Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh dịch tả lợn châu phi tại tỉnh cao bằng và đề xuất biện pháp phòng chống

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐINH ĐỨC GIANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI TẠI TỈNH CAO BẰNG VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Thái Nguyên, năm 2021 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐINH ĐỨC GIANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI TẠI TỈNH CAO BẰNG VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG Ngành: Thú y Mã số: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Trang Thái Nguyên, năm 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố hình thức Mọi giúp đỡ để thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận văn Đinh Đức Giang ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, với nỗ lực thân, nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, đến luận văn tơi hồn thành Nhân dịp này, cho phép tơi tỏ lịng biết ơn cảm ơn chân thành tới TS Phạm Thị Trang - khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - người ln tận tình chu đáo, cổ vũ tinh thần, động viên, hướng dẫn bảo cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, thầy cô giáo giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập, tiếp thu kiến thức chương trình học Ban lãnh đạo tồn thể cán Chi cục Trồng trọt Chăn nuôi, đồng nghiệp làm việc lĩnh vực Chăn nuôi - Thú y tỉnh Cao Bằng Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn suốt trình học tập, nghiên cứu, thực đề tài Một lần xin bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập Thái Ngun, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận văn Đinh Đức Giang iii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG .vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nghiên cứu bệnh Dịch tả lợn Châu Phi 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.2.3 Tình hình DTLCP Cao Bằng 10 1.2 Dịch tễ học bệnh Dịch tả lợn châu Phi 14 1.2.1 Căn bệnh 14 1.2.2 Loài, lứa tuổi mắc bệnh 16 1.2.3 Con đường truyền lây 17 1.2.4 Cơ chế sinh bệnh 18 1.2.5 Triệu chứng, bệnh tích bệnh Dịch tả lợn châu Phi 18 1.3 Chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn châu Phi 20 1.3.1 Chẩn đoán 20 1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm phịng thí nghiệm 21 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 27 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 27 2.2 Nội dung nghiên cứu 27 iv 2.2.1 Thực trạng chăn nuôi lợn tỉnh Cao Bằng giai đoạn 2016 - 2020 27 2.2.2 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh Dịch tả châu Phi 27 2.2.3 Diễn biến bệnh Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 27 2.2.4 Tình hình lợn tiêu hủy Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 27 2.2.5 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi theo mùa tỉnh Cao Bằng 27 2.2.6 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng theo phương thức chăn nuôi 27 2.2.7 Nghiên cứu tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng theo loại lợn 28 2.2.8 Xây dựng đồ dịch tễ lợn mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 28 2.2.9 Một số đặc điểm bệnh lý bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 28 2.2.10 Cơng tác phịng chống Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 28 2.2.11 Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp áp dụng để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ vẽ biểu đồ 28 2.3.2 Phương pháp xét nghiệm mẫu 28 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm bệnh lý bệnh 31 2.3.4 Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh DTLCP tỉnh Cao Bằng 32 2.4 Phương pháp xây dựng đồ dịch tễ 32 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Thực trạng chăn nuôi lợn tỉnh Cao Bằng giai đoạn 2016 - 2020 34 3.2 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh Dịch tả Châu Phi 36 3.3 Diễn biến bệnh Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 37 3.4 Tình hình lợn bị tiêu hủy Dịch tả châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 40 v 3.5 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi theo mùa tỉnh Cao Bằng 42 3.6 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng theo phương thức chăn nuôi 45 3.7 Nghiên cứu tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng theo loại lợn 46 3.8 Cơng tác phịng chống Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 48 3.8.1 Công tác phòng chống dịch bệnh chung tỉnh Cao Bằng 48 3.8.2 Thiệt hại kinh tế bệnh Dịch tả lợn châu Phi gây 52 3.9 Xây dựng đồ dịch tễ lợn mắc bệnh Dịch tả châu Phi tỉnh Cao Bằng 53 3.10 Một số đặc điểm bệnh lý bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 55 3.10.1 Triệu chứng lâm sàng lợn mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi 55 3.10.2 Sự thay đổi số tiêu huyết học lợn mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi 56 3.10.3 Biến đổi bệnh lý đại thể lợn mắc bệnh dịch tả châu Phi 59 3.11 Đề xuất biện pháp phòng chống dịch bệnh Dịch tả lợn Châu Phi 60 3.11.1 Triển khai đồng giải pháp phòng chống DTLCP 60 3.11.2 Các giải pháp tổng thể phòng, chống dịch bệnh 61 3.11.3 Thực việc hướng dẫn, giám sát người chăn nuôi tái đàn lợn 62 3.11.4 Giải pháp chế, sách 62 Tỉnh cần tiếp tục khuyến khích, hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho doanh nghiệp 62 3.11.5 Thực tốt công tác kiểm dịch để hạn chế lây lan dịch bệnh 63 3.11.6 Giải pháp thông tin tuyên truyền, báo cáo dịch 63 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 67 Kết luận 67 Khuyến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 vi DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ASF : African swine fever ASFV : African swine fever virus CT : Chỉ thị cs : cộng DNA : deoxyribonucleic acid DT : Dịch tễ DTLCP : dịch tả lợn châu Phi ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent assay FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations Nxb : Nhà xuất OIE : Office International Epizooties PCR : Polymerase Chain Reaction PTCN : Phương thức chăn nuôi TTg : Thủ tướng tr : trang vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thực trạng chăn nuôi lợn tỉnh Cao Bằng giai đoạn 2016 - 2020 34 Bảng 3.2 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi Cao Bằng năm 2020 - 2021 36 Bảng 3.3 Diễn biến bệnh Dịch tả lợn Châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 38 Bảng 3.4 Tỷ lệ lợn bị tiêu hủy Dịch tả Châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 40 Bảng 3.5 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi theo mùa 43 Bảng 3.6 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi theo phương thức chăn nuôi 45 Bảng 3.7 Tình hình mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi theo loại lợn 47 Bảng 3.8 Kinh phí tiêu hủy lợn mắc bệnh Dịch tả Châu Phi huyện, thành phố thuộc tỉnh Cao Bằng năm 2020 52 Bảng 3.9 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn mắc bệnh Dịch tả Châu Phi 55 Bảng 3.10 Một số số hồng cầu lợn khỏe lợn mắc bệnh Dịch tả Châu Phi 57 Bảng 3.11 Một số số bạch cầu lợn khỏe lợn mắc bệnh dịch tả châu Phi 58 Bảng 3.12 Các tổn thương đại thể lợn mắc bệnh dịch tả châu Phi 60 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ tình hình bùng phát Dịch tả lợn Châu Phi báo cáo Châu Á - Thái Bình Dương (29 tháng năm 2020) Hình 1.2 Bản đồ Phân bố ASF Châu Á tính đến 2020 Hình 1.3 Bản đồ phân bố ASF Châu Âu vào tháng năm 2020 Hình 1.4 Tổng quan tình hình dịch ASF lợn rừng lợn nhà Châu Á, Châu Âu Châu Phi theo báo cáo OIE (tổ chức Thú y Thế Giới) Hình 1.6 Bản đồ thể phân bố dịch tả lợn châu Phi Việt Nam Hình 1.8 Cấu tạo virus dịch tả lợn Châu Phi 15 Hình 1.9 Vịng truyền lây bệnh dịch tả lợn Châu Phi giai đoạn 2016 - 2020 17 Hình 3.1 Biểu đồ thực trạng chăn nuôi lợn tỉnh Cao Bằng giai đoạn 2016 - 2020 36 Hình 3.2 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi Cao Bằng 37 Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ lợn bị tiêu hủy mắc Dịch tả lợn Châu Phi địa phương tỉnh Cao Bằng 42 Hình 3.4 Biểu đồ tình hình mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi theo mùa 44 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi theo phương thức chăn nuôi tỉnh Cao Bằng 46 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh Dịch tả Châu Phi theo loại lợn 48 Hình 3.7 Bản đồ dịch tễ lợn mắc bệnh dịch tả lợn châu Phi Cao Bằng 54 Ảnh 35 - 38 Phổi sung huyết, xuất huyết đám, khí quản, phế quản chứa nhiều bọt, kẽ phổi phế nang phù thũng, phổi tăng thể tích Ảnh 39 - 40 Lá lách sưng to, sung huyết xuất huyết Ảnh 41 - 42 Lá lách sưng to, sung huyết xuất huyết Ảnh 43 - 46 Thận viêm, có điểm sung huyết, xuất huyết PHỤ LỤC PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ TRÊN PHẦN MỀM MINITAB 16 So sánh tỷ lệ nhiễm mùa Đông mùa Xuân Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 14 28,57 39 53 24,43 55 40,43 20 75 34,57 All 69 59 128 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 27,512 0,000 Likelihood 28,477 0,000 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm mùa Đông mùa Hè Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 14 40,93 39 53 12,07 220 193,07 30 250 56,93 All 234 69 303 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 94,307 0,000 Likelihood 80,463 0,000 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm mùa Đông mùa Thu Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 14 31,34 39 53 21,66 122 104,66 55 177 72,34 All 136 94 230 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 30,502 0,000 Likelihood 30,566 0,000 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm mùa Xuân mùa Hè Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 55 63,46 20 75 11,54 220 211,54 30 250 38,46 275 50 325 All Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 9,533 0,002 Likelihood 8,610 0,003 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm mùa Xuân mùa Thu Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 55 52,68 20 75 22,32 122 124,32 55 177 52,68 All 177 75 252 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 0,489 0,484 Likelihood 0,496 0,481 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm mùa Hè mùa Thu Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 220 200,23 30 250 49,77 122 141,77 55 177 35,23 342 85 427 All Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 23,646 0,000 Likelihood 23,401 0,000 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm chung mùa Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 220 185,14 30 250 64,86 122 131,08 55 177 45,92 14 39,25 39 53 13,75 55 55,54 20 75 19,46 All 411 144 555 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 90,349 0,000 Likelihood 84,446 0,000 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm phương thức cơng nghiệp chuồng kín công nghiệp chuồng hở Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 85 96 181 113,20 67,80 25 142 117 88,80 53,20 All 202 121 323 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 42,643 0,000 Likelihood 44,829 0,000 Ratio So sánh tỷ lệ nhiễm phương thức công nghiệp chuồng kín phương thức ni truyền thống Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 85 96 181 128,85 52,15 209 23 232 165,15 66,85 All 294 119 413 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 92,189 0,000 Likelihood 95,783 0,000 Ratio 10 So sánh tỷ lệ nhiễm phương thức công nghiệp chuồng hở phương thức nuôi truyền thống Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 117 25 142 123,78 18,22 209 23 232 202,22 29,78 All 326 48 374 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 4,659 0,031 Likelihood 4,531 0,033 Ratio 11 So sánh tỷ lệ nhiễm chung phương thức nuôi Rows: Worksheet rows Columns: Worksheet columns Không Nhiễm nhiễm All 85 96 181 134,04 46,96 117 25 142 105,16 36,84 209 23 232 171,81 60,19 144 555 All 411 Cell Contents Count Expected count Chi-Square Test ChiPSquare DF Value Pearson 105,322 0,000 Likelihood 103,094 0,000 Ratio PHỤ LỤC 2: PHIẾU ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH DTLCP CHI CỤC TRỒNG TRỌT VÀ CHĂN NI CAO BẰNG PHỊNG THÚ Y CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự - Hạnh phúc PHIẾU ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI Ngày điều tra: Cán điều tra: Thuộc ………………………………………………………………… Điều tra hộ chăn nuôi:………………………………………… A Thu thập thông tin Tên chủ hộ .DT: Huyện: Xã: Thôn: Ngày phát ca bệnh đầu tiên: Ngày phát ca bệnh cuối (hiện tại) Có lấy mẫu xét nghiệm khơng? Có □ Khơng □ Loại hình chăn ni: Hộ gia đình □ Trang trại vừa □ Trang trại lớn □ Khác (ghi rõ) Mục đích ni: Gia súc giống □ Gia súc ni thịt □ Khác (ghi rõ) Nguồn giống: Tự sản xuất □ Mua nơi khác □ B An tồn sinh học sở chăn ni: Nguồn nước uống lợn lấy từ đâu? Nước máy □ Nước sông kênh rạch □ Ao □ Nước mưa □ Nước giếng □ Nguồn thức ăn: Thức ăn cơng nghiệp: Có □ Khơng □ ( có ghi tên hãng cám) Thức ăn chủ hộ lấy từ tự nhiên: Nấu chín □ Cho ăn sống □ Thức ăn tận dụng từ thành phố: Cho ăn sống □ Nấu chín □ Địa điểm hộ chăn ni có gần: Đường giao thơng chính? Có □ Khơng □ Chợ bn bán động vật sống? Có □ Khơng □ Cơ sở giết mổ gia súc? Có □ Khơng □ Ao, hồ, sơng, suối? Có □ Khơng □ Nếu có ghi rõ tên đường, tên chợ, tên sở giết mổ khoảng cách từ ổ dịch tới điểm ước lượng bao nhiên (mét, Km ) Động vật hoang dã có vào chuồng khơng? Có □ Khơng □ Nếu có, ghi chi tiết Lợn gia chủ có thường xun tiếp xúc với động vật khác khơng? Có □ Khơng □ 10 Động vật ni khác tự ra, vào hộ CN khơng (VD: lợn, chó hàng xóm)? Có □ Khơng □ Nếu có, ghi chi tiết B XÁC MINH Ổ DỊCH 11 Chủng loại số lượng lợn ổ dịch (con) Lợn Tổng số Mắc bệnh .Chết Tiêu hủy Sau cai sữa Tổng số Mắc bệnh .Chết Tiêu hủy Thịt Tổng số Mắc bệnh .Chết Tiêu hủy Nái Tổng số Mắc bệnh .Chết Tiêu hủy Đực giống Tổng số Mắc bệnh .Chết Tiêu hủy 12 Các biện pháp xử lý - Giữ gia súc ốm để điều trị □ - Mổ thịt gia súc chết để ăn□ - Bán chạy gia súc khoẻ - Bán chạy gia súc ốm □ - Tiêu huỷ gia súc chết - Mổ thịt gia súc ốm để ăn □ - Khác (ghi rõ) □ □ - Đưa gia súc khoẻ nơi khác □ 13 Các triệu chứng, bệnh tích Có triệu chứng, bệnh tích sau gia súc ốm khơng? Đánh dấu X có Sốt 40 độ □ Chân khập khiễng □ Phân táo □ Bỏ ăn □ Tai màu đỏ tím xanh □ Hậu mơn có máu □ Khác Những nhận xét khác triệu chứng, bệnh tích hộ chăn ni: 14 Đàn lợn có tiêm loại vắc xin phịng bệnh khơng? Khơng □ Có □ Loại vắc xin Ngày tiêm phòng Loại vắc xin Ngày tiêm phòng Loại vắc xin Ngày tiêm Phòng 15 Lấy mẫu bệnh phẩm Khơng lấy □ Có □ Loại mẫu , ghi rõ ………………………………………….………… Mẫu gửi tới (tên địa phòng xét nghiệm) Kết xét nghiệm (nếu có) Dương tính với bệnh:……… 16 Chi tiết điều tra vịng 20 ngày trước lợn xuất triệu chứng bệnh: - Hoạt động lợn: + Chỉ nhốt chuồng □ + Đưa phối giống □ vào ngày 17 Trong vòng tuần trước xảy ổ dịch, có việc vận chuyển lợn khu vực khơng? Khơng □ Có □ 18 Trong vòng tuần trước xảy ổ dịch, có thương lái đến thăm chuồng lợn hỏi mua lợn khơng? Khơng □ Có □ 19 Trong vòng tuần trước xảy ổ dịch, gia chủ có cho lợn phối giống? Khơng □ Có □ 20 Trong vòng tuần trước xảy ổ dịch, có nhân viên thú y đến thăm kiểm tra sức khoẻ cho đàn lợn khơng? Khơng □ Có □ 21 Trong vòng tuần trước xảy ổ dịch, gia chủ có xin thức ăn thừa cho lợn ăn khơng? Khơng □ Có □ Thức ăn thừa có xử lý nấu chín khơng? Khơng □ Có □ 22 Trong vòng tuần trước xảy ổ dịch, gia chủ có đến hộ có chăn ni lợn khơng? Khơng □ Có □ 23 Trong vịng tuần trước xảy ổ dịch, có người, phương tiện từ vùng dịch khác đến hộ/trại không? Không □ Có □ 24 Trong vịng tuần trước xảy ổ dịch, có nhập thức ăn chăn ni không? Không □ Chữ ký cán điều tra Có □ Chữ ký cán thú y sở Chữ ký chủ sở PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH CHẠY REALTIME PCR Quy trình tách chiết DNA/ARN a Chuẩn bị - Dung dịch Lysis Buffer: Cho thêm Proteinase K Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn nhà sản xuất Dung dịch bảo quản nhiệt độ phòng 15 – 300C - Dung dịch hạt từ: Cho dung dịch SNAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn nhà sản xuất - Dung dịch rửa (Washing Wash 1), dung dịch rửa (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100% vào dung dịch theo hướng dẫn nhà sản xuất - Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi RNA/DNA sau tách chiết sử dụng trực tiếp từ ống gốc kít b) Tiến hành tách chiết mẫu tự động máy Thermo Scientific KingFisher ML - Hút 250 µl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vơ trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu - Rã đông, vortex huyễn dịch 10% chuẩn bị mục 6.2 Sau tiến hành ly tâm 2.500g/15 phút Lấy 100µl huyễn dịch mẫu 10% vào ống Lysis buffer chuẩn bị vortex mạnh - Spin để kéo phần bám nắp ống eppendorf xuống - Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt, lắc với vận tốc 750 rpm/15 phút nhiệt độ 650C - Lấy ống eppendorf khỏi máy lắc ủ nhiệt xếp thứ tự khay - Chuẩn bị khay INOX tách chiết 15 mẫu gắn có KF ml tube (5 giếng thanh) vào khe rãnh khay INOX theo thứ tự mẫu - Hút dung dịch mẫu sau lắc nhiệt vào giếng thứ 1của KF ml tube Các giếng lại theo thứ tự từ trái sang phải sau: Giếng thứ 2: cho vào 400 µl dung dịch Washing Wash 1, giếng thứ 4: giếng 400 µl dung dịch Washing Wash 2, giếng thứ cho vào 100 µl dung dịch Elution Buffer - Sau cho thêm giếng thứ chứa mẫu 150 µl hỗn hợp hạt từ - Gắn KF ml Tip Comb (thanh nhựa dạng lược để trộn mẫu) vào khe có sẵn bên máy chiết tách - Đặt khay INOX gắn KF ml tube chứa mẫu dung dịch chiết tách vào máy chiết tách RNA/DNA tự động KingFisher ML - Vận hành máy theo hướng dẫn nhà sản xuất - Sau chiết tách RNA/DNA hoàn tất Lấy khay INOX khỏi máy đặt vào tủ Cabinet Class II - Hút toàn dung dịch giếng thứ KF ml tube cho vào ống thu hồi 500 µl vô trùng ghi sẵn ký hiệu mẫu tách chiết tương ứng - Bảo quản mẫu RNA/DNA thu 40C thời gian ngắn trước chạy realtime PCR, -250C vòng ngày -750C cần bảo quản lâu Tiến hành chạy Bảng 1: Đoạn mồi mẫu dò thiết kế dựa vùng ổn định gen P72 Stt Tên Trình tự (5’ – 3’) Mồi xuôi ASFV Mồi ngược ASFV GATACCACAAGATCRGCCGT Đoạn dò ASFV CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGTAMRA Chuẩn bị Master Mix mẫu cho phản ứng Realtime PCR phát virus DTLCP theo kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat No.: 11730-017 Bảng 2: Lượng hỗn nhân gen dùng cho phản ứng TT Nguyên Liệu Nồng độ Thể tích cho phản ứng (µl) Nước khơng có ARN DNA 5.5 Dung dịch SuperMix 12.5 Mồi xi ASFV 20 pmol/ µl 0.5 Mồi ngược ASFV 20 pmol/ µl 0.5 Đoạn dị ASFV pmol/ µl Tổng thể tích dung dịch cho phản ứng 20 Mẫu chiết tách DNA Tổng thể tích cho phản ứng 25 Sau chuẩn bị xong, đưa ống PCR có chứa master mix mẫu vào máy PCR để chạy phản ứng theo chu kỳ luân nhiệt sau: Bảng 3: Chu trình nhiệt theo kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat No.: 11730-017 Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50oC phút 01 95oC phút 01 95oC 15 giây 45 60oC 45 giây (ghi nhận tín hiệu quang) - Tiến hành đọc kết ... thực đề tài: "Nghiên cứu số đặc điểm bệnh Dịch tả lợn Châu Phi tỉnh Cao Bằng đề xuất biện pháp phòng chống" Mục tiêu đề tài - Xác định số đặc điểm bệnh Dịch tả lợn Châu Phi tỉnh Cao Bằng - Đề xuất. .. mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 2.2.9 Một số đặc điểm bệnh lý bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng - Triệu chứng lâm sàng lợn mắc bệnh Dịch tả lợn châu Phi - Bệnh tích: đại thể lợn. .. tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 28 2.2.10 Công tác phòng chống Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng 28 2.2.11 Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh Dịch tả lợn châu Phi tỉnh Cao Bằng