SỬ DỤNG kỹ THUẬT RAPD KHẢO sát sự đa DẠNG DI TRUYỀN của QUẦN THỂ nấm rhizotonia solani gây BỆNH KHÔ vẳn lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizotonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẲN LÚA Nghành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ MINH THƢ Thành phố Hồ Chí Minh -2007- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẰN LÚA Sinh viên thực hiện: GVHD: ThS.TỪ THỊ MỸ THUẬN NGUYỄN THỊ MINH THƢ Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ  Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dƣỡng dục nên ngƣời Con xin cảm ơn gia đình ln chỗ dựa vững cho bƣớc qua khó khăn  Tơi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý Thầy - Cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trƣờng ThS Từ Thị Mỹ Thuận tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh hƣớng dẫn chia sẻ khó khăn thời gian thực khóa luận Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 29 giúp đỡ chia sẻ vui buồn suốt năm học nhƣ thời gian thực tập tốt nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng năm 2007 Nguyễn Thị Minh Thƣ iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Nguyễn Thị Minh Thƣ, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát đa dạng di truyền quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa” Bệnh khô vằn lúa gây nấm R solani đƣợc xem bệnh gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng lúa Sự đa dạng di truyền với phổ kí chủ rộng nấm gây khó khăn cho việc lựa chọn dòng kháng nhƣ việc xây dựng biện pháp phòng trị nấm cách hiệu an tồn cho mơi trƣờng Khảo sát đa dạng di truyền nấm bƣớc cần thiết nhằm hiểu rõ di truyền quần thể nấm cung cấp thêm thông tin cho việc xây dựng phƣơng pháp phòng trị nấm 17 dòng phân lập nấm R solani thu thập từ nhiều tỉnh khác đƣợc li trích DNA thực phản ứng RAPD với primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 Phân tích liệu phản ứng RAPD phần mềm NTYSYSpc chia 17 dòng nấm thành dòng lớn Sơ đồ phân nhóm có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 53 – 89 % cho thấy đa dạng di truyền 17 dịng phân lập nấm R solani Thơng tin nghiên cứu dùng để tăng thêm hiểu biết di truyền dòng nấm R solani làm sở để xây dựng phƣơng pháp phòng trị nấm cách hiệu an tồn cho mơi trƣờng iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY Nguyen Thi Minh Thu, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, 8/2007 “Use RAPD analysis study genetic diversity of Rhizoctonia solani population pathogenic sheath blight in rice” Sheath blight caused by R solani is an important disease on rice This disease is cause of serious damage in rice crop Chosing assistant plant culture and building strategy against this fungi is very difficult because of genetic diversity of R solani isolates So, study genetic diversity is the fisrt step to know about this fungi Therefore, 17 R solani isolates were recognized from several diffirent provinces were extracted total DNA and realize RAPD reaction with three primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 Analysis RAPD data by NTSYSpc software was divided 17 isolates place into two group Rate genetic similarity of these analysis isolate was a range from 53 to 89% Information of study could enhance knowledge about genetic of R solani isolates and to basis to build a method against fungi effect and safe for environment v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3.Giới hạn đề tài Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Giới thiệu nấm Rhizoctonia solani 2.1.1.Đặc điểm hình thái 2.1.2 Đặc điểm sinh lý 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.4 Phạm vi kí chủ nấm Rhizoctonia solani 2.1.5 Sự phân nhóm nấm Rhizoctonia solani 2.2 Bệnh khô vằn hại lúa nấm Rhizoctonia solani gây 2.2.1 Triệu chứng bệnh 2.2.2 Điều kiện phát sinh phát triển bệnh vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.3 Phòng chống bệnh khô vằn 2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng nghiên cứu đa dạng di truyền 2.3.1 Phƣơng pháp RFLP (Retriction Fragment Length Polymorphism) 2.3.2 Phƣơng pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 10 2.3.3 Microsatellite 11 2.3.4 Phƣơng pháp RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA) 11 2.3.4.1 Giới thiệu kỹ thuật RAPD 11 2.3.4.2 Một số vấn đề thƣờng gặp thực phản ứng RAPD 12 2.3.4.3 Những ƣu điểm kỹ thuật RAPD 13 2.3.4.4 Những hạn chế kỹ thuật RAPD 13 2.3.4.5 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 13 2.3.4.6 Những cải tiến kỹ thuật RAPD 14 2.4 Các kết nghiên cứu đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani 14 2.4.1 Những nghiên cứu nƣớc 14 2.4.2 Những nghiên cứu nƣớc 15 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1 Thời gian địa điểm 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.1 Nguồn nấm 16 3.2.2 Những hoá chất đƣợc sử dụng nghiên cứu 16 3.2.2.1 Những hóa chất sử dụng để li trích DNA 16 3.2.2.2 Những hoá chất dùng để thực phản ứng RAPD 16 3.2.2.3 Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD 18 3.2.3 Các dụng cụ thiết bị đƣợc sử dụng nghiên cứu 18 3.2.3.1 Các dụng cụ thiết bị đƣợc sử dụng li trích 18 3.2.3.2 Các dụng cụ thiết bị đƣợc sử dụng phản ứng RAPD 18 3.2.3.2 Các dụng cụ thiết bị dùng điện di 18 3.3 Phƣơng pháp tiến hành 19 3.3.1 Ly trích DNA tổng số nấm R solani 19 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.3.2 Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 19 3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát số lƣợng chu kì phản ứng 20 3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD 21 3.3.3 Thực phản ứng RAPD 23 3.3.4 Điện di sản phẩm RAPD 23 3.3.5 Phân tích kết RAPD 23 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết li trích DNA tổng số nấm R solani 24 4.2 Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 25 4.2.1 Lƣợng DNA mẫu 25 4.2.2 Khảo sát chu kì phản ứng 26 4.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD 26 4.3 Phản ứng RAPD dòng phân lập nấm R solani 29 4.4 Đánh giá đa dạng di truyền dòng phân lập nấm R solani 32 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHẦN 7: PHỤ LỤC 41 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified fragment length polymorphism PDA Potato dextrose agar R solani Rhizoctonia solani RAPD Random amplification polymorphism DNA RFLP Retriction fragment length polymorphism SSR Simple sequense repeat VNTR Variable number tandem repeat ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Bệnh khơ vằn lúa Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số dòng phân lập nấm R solani 24 Hình 4.2 Ảnh điện di DNA dịng phân lập nấm R solani sau pha loãng 25 Hình 4.3.Ảnh điện di sản phẩm RAPD dòng nấm L651 với primer OPM-08 số chu kì khác qui trình nhiệt 26 Hình 4.4.Ảnh điện di sản phẩm RAPD dòng nấm L66 primer OPL-05 với nồng độ MgCl2 primer khác 27 Hình 4.5 Ảnh điện di sản phẩm RAPD dòng nấm L66 primer OPL-05 với nồng độ DNA mẫu Taq khác 28 Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13 .29 Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPL-05 30 Hình 4.8 Ảnh điện di sản phẩm RAPD 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPL-08 30 Hình 4.9 Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) 17 dịng phân lập nấm R solani dựa sản phẩm RAPD với primer OPM-13, OPL-05, OPl-08 32 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 (0,2 mM) đƣợc xác định trƣớc Ở thí nghiệm này, nghiệm thức (Taq: 0,25µl DNA mẫu: 1µl) cho kết tốt Ở nghiệm thức 1, lƣợng Taq (0,2 µl) nên khơng cho sản phẩm Lƣợng Taq q cao ức chế phản ứng, tạo băng sản phẩm Ngồi ra, lƣợng DNA mẫu cao (2 µl) nguyên nhân ức chế phản ứng Nhƣ vậy, nghiệm thức đƣợc lựa chọn để thực phản ứng RAPD dòng phân lập nấm R solani khố luận Sau thực thí nghiệm thu đƣợc thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD tốt Thành phần hoá chất đƣợc trình bày bảng 4.1 đƣợc sử dụng để khảo sát đa dạng di truyền dòng phân lập nấm R solani Bảng 4.1 Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát đa dạng di truyền R solani Hoá chất Nồng độ Thể tích sử Nồng độ gốc dụng CUỐI Buffer 5X µl 1X MgCl2 25 mM µl mM dNTP’S 10 mM µl 0,4 mM primer 10 mM 0,5 µl 0,2 mM Taq polymerase 5U 0.25 µl 1,25 U DNA mẫu 20-50 ng 1µl 20- 50 ng Nƣớc cất 13,25 µl Tổng 25 µl 4.3 Phản ứng RAPD dòng phân lập nấm R solani Sự đa dạng di truyền dòng phân lập nấm R.solani đƣợc khảo sát phản ứng RAPD với primer OPM-13, OPL-05, OPL-08 Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di gel agarose 2% Các đoạn DNA có trọng lƣợng phân tử di chuyển đến vị trí gel Sự khác biệt dòng nấm đƣợc thể khác biệt số lƣợng vị trí băng DNA gel LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm RAPD 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10:L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm RAPD 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 05 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7:ladder, 8: L58, 9: L59, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79 10 11 12 13 14 15 16 17 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Hình 4.8 Ảnh điện di sản phẩm RAPD 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 08 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: ladder, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79 Hình 4.6, 4.7 4.8 cho thấy primer bắt cặp cho sản phẩm tốt với DNA dòng nấm R.solani Với primer OPL-08 OPL05, sản phẩm RAPD tạo nhiều băng đa số băng đa hình có băng đồng hình (primer OPM-13) Các băng có kích thƣớc từ 100 đến 2000 bp Đối với primer OPM-13, số băng không nhiều nhỏ ( 100 đến 800 bp) nhƣng hầu hết băng đa hình Qua hình 4.6, 4.7, 4.8 ngồi băng rõ cịn có số băng bị mờ hình điện di bị nh khơng rõ băng Điều q trình điện di khơng tốt làm cho băng tách khơng rõ Cũng điện cực bị cong Ngoài ra, băng mờ cịn thao tác PCR khơng tốt qui trình chƣa phù hợp làm giảm lƣợng sản phẩm Ngoài ra, tƣơng quan nồng độ chất hỗn hợp phản ứng chƣa thật phù hợp hoàn toàn với với primer khác nguyên nhân quan trọng làm sản phẩm RAPD không đƣợc tốt Primer OPM-13 cho tối đa băng sản phẩm (hình 4.6) Đây primer cho sản phẩm có số băng primer đƣợc sử dụng Tuy nhiên, băng sản phẩm hầu nhƣ đa hình, có băng đồng hình khoảng 300bp Có dịng nấm L61, L66 L72 cho có băng : băng đồng hình băng đa hình Điều đặc điểm di truyền dòng nấm làm hạn chế bắt cặp Tuy vậy, băng đa hình dịng nấm có kích thƣớc khác nên phân biệt đƣợc dòng nấm với với dòng nấm khác đƣợc nghiên cứu khoá luận Băng sản phẩm lớn 800bp xụất dịng nấm L64 Do tiếp tục nghiên cứu primer nhƣ thị phân tử cho dòng nấm L61, L64, L66 L72 Primer OPL-05 cho nhiều băng sản phẩm dòng nấm (hình 4.7) Cao 10 băng Với primer khơng có dịng nấm cho sản LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 phẩm RAPD giống tất băng đa hình Các băng primer tạo có kích thƣớc lớn ( khoảng 250 bp đến kb) Primer OPL-08 cho 11 băng sản phẩm, kích thƣớc khoảng 150 bp đến 1500bp (hình 4.8) Tất băng đa hình Dịng nấm L61 cho băng 350 bp 550 bp, dễ dàng phân biệt dòng nấm với 16 dòng nấm lại Các dịng nấm L55, L56 L58 có sản phẩm RAPD hồn tồn giống Điều cho thấy primer OPL-08 khơng thích hợp làm thị để phân biệt dòng nấm 4.4 Đánh giá đa dạng di truyền dòng phân lập nấm R solani Kết điện di sản phẩm RAPD đƣợc mã hố dạng nhị phân, có băng ghi 1, khơng có băng ghi (Phụ lục ) Số liệu thu đƣợc đem xử lí phần mềm NTSYS 2.1 Kết đƣợc hiển thị theo bảng ma trận tỷ lệ tƣơng đồng (bảng 4.2) sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 Hình 4.9 Sơ đồ phân nhóm 17 dịng phân lập nấm R.solani dựa kết RAPD với primer OPM-13, OPL-05 OPL-08 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Qua hình 4.9 cho thấy tỷ lệ tƣơng đồng di truyền 17 dòng nấm sử dụng nghiên cứu biến thiên từ 53 - 89 % Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) có nhiều nhánh, từ cho thấy có đa dạng di truyền dòng nấm nghiên cứu 17 dòng phân lập nấm R solani đƣợc chia làm nhóm lớn nhƣ sau : Nhóm (N1) gồm dịng nấm : L31, L38 có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 58% Hai dịng nấm có hệ số di truyền, từ thấy di truyền dịng nấm tƣơng đƣơng Nhóm (N2) nhóm lớn gồm 15 dịng nấm có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 56 - 89% Trong nhóm dịng nấm L66 (N2.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp : 56% với dòng nấm lại Điều cho thấy dòng nấm L66 khác biệt so với 14 dòng nấm lại 14 dịng nấm cịn lại (N2.2), chia thành nhóm nhỏ : - N2.1.1 gồm 12 dòng nấm L50, L54, L55, L56, L58, L59, L61, L651, L72, L75, L781 L79 có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 63 - 89% Nhánh chia làm nhiều nhánh nhỏ khác Điều cho thấy dịng nấm có nguồn gốc nhƣng phân chia theo nhiều hƣớng khác để thích nghi với mơi trƣờng sống Dựa vào sơ đồ phân nhóm ta thấy di truyền dịng nấm xa nhau, nhƣ có khả mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật chúng khác - N2.1.2 gồm dịng nấm L63 L64 với tỷ lệ tƣơng đồng 68% Hai dòng nấm chung nhánh nên hệ số tƣơng đồng dòng nấm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 thấp (68%) nhƣng xét tƣơng quan di truyền dịng nấm có quan hệ gần so với tƣơng quan di truyền với 15 dòng nấm lại Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) cịn cho thấy khác biệt dòng nấm phân lập từ vùng địa lí khác Hai dịng nấm L31 (Hải Phòng) L38 (Nghệ An) (N1) thu thập từ miền Bắc Bắc Trung có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp với 15 dòng phân lập lại đƣợc thu thập miền Trung, miền Nam Tây Ngun Điều khí hậu miền Bắc Bắc Trung có mùa rõ rệt thƣờng có mùa đơng lạnh nên dòng nấm tự biến đổi nhằm phù hợp với vùng địa lí sinh sống Trong 15 dịng phân lập nấm R solani lại đƣợc thu thập từ miền Trung (L54, L55, L56, L58), Tây Nguyên (L50, L59, L63) miền Nam (8 dịng cịn lại) dịng nấm phân lập từ Tây Ngun có quan hệ gần với dòng đƣợc phân lập từ miền Trung (tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 65-84%), ngoại trừ dịng L63 (Lâm Đồng) có tƣơng quan di truyền gần với dòng L64 (Vũng Tàu) thu thập miền Đơng Nam (hình 4.9) Điều cho thấy dòng phân lập nấm R solani đƣợc thu thập vùng địa lí lân cận có tƣơng quan di truyền gần 12 dịng phân lập miền Trung, Tây Nguyên miền Nam (N2.1.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 64% chia làm nhóm nhỏ sơ đồ phân nhóm Hai nhóm có chung gốc Điều chứng tỏ dòng phân lập nấm R solani miền Trung, Tây Nguyên miền Nam có chung nguồn gốc nhƣng tiến hoá theo hai hƣớng khác để phù hợp với mơi trƣờng Các dịng phân lập nấm R solani miền Nam phân thành nhóm rõ rệt với tỷ lệ tƣơng đồng 67% cho hai miền Đông Nam Tây Nam Các dòng nấm phân lập tỉnh Tây Nam (L72, L75, L781, L79) có di truyền gần với tỷ lệ tƣơng đồng di truyền lên đến 76% (hình 4.9) Trong đó, dịng nấm phân lập từ tỉnh vùng Đơng Nam (L61, L64, L651, L66) có tỷ lệ tƣơng đồng thấp, khoảng 66% Hơn nữa, hai dòng nấm L64 L66 có hệ số tƣơng đồng thấp (56 66%) tách biệt khỏi nhóm dòng phân lập nấm thu thập từ miền Trung miền Nam sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) Điều LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 cho thấy có phát sinh dịng nấm để phù hợp với thay đổi môi trƣờng Ngồi ra, dịng phân lập nấm R solani cho thấy khác biệt dòng nấm thu thập từ vùng đất cao thấp Tỷ lệ tƣơng đồng di truyền dòng nấm L50 (thu thập Daklak) L781 (thu thập Sóc Trăng) có 49% Hay tỷ lệ tƣơng đồng dòng phân lập R solani thu thập Lâm Đồng (L63) dịng nấm thu thập Sóc Trăng (L781) có 49% Điều khác biệt khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ cách canh tác vùng Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (bảng 4.2) cho thấy : dòng phân lập nấm R.solani tỉnh gần thƣờng gần giống Ví dụ dịng phân lập R solani thu thập từ Bạc Liêu Sóc Trăng có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền cao: 89% tƣơng quan di truyền gần (hình 4.9) Hay dịng phân lập R solani thu thập từ Bình Định Quãng Ngãi có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 84% Điều cho thấy dòng phân lập nấm R solani vùng lân cận có di truyền tƣơng tự Nhƣ vậy, có khả đáp ứng với biện pháp phòng trừ dòng nấm vùng lân cận tƣơng tự Điều giúp cho việc đƣa biện pháp phòng trừ nấm bệnh cách tốt Trong 17 dòng nấm phân lập dùng nghiên cứu có dịng nấm L66 thu thập Tân Châu, Tây Ninh có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất, khoảng 56% Điều cho thấy Tân Châu xuất dịng nấm để thích nghi với biện pháp phịng trừ nấm bệnh Do đó, cần phải nghiên cứu thêm dịng nấm để đƣa biện pháp phòng trừ hữu hiệu Nhƣ vậy, phân tích liệu RAPD cho thấy đa dạng di truyền 17 dòng phân lập nấm R solani khoá luận Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng sơ đồ phân nhóm cho thấy mối quan hệ di truyền dòng nấm Các dòng nấm đƣợc thu thập vùng gần có tƣơng quan di truyền gần ngƣợc lại, dòng thu thập tỉnh xa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 tƣơng quan di truyền xa Ngồi ra, dịng nấm thu thập từ vùng có điều kiện khí hậu khác có tƣơng quan di truyền xa Với phổ kí chủ rộng, nấm R solani dễ dàng lây truyền bệnh cho vùng đất nông nghiệp lân cận với vùng lúa bị bệnh Các nhà khoa học chứng minh đƣợc có đến 188 loại thuộc 32 họ kí chủ dòng nấm R solani gây bệnh lúa Khi điều kiện không thuận lợi cho sống sinh sản, R solani tồn lƣu đất nhiều năm chờ điều kiện thuận lợi biến đổi để phù hợp với mơi trƣờng sống Chính biến đổi đa dạng gây khó khăn lớn cho việc phịng trị nấm Do đó, cần phải nghiên cứu nhiều di truyền dòng nấm để xây dựng chiến luợc phịng trị nấm thực hiệu an toàn cho môi trƣờng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Li trích thành cơng DNA tổng số 17 dòng phân lập nấm R solani - Xây dựng đƣợc qui trình RAPD tốt dùng để phân tích đa dạng di truyền dịng phân lập nấm R solani - Dự liệu phản ứng RAPD với primer OPL-05, OPL-08 OPM13 17 dòng phân lập nấm R solani gây bệnh khơ vằn lúa có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 53% - 89% 5.2 Đề nghị - Tăng số lƣợng mẫu phạm vi lấy mẫu để có kết khái quát - Tăng số primer sử dụng phản ứng RAPD nhằm đạt đƣợc kết xác - Tiếp tục tối ƣu hố phản ứng RAPD cho dòng phân lập nấm R solani LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Chƣơng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử : Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Đƣờng Hồng Dật, 1976 Sổ tay bệnh hại trồng tập NXB Nông Thôn, Việt Nam Lê Văn Huy, 2006 Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm Corenespora cassiicola (Berk & Curt) Wei gây bệnh cao su (Hevea Brasiliensis Muell Arg.) trại thực nghiệm Lai Khê, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam kĩ thuật RAPD Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Thị Huệ, 2003 Khảo sát số đặc tính đánh giá đa dạng mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ số kí chủ khác Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Thị Lang, 2002 Phƣơng pháp nghiên cứu công nghệ sinh học NXB Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu phòng trừ bệnh đốm vằn lúa hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani ruộng lúa nƣớc Đồng Tháp Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Nguyễn Đức Lƣợng, 2001 Công nghệ sinh học NXB đại học quốc gia, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đức Lƣợng ctv., 2002 Công nghệ gen NXB đại học quốc gia, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Vũ Triệu Mân Lê Lƣơng Tề, 1998 Giáo trình bệnh Nông Nghiệp NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam 10 Nguyễn Minh Nguyệt, 2003 Khảo sát số đặc tính nấm Rhizoctonia solani phân lập từ (Gossypium sp.) bắp (Zea may L.) Luận văn tốt nghiệp ngành Nông học Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 11 Ou S H., 1983 Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch) NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam 12 Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005 Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều ký chủ khác Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Tiếng Anh 13 Carling D.E and Sumner D.R., 1992 Rhizoctonia spp 157-165 In: Singlton L., Mihail J.D and Rush C.M (eds), Methods for research on soilborne phytopathogenic fungi APS Press, St Paul, Minnesota 14 Ducan S, Barton JE and O’Brien PA, 1993 Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay Mycologycal Research 97, 1075-1082 15 Fenille R C., Ciampi M B., Kuramae E E., and Souza N L., 2003 Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences Fitopatol bras vol 28 16 Hsiang T and Dean J D., 2001 DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua International turfgrass society 9: 674-678 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 17 Hugh G.Griffin, 1994 PCR Technology current innovations CRC Press, Boca Raton , Ann Arbor, London, Tokyo 179-209 18 Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997 Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani Curr Genet 32: 237 – 243 19 Kurt W., Hilde N., Kirsten W and Weiland M., 1995 DNA fingerprinting in plant and fungi CRC Press 322p 20 Lee S.B., and Taylor J.W., 1990 Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo p 70-71 21 Liu Z L Sinclair J B., 1992 Genetic diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group Phytopathology 82: 778 – 787 22 Liu Z L Sinclair J B., 1993 Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozyme comparisions Canadian Journal of Plant Phathology 15: 272 – 280 23 Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y and Matsuyama N., 1996 RFLP analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani Mycoscience 37: 351 – 356 24 Mayee C.D., Monga D., Sharma T.R., Rathore S.S, 2004 Differentiation of isolates of cotton root rot pathogens Rhizoctonia solani and R bataticola using pathogenicity and RAPD markers Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 135-139 Wedsite 25 www.cabi.org 26 www.mard.gov.vn 27 www.ppd.gov.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 28 http://library.uws.edu.au/adt-NUWS/uploads/approved/adtNUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf 29 www Cababstarctsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722 30 http://www.doaj.org/doaj?func=abstract&id=44178&toc=y Chƣơng PHỤ LỤC Bảng 7.1 Bảng số liệu mã hoá sản phẩm RAPD trƣớc xử lí phần mềm NTYSYS L31 L38 OPM-13 0 1 1 0 1 OPL-05 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 OPL-08 0 0 L50 L54 L55 L56 L58 L59 L61 L63 L64 L651 L66 L72 L75 L781 L79 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... ? ?Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát đa dạng di truyền quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa? ?? Bệnh khô vằn lúa gây nấm R solani đƣợc xem bệnh gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng lúa Sự. .. nấm cách hữu hiệu, thực đề tài : “ Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát đa dạng di truyền quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa? ?? 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu Khảo sát đa. .. NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ NẤM Rhizoctonia solani GÂY BỆNH KHÔ VẰN LÚA Sinh viên thực hiện: GVHD: ThS.TỪ THỊ MỸ