SỬ DỤNG kỹ THUẬT RFLP xác ĐỊNH sự đa DẠNG DI TRUYỀN của nấm metarrhizium anisopliae và nấm beauveria bassiana ký SINH TRÊN côn TRÙNG gây hại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHĨA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Ban chủ nghiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho  ThS Võ Thị Thu Oanh hƣớng dẫn tận tình cho tơi suốt q trình thực tập giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp  TS Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Phịng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm  Các anh chị làm việc Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng hết lòng giúp đỡ, chia động viên tơi suốt thời gian làm khóa luận  Các bạn sinh viên thực tập phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi  Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học K28 chia sẻ vui buồn thời gian học nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định đa dạng di truyền hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana” ký sinh côn trùng gây hại ” đƣợc thực từ ngày 20 tháng năm 2005 đến ngày 15 tháng năm 2005 trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Đề tài Trần Nhƣ Ngọc thực dƣới hƣớng dẫn ThS Võ Thị Thu Oanh Đối tƣợng nghiên cứu nấm Metarrhizium anisopliae nấm Beauveria bassiana ký sinh trùng gây hại Nấm có tác dụng tiết độc tố làm ngừng hoạt động ruột, phá hoạt động bình thƣờng côn trùng dẫn đến côn trùng bị chết khô Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 dòng nấm Metarrhizium anisopliae vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nấm Beauveria bassiana giúp chọn lọc dòng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt trùng lâu dài hiệu nhằm phục vụ cho sản xuất nông nghiệp Các nội dung nghiên cứu bao gồm: Phục hồi chủng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassian số côn trùng gây hại Dùng kỹ thuật PCR phát gen protease (Pr1) vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana Sau thực phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát đa hình phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 nấm Beauveria bassiana vùng Pr1 nấm Metarrhizium anisopliae Giải trình tự đoạn gen Pr1 vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự với mẫu ngân hàng gen giới (genbank) Kết thu đƣợc nhƣ sau: 1.Phục hồi dịng nấm Metarrhizium Beauveria mơi PGA: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau q trình phục hồi nguồn nấm mơi trƣờng PGA(Potato-GlucoseAgar),kết chúng tơi thu đƣợc số dịng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 2.Nhân sinh khối dòng nấm Metarrhizium Beauveria môi trƣờng lỏng Czapek – Dox khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa lại với nƣớc cất phơi khô , nghiền nitơ lỏng ,cuối đƣợc nấm dạng khô bảo quản nấm -800C sử dụng 3.Tiến hành ly trích nấm bảo quản dịch ly trích ,kết trích đƣợc DNA 12 dịng nấm Metarrhizium Beauveria ,sau tinh DNA dòng nấm Metarrhizium Beauveria nhằm tạo sản phẩm ,ít tạp sản phẩm PCR.Sau tinh giữ đƣợc DNA 12 mẫu nấm 4.Thực phản ứng PCR dòng nấm Metarrhizium Beauveria , kết thu đƣợc sản phẩm PCR dòng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III sản phẩm PCR kếtquả chƣa nhận thấy rõ đa dạng di truyền dòng nấm mức độ tƣơng đồng dòng nấm cao Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc band gel so với Ladder hồn tồn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn dòng nấm Beauveria LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mụclục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1.Mục đích 1.2.2.Mục tiêu 1.3.Yêu cầu nghiên cứu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Vai trò biện pháp phòng trừ sinh học 2.2.Giới thiệu nấm ký sinh 2.2.1.Giới thiệu nấm Metarrhizium anisopliae 2.2.2.Giới thiệu nấm Beauveria bassiana vuille 2.3.Hiệu phòng trừ chế phẩm nấm 2.4.Sơ lƣợc phƣơng thức xâm nhiễm 2.5.Hoạt tính sinh học 11 2.6.Một số nghiên cứu nƣớc 11 2.6.1.Nghiên cứu nƣớc 11 2.6.2.Nghiên cứu nƣớc 12 2.7.Vai trò protease Pr1 vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 14 2.8.Phản ứng PCR 14 2.8.1.Giới thiệu chung PCR 14 2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết PCR 15 2.8.3.Các ứng dụng phƣơng pháp PCR 16 2.8.4 Những hạn chế phƣơng pháp PCR 16 2.9 Đọc trình tự máy đọc tự động 17 2.10.Phân tích RFLP 17 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1.Thời gian địa điểm 19 3.1.1.Thời gian 19 3.1.2.Địa điểm 19 3.2 Vật liệu hóa chất 19 3.2.1.Vật liệu 19 3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm 19 3.2.1.2.Các Primer dùng thí nghịêm 19 3.2.2.Hóa chất mơi trƣờng 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm 19 3.2.2.2 Các hóa chất dùng điện di 20 3.2.2.3 Các hóa chất dùng phản ứng PCR 20 3.2.2.4.Môi trƣờng 20 3.2.3.Các thiết bị 21 3.3.Nôi dung nghiên cứu 21 3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.4.1.Phục hồi chủng nấm 21 3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng 22 3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA 22 3.4.4.Phƣơng pháp tinh DNA 23 3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR 24 3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae 24 3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille 25 3.4.6.Điện di đọc kết 26 3.4.6.1.Điện di gel agarose 26 3.4.6.2.Đọc kết điện di 26 3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27 3.4.7.1.Tinh sản phẩm PCR 27 3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27 3.4.8.Tinh sản phẩm đọc trình tự 28 3.4.9.Điện di ghi nhân kết 29 3.4.10 Phân tích RFLP 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết phục hồi nhân sinh khối nấm 30 4.2 Kết ly trích DNA 30 4.3 Kết tinh DNA 32 4.4 Kết PCR 33 4.5 Kết phân tích RFLP 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1.Kết luận 36 5.2.Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria Metarrhizium Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh ong 13 Hình 4.1 Nấm Beauveria Metarrhizium 30 Hình 4.2 Kết ly trích 31 Hình 4.3 Kết tinh 32 Hình 4.4:Kết PCR 34 Hình 4.5:Kết phân tích RFLP 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BDQ96 BDTN4 SCLLLA1 RNBT1.7 DONG3.1 BXĐTG6 RMTĐ3 PULQ2 SR BRVT6 BHBD6 PM Ng nm g m M l TE dNTP TAE UI bp Kb CZA SDS PGA SDA RFLP RAPD Tm PCR RFLP EDTA ITS Taq TAE TE : Bọ dừa Quận : Bọ dừa Tây Ninh : Sâu lúa Long An : Rầy nâu Bến Tre 1.7 : Dịng 3.1 : Bọ xít đen Tiền Giang : Rầy mềm Thủ Đức : Rệp vải mềm nâu tím Quận : Sâu róm : Bọ rầy Vũng Tàu : Bọ hà Bình Dƣơng : pico mol : nano gram : nano mol : micro gram : micro mol : micro mol/lít : micro lít : tris EDTA : deoxyribonucleotide – – trphosphate : tris acetic EDTA : unit international : base pair : kilo base : Czapek – Dox : Sodium dodecyl sulphate : Potato glucose agar : Soduim dedocyl sulphate : Restriction Fragment Lengh Polymorphism : Random Amlification of Polymorphic DNA : melting temperature : Polymerase Chains Reaction : Restriction Fragment Length Polymorphism : Ethylene Diamine Tetracetic Acid : Intenal Transcribed Spacer : Thermus aquaticus : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat : Tris ethylene diamine tetra acetate ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nấm Beauveria Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian 940C phút - Tách đoạn DNA 940C phút - Ủ bắt cặp 560C 30giây - Kéo dài 720C phút - Kéo dài 720C phút 40C 10 phút - Tách đoạn DNA - Số chu kỳ lặp lại (30 chu kỳ) -Ủ 3.4.6 Điện di đọc kết gel Agarose 3.4.6.1 Điện di gel Agarose - Cho 0.125 gram agarose vào 12.5ml dung dịch 0.5X TAE - Đun sôi hỗn hợp khoảng phút lò viba - Để nguội nhiệt độ phòng - Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc đổ gel), ý tránh bọt khí gel - Để nguội nhiệt độ phịng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc khỏi gel, cho dung dịch 0.5X TAE vào bể điện di cho bảo đảm ngập gel - Trộn l sản phẩm PCR với l loading dye 6X mặt giấy paraffin Cho hỗn hợp vào giếng gel: gồm có giếng than chuẩn, giếng đối chứng giếng chứa mẫu cần xác định kiểu gen, vận hành máy điện di 30 phút 100V 250mA 3.4.6.2 Đọc kết điện di - Sau điện di ngâm gel hỗn hợp ethidium bromide l/ml TAE 0,5X 15 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 26 - Rửa lại nƣớc nhiều lần đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000) - Ethidium bromide liên kết với DNA phát sáng dƣới tia UV, kết xuất băng sáng gel - Xác định kết dự kiến: cặp primer METPR1/METPR4 hình xuất băng có kích thƣớc 1,5kb 3.4.7 Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 nấm Metarrhizium anisopliae ITS1 – 5.8s – ITS2 nấm Beaveria Bassiana vuille Sau chạy PCR chúng tơi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch xác định xác đoạn gen gây độc Pr1 vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide đoạn gen độc này, từ so sánh với ngân hàng gen giới Đầu tiên để đạt đƣợc kết cao nên phải tiến hành tinh sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết cao 3.4.7.1 Tinh sản phẩm PCR 1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc khử trùng (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch).Cho vào GFX 500µl capture buffer 2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX 3.Trộn lên xuống pipette khoảng 4-6 lần 4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng 30 giây 40C 5.Loại bỏ dung dịch ống thu dịch lọc, sau đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc 6.Thêm 500µl wash buffer vào cột GFX Ly tâm tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây 40C 7.Loại bỏ ống thu dịch lọc chuyển GFX sang effpendorf 8.Thêm 50µl elution buffer trực tiếp vào cột GFX 9.Giữ nhiệt độ phòng khoảng phút 10.Ly tâm 10000 vòng phút 40C Sản phẩm tinh đƣợc bảo quản ở- 40C LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 3.4.7.2 Thành phần phản ứng đọc trình tự Buffer đƣợc sử dụng nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối phải đạt 1X Bảng 3.5 Thành phần phản ứng đọc trình tự Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) 2,5 X 4µl - Buffer 5X 2µl - Primer 3.2 pmol 1µl - DNA khn 10-40 ng 1µl - BDT mix - Nƣớc 10 µl * Quy trình nhiệt phản ứng PCR đọc trình tự * Nấm Metarrhizium anisopliae Đặt tube vào máy PCR chỉnh đến thể tích xác Biến tính hồn toàn: 960C phút Lặp lại 25 chu kỳ: 960C 10 giây 500C giây 600C phút Giữ 40C * Nấm Beaveria Bassiana vuille Đặt tube vào máy chỉnh thơng số Biến tính hồn tồn: 950C phút lặp lại 25 chu kỳ: 950C 30 giây 500C 10 giây 600C phút Giữ 40C 3.4.8 Tinh sản phẩm đọc trình tự Sản phẩm đọc trình tự đƣợc tinh phƣơng pháp EDTA - Cho 5µl EDTA vào eppendorf - Thêm vào 60µl ethanol 100% eppendorf LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 - Trộn lên xuống hỗn hợp vài lần - Đem ủ mẩu nhiệt độ phòng khoảng 15 phút - Ly tâm tốc độ 12000 vòng 30 phút - Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70% - Ly tâm 12000 vòng 15 phút 40C - Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khô nhiệt độ phòng - Làm tan DNA cách cho vào 2µl hidiformamide, biến tính 950C phút 3.4.9 chạy điện di ghi nhận tính hiệu máy sequencer ABI PRISM 3100 sản phẩm sau tinh sạch, tiến hành điện di đọc kết máy Sequencer 3.4.10 Phân tích RFLP *Quy trình chung phản ứng cắt - Ủ khoảng g DNA đƣợc khuếch đại với 1U enzyme cắt dƣới điều kiện nhà sản xuất (Roche) hƣớng dẫn Thành phần phản ứng xem bảng 3.6 - Những đoạn DNA cắt đƣợc phân tách điện di gel agarose 2%, sau gel đƣợc nhuộm ethidium brommide Đọc kết chụp hình dƣới tia UV Bảng 3.6 Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích SuRE/cut Buffer 10X 2,5 l DNA Restriction enzyme Nƣớc cất vô trùng 100 – 150 ng 10 UI – 10 l 0,1 l Vừa đủ thể tích 25 l LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.kết phục hồi nhân sinh khối dòng nấm thu thập đƣợc từ tỉnh thành nƣớc *Kết phục hồi nguồn nấm môi trƣờng PGA chúng tơi phục hồi đƣợc số dịng nấm dùng thí nghiệm sau thời gian khỏang 7-10 ngày ni cấy, nấm phát triển tốt, quan sát bào tử nấm kính hiển vi, xác định xác hai nguồn nấm thu thập ban đầu Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana , không bị tạp nhiễm vi khuẩn hay lọai nấm khác Bao gồm dòng sau: BDQ96, BDTN4, SCLLLA1, RNBT1.7, BXĐTG6, DÒNG3-1, RMTĐ3, BHBD6, NNPT7, SR, BRVT6, PULQ2 * Kết nhân sinh khối sợi nấm môi trƣờng CZA Thu đƣợc sinh khối 12 dòng nấm gồm: dòng nấm Metarrhizium anisopliae dịng nấm Beauveria bassiana B B A Hình 4.1 Nấm Metarrhizium anisopliae(A) Nấm Beauveria bassiana (B) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 4.2 Kết ly trích DNA mẫu nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana Sau thu sinh khối chúng tơi tiến hành ly trích dịng nấm, q trình đơn giản nhƣng có ý nghĩa định đến chất lƣợng sản phẩm DNA thu đƣợc bƣớc tiếp theo, phải thao tác nhẹ nhàng xác theo qui trình chung nhằm tránh đứt gãy DNA, nhiễm tạp….Qua điện di cho thấy mẫu ly trích có lƣợng DNA thu đƣợc chƣa nhiều, lẫn tạp gãy DNA trình thao tác chƣa tốt Sản phẩm DNA ly trích đƣợc điện di gel thƣờng có nồng độ gel1 %, hiệu điện 50 v, 250 mA, khỏang thời gian 50 phút 10 11 12 DNA tổng số Tạp nhiễm Hình 4.2 Kết ly trích DNA tổng số nấm Metarrhizium Beauveria Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 5.PULQ2 11.BXĐTG6 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Qua hình 4.6 ta thấy rằng: lƣợng DNA thu đƣợc q trình ly trích chƣa đồng đều, mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 3.NNPT7, 4.SR, 5.PULQ2, 6.BRVT67.SCLLLA1, 8.DONG 3-1, 9.BDQ96 thu đƣợc lƣợng DNA nhiều , thể qua ảnh kích thƣớt band đậm rõ so với mẫu lại 10.BDTN4,11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7 Phần cuối giếng nhiều tạp nên phát sáng nhiều, điều gây khó khăn nhiều cho trình tinh bƣớc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 4.3 Kết tinh DNA tổng số hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana Tiến hành tinh sản phẩm DNA vừa ly trích RNAse, nhằm lọai bỏ tạp nhiễm giúp sản phẩm sau khuếch đại đƣợc tốt Quan sát hình 4.3 ta thấy sau tinh lƣợng DNA có giảm so với lúc chƣa tinh nhƣng nhìn chung mẫu tƣơng đối sạch, tạp hầu nhƣ khơng cịn sản phẩm đứt gãy Điều giúp cho trình khuếch đại sản phẩm DNA kỹ thuật PCR diễn thuận lợi Kiểm tra sản phẩm tinh thƣờng sử dụng gel có nồng độ %, hiệu địên 50 v, 250 mA, thời gian điện di 50 phút 10 11 12 DNA tổng số Tạp nhiễm Hình 4.3 Hình ảnh DNA tổng số nấm Beauveria Metarrhizium sau xử lý RNAse Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 5.PULQ2 11.BXĐTG6 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Sau tinh ta thấy mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 4.SR, 5.PULQ2, 9.BDQ9 lƣợng DNA nhiều, tiến hành phản ứng PCR với mẫu cần phải pha lõang nồng độ DNA nƣớc cất lần khỏang từ 7-10 lần Riêng mẫu lại gồm 3.NNPT7, 6.BRVT6, 7.SCLLLA1, 8.DONG3-1, 10.BDTN4 11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7 nồng độ DNA mẫu cịn nên pha lõang từ 1-3 lần không pha lõang Vd:đối với mẫu 6.BRVT6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 4.4 Kết phản ứng PCR Thực PCR 12 dòng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana, nhiên kết khuếch đại sản phẩm DNA thu đƣợc dòng nấm Beauveria bassiana sử dụng cặp mồi ITS4 ITS5 qua hình 4.4 chúng tơi khuếch đại đƣợc vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 gây độc cao, đƣợc phân lập từ nhiều ký chủ địa phƣơng khác nhƣng cho kích thƣớt band gel nhƣ Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp primer, nhiệt độ kéo dài, cân đối thành phần phản ứng PCR Phản ứng PCR xảy tốt điều kiện DNA ly trích phải đúng, phải đảm bảo DNA có nồng độ độ tinh định Đối với nấm Beauveria bassiana nồng độ DNA phù hợp 100ng Nồng độ DNA cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha loãng DNA dung dịch đệm (TE 1X) hay nƣớc vơ trùng Riêng dịng nấm Metarrhizium anisopliae sử dụng cặp mồi METPR1 METPR4 không thực đƣợc phản ứng PCR số yếu tố chủ quan nhƣ nêu PCR phản ứng có độ nhạy cao, q trình thao tác không đảm bảo điệu kiện vô trùng tƣơng đối khó tránh tạp nhiễm dẫn đến kết sai lệch có khơng thu đƣợc kết mong muốn Ngồi cịn quy trình chƣa phù hợp, nhiệt độ bắt cặp chƣa tƣơng thích, có sai khác đáng kể vùng liên kết gen, dẫn đến primer không bắt cặp, nên không khuếch đại đƣợc Một khả khơng thể thiếu dịng nấm Metarrhizium có độc tính yếu khơng có diện gen Pr1 bị đoạn chromosome (Wang C., Skrobek A and Butt T.M., 2003)…Vì phản ứng khuếch đại DNA dịng nấm Metarrhizium anisopliae chƣa thực đƣợc Ở hình 4.4 ta thấy rằng, mẫu đầu gồm: 1.RMTĐ3 2.BHBD6 tạo band phát sáng đậm nồng độ DNA có mẫu cao so với mẫu lại, nên khuếch đại tạo sản phẩm có kích thƣớc band dày Sản phẩm khuếch đại đƣợc điện di 60 phút , 250 mA, 50 V, nồng độ gel % LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 kb 580 bp Hình 4.4 sản phẩm PCR với primer ITS4 ITS5, nồng độ 0.5 pmol/µl Ghi :1 RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5.PULQ2 6.NNPT7 7.LADDER 4.5 Kết phân tích RFLP dịng nấm Beauveria bassiana vuille Khi thực phản ứng enzyme cắt giới hạn cho dòng nấm Beauveria Bassiana kết cho thấy chƣa thấy rõ đa dạng di truyền dịng nấm, ngun nhân khơng có khả khảo sát nhiều enzyme cắt khác nhau, mà thực đƣợc phản ứng cắt enzyme đặc trƣng Hae III Alu I Vì nên chƣa thấy rõ đƣợc đa hình band địên di, cho band có kích thƣớc nhƣ dịng phân tích Tuy nhiên tổng kích thƣớc band mẫu tƣơng đƣơng với kích thƣớc ladder 580 bp Với enzyme HaeIII cắt dòng nấm Beauveria bassiana gồm 1.RMTĐ3, 2.SR, 3.BHBD6, 4.BRVT6, 5.PULQ2, 6.NNPT7, qua hình 4.5 cho thấy enzyme cắt đƣợc hết sản phẩm PCR mẫu nấm, tạo thành band có kích thƣớc tƣơng đƣơng ladder 1.5 kb 200 bp 380 bp Nồng độ DNA 100ng (sử dụng 6µl) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 với enzyme Alu I thực phản ứng cắt dòng Beauveria bassiana nhƣ với enzyme Hae III Qua hình 4.9 cho thấy enzyme Alu I cũngcắt đƣợc hết lƣợng sản phẩm PCR mẫu nấm ban đầu, tạo thành band có kích thƣớc tƣơng ứng ladder 250 bp 330 bp Do trình bơm mẫu vào giếng giai đọan trộn mẫu thao tác chuẩn nên kích thƣớc band chƣa đề Tuy nhiên với kích thƣớc band tạo tƣơng ứng 580 bp enzyme cho thấy mẫu cắt nấm Beauveria bassiana, vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 Chính vùng mà enzyme Hae III Alu I cắt đƣợc 10 11 12 13 ladder 1.5 kb Alu I Hae III Hình 4.5 Sản phẩm cắt enzyme Hae III Alu I Ghi chú: 1.RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 PULQ2 NNPT7 LADDER RMTĐ3 SR 10 BHBD6 11 BRVT6 12 PULQ2 13 NNPT7 Mẫu enzyme cắt đƣợc điện di 50 V, 250 mA, thời gian 60 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phục hồi đƣợc 12 nguồn nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana côn trùng khác nhau: bọ xít đen, bọ dừa, sâu lúa, rầy nâu tỉnh Tiền Giang, Tây Ninh, Long An, Bến Tre, Quận – Thành phố Hồ Chí Minh, Quận – thành phố Hồ Chí Minh - Sử dụng kỹ thuật PCR cho phép phát vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nấm Beauveria với cặp mồi ITS4 ITS5, thành phần hóa chất chu kỳ nhiệt cụ thể đƣợc hoàn thiện 5.2 Đề nghị - Tiếp tục thu thập, phục hồi phân tích đa dạng di truyền dòng nấm Beauveria bassiana Metarrhizium anisopliae với số lƣợng mẫu lớn từ nhiều địa phƣơng nƣớc nhằm làm phong phú thêm giống chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ tự nhiên Việt Nam Tạo điều kiện phục vụ dắc lực cho Nơng nghiệp nói chung cơng tác bảo vệ thực vật nói riêng - Trong phân tích RFLP, sản phẩm cắt chƣa cho thấy rõ đa hình dịng nấm với Nếu có điều kiện cần tiếp tục hồn thiện đọc trình tự nhiều đối tƣợng khác , từ so sánh với ngân hàng gen giới để biết khác biệt có hƣớng nghiên cứu phù hợp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000 Di truyền phân tử Nhà xuất nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Trang 195 – 231 Tạ Kim Chỉnh, 1996 Nghiên cứu tuyển chọn số chủng vi nấm diệt côn gây hại Việt Nam khả ứng dụng Luận án PTS Viện Công Nghệ Sinh Học – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Quốc Gia, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, 1981 Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Trang 197 – 206 Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000 Vi nấm dùng công nghệ sinh học Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Trang 140 – 145 Trần Quang Hùng, 1999 Thuốc bảo vệ thực vật Nhà xuất nông nghiệp Trang 150 – 155 Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004 Xác định gen gây độc nấm Metarrhizium ký sinh sâu hại trồng kỹ thuật PCR Luận án thạc sĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Trang –30 Võ Thị Thƣơng Lan Sinh học phân tử Đại Học Quốc Gia Hà Nội Trang 159 – 161 Lê Đình Lƣơng, 2001 Nguyên lý kỹ thuật di truyền Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 10 Trần Văn Mão, 2004 Sử dụng vi sinh vật có ích tập II Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Trang 49 – 90 11 Tống Kim Thuần, 2001 Vi sinh vật diệt sâu hại đậu tương triển vọng sử dụng chúng Đồng Bằng Sơng Hồng Tạp chí sinh học 9/2001, 23(3): 22 – 28 12 Phạm Thị Thùy, Ngƣyễn Văn Thiêm, Võ Hiền, 2000 Kết khảo nghiệm chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae để phòng trừ bọ hại dừa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 13 Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997 Bảo vệ trồng chế phẩm từ vi nấm Nhà xuất nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Trang 19 – 44 14 Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết, 2000 Sản suất chế biến sử thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc sinh học Viện Bảo Vệ Thực Vật Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội 15 Nguyễn Ngọc Tú-Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997 Bảo vệ trồng chế phẩm từ vi nấm Nhà xuất Nơng nghiệp TP.Hồ Chí Minh 158 trang TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 16 Bidochka M.J., McDonald M.A., St Leger R.J., and Roberts D.W., 1994 Differentiation of species and strain of entomopathogenic fungi by Random Amplifiction of Polymorphic DNA (RAPD) Current Genetics 25: 107 – 113 17 Charnley A.K., Xia Y., Gao M., and Clarkson J.M.,2002 Molecular cloning, characterisation, and expression of a neutral trehalase frpm the insect pathogenic fungus Metarrhizium anisopliae Journal of invertebrate pathology 80: 127 –137 18 Charnley A.K., and El – Sayed, 1989 A technique for accelerating and synchronising germination of conidia of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae Archives of Microbiology 142: 204 – 206 19 Destéfano R.H.R., Destéfano S.A.L., and Messias C.L., 2004 Detection of Metarrhizium anisopliae var anisopliae within infected sugarcane borer Diatraea saccharalis (Lepidoptera, Pyralidae) using specific primers Genetics and Molecular Biology, 27, 2: 245 – 252 20 Fegan M., Manners J.M., Maclean D.J., Irwin J.A., Samuels K.D., and Holdom D.P., 1993 Random amplified polymorphic DNA markers reveal a high degree of genetic diversity in the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisoliae var anisopliae Gene Microbiol 139 (Pt9): 2075 – 2081 21 Hegedus D.D., and Khachatourians G.G., 1993 Construction of cloned DNA probes for the specific detection of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in grasshoppers Journal of Invertebrate Pathology 62: 233 –240 22 Joshi L., Leger R.J.St., and Roberts D.W., 1997 Isolation of a cDNA encoding a novel subtilisin – like protease (Pr1B) from the LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 enthomopathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae using differential display RT-PCR Gene 197: – 23 Leal S.C.M., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1994 Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae by RAPD – PCR Mycological Research 98: 1077 – 1081 24 Leger R.S.T., Roberts D.W., and Staples R.C., 1999 Molecular cloning of a comlimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi Boyce Thompson Institute for Plant Research, Inc, Ithaca, NY 25 Maria C.V., and Peberdy J.F., 1997 Location of chitinolytic enzymes in protoplasts and whole cells of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae Mycological Research 101 (11): 1393 – 1396 26 Nam Jin – Sik, Lee D.H., Lee K.H., Park H.M., and Bae K.S., 1998 Cloning and phylogenetic analysis of chitin synthase genes from the insect pathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae var anisopliae FEMS Microbiology letters 159: 77 – 84 27 Raymond J., St Leger R.J., Lokesh Joshi, Michael J., and Bidochka, 1995 Protein synthesis in Metarrhizium anisopliae growing on host cuticle Mycological Research 99: 1034 – 1040 28 Soraya C.M.L., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1997 Amplification and restriction endonuclease digestion of the Pr1 gene for the detection and characterization of Metarrhizium strains Mycological research 101 (3): 257 – 265 29 St Leger R.J., May B., Allee L.L., Frank D.C., Staples R.C., and Roberts D.W., 1992 Genetic differences in allozymes and information of infection structures among isolates of the entomopathogenic fugus Metarrhizium anisopliae Journal of Invertabrate Pathology 60: 98 – 101 30 Wang C., Skoroberk A., and Butt T.M., 2003 Concurrence of losing a chromosome and the ability to produce destruxin in a mutant of Metarrhizium anisopliae FEMS Microbiology lettres 226: 373 – 378 31 Bidochka, M J.&Khachatorians, G G (1993) Regulation of extracellular N-acetyl-D-glucosidase production in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana vuille Canadian Journal of Microbiology 39,6-12 32 Riba, G, Bouvier-Fuorcade, I.,and caudal, A (1986) Isoenzyme polymorphisms in Metarrhizium anisopliae (Deute-romycotina, Hyphomycetes) entomogenous fungi Mycopa-thologia 96,161-169 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 33 File://D:\Beauveriathang7\Selection%20of%20Beauveria%20bassiana%20and%20Metarh 8/17/2004 34 Kosir, J M., MacPherson, J.M &Khachatuorians, G G.(1991) Genomic analysis of c Virulent and a less virulent strain of the enthomopathogenic fungus Beauveria bassiana , using restriction fragment length polymorphism Canadian Journal of Microbiology 37,534-541 35 Mugnai, L, Bridge P.D & Evans, H.C (1989) A chemotaxonomic evaluation of genus Beauveria Mycological Research 92,199-209 36 poprawski, T J., Riba, G., Jones, W A & Aioun , A (1988) Variation in isoesterase profiles of geographic population of Beauveria bassiana (Dueteromycotina: Hypomycetes ) isolates from Sitona weevils (Coleoptera:curculiondae) Environmental Entomology 17 , 275-279 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Nghệ Sinh Hoc) Nông Nghiệp đời sống, nên thực đề tài ? ?Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định đa dạng di truyền dòng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria basiana ký sinh côn trùng gây hại? ?? Từ việc xác định. .. luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định đa dạng di truyền hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae Beauveria bassiana? ?? ký sinh côn trùng gây hại ” đƣợc thực từ ngày 20 tháng... VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria