím KGNP - 9h sáng Tiền xử lý mẫu dung dịch colchocine 0,6% cho phép thu số lượng tế bào KGNP lớn nhất, NST định hình rõ ràng tiêu Cố định mẫu hỗn hợp ethanol: acid acetic theo tỉ lệ 2:1 thời gian xử lý mẫu dung dịch cellulase 30 phút, cho phép phá vỡ thành tế bào, màng tế bào hiệu TÀI LIỆU THAM KHẢO D D1 Hình 5.Tiêu NST Hành tím xử lý cellulase thời gian khác nhau: A – 15 phút, chưa qua tiền xử lý colchicine, A1 – 15 phút, tiền xử lý colchicine, B – 30 phút, chưa qua tiền xử lý colchicine, B1 – 30 phút, tiền xử lý colchicine, C – 60 phút, chưa qua tiền xử lý colchicine, C1 – 30 phút, tiền xử lý colchicine; D – 30 phút, chưa qua tiền xử lý colchicine, D1 – 30 phút, tiền xử lý colchicine Như thời gian tối ứu cần ủ mẫu dung dịch cellulase 0,6% qua tiền xử lý dung dịch colchicine 30 phút Từ kết nghiên cứu thấy colchicine ngồi vai trị tăng cường số lượng NST KG-NP cịn đẩy nhanh q trình phân hủy màng tế bào enzyme cellulase, thời gian xử lý giảm nửa từ 60 phút xuống 30 phút Bên cạnh đó, nghiên cứu I Kirov thời gian cần thiết để xử lý mẫu dung dịch chứa hỗn hợp enzyme cellulase, pectinase cytohelicase loài thuộc chi Allium từ 90 -100 phút, nhiên [1] Võ Thị Thanh Hương, “Khảo sát số lượng nhiễm sắc tế bào thực vật tế bào động vật phương pháp xử lý sốc nhược trương”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 21b, 2012, trang: 198-208 [2] Trần Tú Ngà, Giáo trình thực tập di truyền học chọn giống, NXB Nơng nghiệp Hà Nội, 1982 [3] Nguyễn Nghĩa Thìn, Các phương pháp nghiên cứu thực vật, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, 2008 [4] Anamthawat-Jonsson K., “Preparation of chromosomes from plant leaf meristems for karyotype analysis and in situ hybridization”, Methods Cell Sci vol 25, 2004, pp 91 - 95 [5] Andras S.C., Hartman T.P.V., Marshall J.A et.Al., “A Dropspreading Technique to Produce Cytoplasm-free Mitotic Preparations from Plants with Small Chromosomes”, Chromosome Res., vol 7, 1999, pp 641 – 647 [6] Arzani A., Poursiahbidi M., Mortazavi S.E., “An Acetocarmine Staining Procedure for Chromosome Banding Studies of Immature Pollen in Triticeae”, J Agr Sci.Tech vol 2, 2000, pp 167 – 172 [7] Fukui K., Iijima K., “Somatic chromosome map of rice by imaging methods”, Theor Appl Genet., vol 81(5): 5, 1991, pp 589-596 [8] Hladilova R., Siroky J., Vyskot B., “A cytospin technique for spreading plant metaphases suitable for immunofluorescence studies”, Biotech Histochem, vol 73, 1998, pp 150-156 [9] Kato A., Alberta P.S., Vega J.M., Birchler J.A., “Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation”, Biotechnic & Histochemistry, Vol 81(2-3), 2006, pp 71 - 78 [10] Kirov I., Divashuk M., Laere K.V., Soloviev A., Khrustaleva L., “An easy “SteamDrop” method for high quality plant chromosome preparation”, Mol Cytogenet, vol 7(1): 21, 2014, doi: 10.1186/1755-8166-7-21 [11] Pijnacker L.P., Ferwerda M.A., “Giemsa C-banding of potato chromosomes”, Canadian Journal of Genetics and Cytology, vol 26(4), 1984, pp 415-419 (BBT nhận bài: 19/9/2016, phản biện xong: 02/10/2016) ... 2014, doi: 10.1186/175 5-8 16 6-7 -2 1 [11] Pijnacker L.P., Ferwerda M.A., “Giemsa C-banding of potato chromosomes”, Canadian Journal of Genetics and Cytology, vol 26(4), 1984, pp 41 5-4 19 (BBT nhận bài:... lệ tế bào KG-NP theo mốc thời gian khác ngày Kết nghiên cứu cho thấy khoảng thời gian từ - 3h tỉ lệ phần trăm tế bào KG-NP không thay đổi đạt 8,3% Sau thời gian số lượng tế bào KG-NP tăng lên,... gian từ - 9h chọn để khảo sát với khoảng cách mốc lấy mẫu nhỏ tiếng Kết thu cho thấy thời điểm 7h có 22,1% tế bào KG-NP 8h 51,8% - kết cao (Hình 2) Như vậy, thời gian lấy mẫu tối ưu từ - 9h sáng