XÂY DỰNG QUY TRÌNH kỹ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO sát TÍNH KHÁNG KHUẨN và KHẢ NĂNG CHỐNG OXY hóa của một số hợp CHẤT THỨ cấp từ lá cây XUÂN HOA (

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ ngƣời thân nuôi dƣỡng giáo dục nên ngƣời Tơi xin gửi lịng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh - Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh - Thầy chủ nhiệm, thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học Đã hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập hồn thành đề tài Tôi xin chân thành biết ơn: - TS Phan Phƣớc Hiền - Kỹ sƣ Trịnh Phi Ly Đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian công sức để truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo điều kiện tốt cho hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến: - ThS Huỳnh Kim Diệu tận tình giúp đỡ việc lấy mẫu Xuân Hoa đóng góp ý kiến quý báu cho luận văn - TS Nguyễn Ngọc Hải, Phòng Vi Sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm - Cô Chú Đinh Cơng Bảy, chủ sở trà Hồn Ngọc Nga Tây Ninh tận tình giúp đỡ cung cấp số lƣợng lớn Xuân Hoa Chân thành cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đỗ Thị Tuý Phƣợng, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 3/2007 “ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn khả chống oxy hóa số hợp chất thứ cấp từ Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: TS Phan Phƣớc Hiền Đề tài đƣợc tiến hành tại: - Phịng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh - Phịng Vi Sinh, Khoa Chăn Ni Thú Y, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Thời gian tiến hành: từ 15/3/2007 đến 30/7/2007 Nội dung tiến hành: - Tiến hành chiết tách phân đoạn từ cao kháng khuẩn sắc ký cột sắc ký lớp mỏng, sau thử nghiệm khả kháng khuẩn phân đoạn với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa - Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng sắc ký điều chế để tách chiết số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh - Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hợp chất đƣợc tách chiết phịng phân tích cấu trúc, Viện Hố Học,Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội - Thử nghiệm khả chống oxy hóa Xuân hoa quy trình DPPH Kết đạt đƣợc: - Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu : MICE coli = 500 µg/ml iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MICsalmonella= 500 µg/ml - Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn XH9, XH10, XH11, XH12, XH13 - Tiến hành tách chiết phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn thu đƣợc hợp chất XH-K11 XH-K13 - Sau chạy phổ tham khảo số tài liệu, định danh đƣợc XH-K11 apigenin 7-O-β- glucoside, có cơng thức phân tử: C21H20O10 chất XH-K13 β- sitosterol-3-O- β-glucoside, có cơng thức phân tử: C35H60O5 - Khảo sát tính chống oxy hóa Xuân Hoa cho thấy hàm lƣợng phân tử ức chế DPPH cao (85,7%), thông qua so sánh số IC50 mẫu Xuân Hoa với Vitamin C: IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml) IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml) v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City “Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa leaves” Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center, Nong Lam University Ho Chi Minh City Content: - Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that researching antibacterial property of these fractions for E coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa - Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these antibacterial fractions - Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process Result: - Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with : MICE coli = 500 µg/ml MICsalmonella= 500 µg/ml - Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction - Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin 7-O-β- glucoside and β- sitosterol-3-O- β-glucoside - Determination of antioxidant property of Xuan Hoa extract shows that the molecular volume which inhibits oxidant activity is high (85,7% Vitamin C): IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml) IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml) vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm ơn iii Tóm Tắt iv Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt xi Danh sách hình biểu đồ xii Danh sách bảng sơ đồ xiii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Xuân Hoa 2.1.1 Đặc điêm thực vật học 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Phân bố 2.1.4 Nhân giống 2.2 Công dụng Xuân Hoa 2.2.1 Theo kinh nghiệm dân gian 2.2.2 Tác dụng sinh học 2.3.1.1 Bảo vệ tế bào gan 2.3.1.2 Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy heo 10 2.3 Thành phần hóa học 13 2.4 Đại cƣơng số hợp chất hữu tự nhiên 15 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.4.1 Alcaloid 15 2.4.2 Flavonoid 16 2.4.3 Tinh dầu 16 2.4.4 Saponin 17 2.5 Đại cƣơng vi khuẩn đƣờng ruột 17 2.5.1 Định nghĩa 17 2.5.2 Hình thể 17 2.5.3 Tính chất ni cấy 18 2.5.4 Đặc tính sinh hóa 18 2.5.5 Sức đề kháng 19 2.5.6 Độc tố 19 2.5.7 Cấu trúc kháng nguyên 19 2.5.8 Khả gây bệnh 21 2.6 Một số đặc tính vi khuẩn thử nghiệm 21 2.6.1 Staphyl ococcus aureus 21 2.6.2 Pseudomonas aeruginosa 21 2.6.3 Escherichia coli 21 2.6.4 Salmonella 22 2.7 Hoạt tính chống oxy hóa DPPH 23 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 24 3.1 Vật liệu 24 3.2 Địa điểm thời gian thực 24 3.2.1 Địa điểm 25 3.2.2 Thời gian 25 3.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 25 3.3.1 Thiết bị dụng cụ 25 3.3.2 Hóa chất 27 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 28 3.4.1 Xử lý nguyên liệu 28 3.4.2 Điều chế loại cao 28 3.4.2.1 Điều chế cao ete dầu hỏa 28 3.4.2.2 Điều chế cao chloroform 29 3.4.2.3 Điều chế cao n-butanol 29 3.4.2.4 Điều chế cao nƣớc 29 3.4.3 Khảo sát tính kháng khuẩn loại cao 31 3.4.4 Chiết xuất số hợp chất cao chloroform 32 3.4.4.1 Sắc ký cột 32 3.4.4.2 Sắc ký lớp mỏng 35 3.4.4.3 Sắc ký điều chế 37 3.4.4.4 Kỹ thuật kết tinh phân đoạn 38 3.4.5 Khảo sát tính kháng khuẩn phân đoạn đƣợc tách chiết từ cao chloroform 38 3.4.6 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH 40 3.4.6.1 Các tính chất gốc tự DPPH 40 3.4.6.2 Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH 40 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Thử nghiệm khả kháng khuẩn loại cao chiết 44 4.2 Kết tách chiết cao chloroform phân đoạn chúng 45 4.2.1 Kết tách chiết cao chloroform 45 4.2.2 Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13 47 4.2.2.1 Phân đoạn XH11 47 4.2.2.2 Phân đoạn XH9 XH10 47 4.2.2.3 Phân đoạn XH13 48 4.3 Cấu trúc hóa học chất tinh khiết 49 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.3.1 Chất XH-K13 49 4.3.2 Chất XH-K11 50 4.4 Thử nghiệm khả kháng khuẩn phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform 52 4.5 Kết thử nghiệm chống oxy hóa 55 4.5.1 Kết đo OD vitamin C 55 4.5.2 Kết đo OD dịch chiết Xuân Hoa 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 62 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 12a: Phổ HSQC chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 12b: Phổ HSQC chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 13: Phổ HMBC chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 13a: Phổ HMBC chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 13b: Phổ HMBC chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 14: Phổ COSY chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 14a: Phổ COSY chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 14b: Phổ COSY chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ Lục14c: Phổ COSY chất XH-K11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 15: Dữ liệu phổ 13C – NMR DEPT chất XH-K13 Vị trí C (δppm) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' 13 C – NMR 36,80 29,24 76,94 38,29 140,43 121,29 31,34 31,39 49,59 36,18 20,56 39,30 41,82 56,15 23,82 27,74 55,42 11,62 18,91 35,44 18,58 33,34 25,47 45,14 28,71 19,65 19,05 22,59 11,74 100,79 73,44 76,69 70,09 76,75 61,08 Dept 135 CH2 CH2 CH=O CH2 C= CH= CH2 CH CH C CH2 CH2 C CH CH2 CH2 CH CH3 CH3 CH CH3 CH2 CH2 CH CH CH3 CH3 CH2 CH3 CHOH CHOH CHOH CHOH CHOH CH2OH Tín hiệu mũi Mũi âm, Dept 90 Mũi âm, Dept 90 Mũi dƣơng Mũi âm, Dept 90 Biến Mũi dƣơng Mũi âm, Dept 90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng Biến Mũi âm, Dept 90 Mũi âm, Dept 90 Biến Mũi dƣơng Mũi âm, Dept 90 Mũi âm, Dept 90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng, Dept 90 Mũi dƣơng, Dept 90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng, Dept 90 Mũi âm, Dept 90 Mũi âm, Dept 90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng, Dept 90 Mũi dƣơng, Dept 90 Mũi âm, Dept 90 Mũi dƣơng, Dept 90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi âm, Dept 90 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 16: Dữ liệu phổ chất XH-K13 Vị trí 1H – NMR C (δ ppm, J = Hz) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 13 C – NMR COSY HMBC (δ ppm ) H - 1H HC 1,77; 0,987; m 1,804; 1,508; m 3,43, m 4a:2,12 / 4b:2,37 5,32; s; 1H 1,946; 1,97; t 1,512; m; 1H 0,9075; d; 1H 11a:1,4; 11b:1,5; m 12a:1,17; 12b:1,97; m 0,86; m; 1H 15a:1,13; 15b:1,52; m 16a:1,23; 16b:1,78; m 1,157; m; 1H 0,67; s; 3H 0,96, s; 3H 1,3; m; 1H 0,91, d; 3H 22a:1,4; 22b:1,24 1,18; m; 2H 0,93; m; 2H 1,609; m; 1H 0,78; s; 3H 0,80; s; 3H 28a:1,20; 28b:1,22 0,82; t; 3H 4,22; d, J=8 2,90; m; 1H OH-2'=4,84 3,12; m; 1H OH-3' = 4,85 3,02; m; 1H 36,80 29,24 76,94 38,29 140,43 121,29 31,34 31,39 49,59 36,18 20,56 39,30 41,82 56,15 23,82 27,74 55,42 11,62 18,91 35,44 18,58 33,34 25,47 45,41 28,71 19,65 19,05 22,59 11,74 100,79 C3, C5, C10 H3/H4a;H3/H4b H4a/H4b C2,C10,C3 /C6,C5 H6/H7 H7/H8 C7,C8,C10, C4 C13, C17,C14 C9, C10, C5 H20/H21 H21/H20 C17,C20,C22 H1'/ H2' C3' 73,44 OH-2'/ H2' 76,69 OH-3'/ H3' LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4' 5' OH-4'= 4,82 3,07; m; 1H 70,09 76,75 OH-4'/ H4' Phụ lục 17: Dữ liệu phổ 13C-NMR DEPT XH-K11 Vị trí C 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 13 C-NMR (δ ppm ) 164,30 102,98 181.96 161,09 99,50 162,93 94,83 156,92 105,31 120,77 128,60 116,06 162,31 116,06 127,60 Glucose 99,90 73,09 77,16 69,56 76,42 60,60 DEPT 90 DEPT 135 Kết luận Biến Mũi dƣơng Biến Biến Mũi dƣơng Biến Mũi dƣơng Biến Biến Biến Mũi dƣơng Mũi dƣơng Biến Mũi dƣơng Mũi dƣơng Biến Mũi dƣơng Biến Biến Mũi dƣơng Biến Mũi dƣơng Biến Biến Biến Mũi dƣơng Mũi dƣơng Biến Mũi dƣơng Mũi dƣơng >C=O –CH= >C=O =C-OH –CH= =C-O –CH= =C–O =C< >C= –CH= –CH= =C–OH –CH= –CH= Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Biến Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi dƣơng Mũi âm >CH kề O –CH – OH –CH – OH –CH – OH –CH – OH –CH2–OH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 18: Dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR, COSY, HMBC chất XHK11 Vị tríC (δ ppm ) 13 164,30 102,98 181.96 161,09 99,5 162,93 94,83 156,92 10 105,31 1’ 120,77 2’ 128,60 3’ 116,06 4’ 162,31 5’ 116,06 6’ 127,60 Glucose 99,9 73,09 77,16 69,56 76,42 60,60 C-NMR H-NMR H COSY HMBC H H 13 H 6,86 (1H,s) 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz) H6 H8 6,83 (1H, d, J = 2,0 Hz) H8 H6 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz) 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) H2’ H3’ H8 H3 C4, C2 H6 C8, C10 C6, C7, C9, C10 H3’ H2’ 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz) 5,06 (1H,d, J=7,5Hz) H1 C7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... cơng trình chúng tơi khảo sát khả chống oxy hóa hợp chất Xuân Hoa Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tơi thực đề tài: ? ?Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn khả chống oxy. .. Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 3/2007 “ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn khả chống oxy hóa số hợp chất thứ cấp từ Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum) Giáo viên... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************************** XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG