ĐÁNH GIÁ BIẾN LƯỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI cây CAO SU của tổ hợp LAI PB260 x RO44 268 BẰNG kỹ THUẬT RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC - o0o - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC CHINH Tháng 08/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 X RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ PHẠM NGỌC CHINH ThS LẠI VĂN LÂM Khóa: 2003-2007 KS TRẦN THANH Tháng 08/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực tập hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp TS Bùi Minh Trí, ThS Lại Văn Lâm KS Trần Thanh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận KS Vũ Thị Quỳnh Chi có dẫn, động viên giúp tơi thực tốt khóa luận ThS Lê Mậu Túy/ Trưởng Bộ Môn Giống Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam cô chú, anh chị cán công nhân viên Bộ Môn Giống/Viện Nghiên Cứu Cao Su nhiệt tình giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực tập Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam Những người bạn giúp đỡ nhiều suốt năm học thời gian thực tập tốt nghiệp Và xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dưỡng dục nên người, để ngày hôm iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT PHẠM NGỌC CHINH, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 x RO44/268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD “ Giáo viên hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ ThS LẠI VĂN LÂM KS TRẦN THANH Cây cao su cơng nghiệp có hiệu kinh tế cao, ổn định góp phần cải thiện kinh tế, xã hội mơi trƣờng Chính vậy, cơng tác cải tiến giống để phục vụ nhu cầu phát triển cao su quan trọng Tuy nhiên, giới hạn nguồn gen nƣớc châu Á gây trở ngại cho công tác chọn tạo giống cao su Để khắc phục trở ngại nay, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đƣa nguồn gen cao su từ vùng địa Amazon vào chƣơng trình lai tạo giống Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu biến lƣợng, đặc điểm di truyền lai để tạo nguồn tƣ liệu giúp cải tiến chƣơng trình tạo tuyển giống cao su với nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon Những kết đạt đƣợc: - Kết thí nghiệm primer cho quy trình phản ứng RAPD nhận thấy Primer A18 có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%) tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại, primer OPB12 có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) tổng số 12 băng đƣợc khuếch đại - Kết phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa số DICE 20 lai tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976 Giá trị có nghĩa khoảng cách di truyền lai quần thể biến thiên từ 0,024 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đến 0,478 Kết cho thấy quần thể lai tổ hợp PB260 x RO44/268 có biến lƣợng di truyền rộng - Kết phân nhóm di truyền dựa liệu RAPD cho thấy chƣa có mối liên hệ đƣợc phát đặc tính nơng học (sinh trƣởng sản lƣợng) marker RAPD thông qua primer A18 OPB12 Qua kết trên, bƣớc đầu cho thấy marker RAPD phản ánh đƣợc biến lƣợng di truyền quần thể lai tổ hợp PB260 x RO44/268 Kết đề tài góp phần tạo tƣ liệu nghiên cứu di truyền nhằm nhằm sử dụng hiệu nguồn di truyền Amazone vào chƣơng trình cải tiến giống cao su Hevea v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT .iv MỤC LỤC .vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.3 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU 2.1.1 Nguồn gốc phân bố tự nhiên 2.1.2 Sự phân bố sản xuất cao su giới 2.1.3 Đặc điểm sinh học cao su 2.1.4 Một số đặc điểm di truyền cao su 2.1.5 Quá trình cải tiến giống cao su 2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ 11 2.2.1 Chỉ thị hình thái 11 2.2.2 Chỉ thị isozyme 11 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.3 Chỉ thị DNA 12 2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 12 2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 12 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) 13 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 13 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 13 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 14 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU19 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 3.1.1 Vật liệu di truyền 21 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm 21 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA 21 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng kỹ thuật RAPD 21 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 22 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 22 3.2.1 Thời gian nghiên cứu 22 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 22 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ly trích DNA 22 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng độ tinh DNA mẫu 23 3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA 24 3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khuếch đại 24 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết 24 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25 4.1 LY TRÍCH DNA 25 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.1.1 Định tính DNA mẫu phƣơng pháp điện di gel agarose 25 4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical Density) 26 4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD 26 4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 27 4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER 29 4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI 29 4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI 34 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 37 5.1 KẾT LUẬN 37 5.2 ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 43 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair Ctv: cộng tác viên DNA: Deoxyribonuleotide acid dNTP: 2’- dideoxynucleotide - 5’- triphosphate Kb: kilo base NTSYSpc: Numercial Taxonomy System OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA SSR: Simple Sequence Repeat (microsatellite) STS: Sequence-Tagged Sites SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism Taq: Thermus aquaticus UPGMA: Unweighted pair group method using arithmetic average UV: Ultra violet VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam SALB: South American Leave Blight ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Tỷ lệ nồng độ hóa chất tham gia phản ứng RAPD 27 Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD 27 Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại primer 29 Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại lai nghiên cứu 30 Bảng 4.5: Hệ số tƣơng đồng di truyền lai nghiên cứu 31 Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền lai với mẹ (PB260) bố (RO44/268) chúng 32 Bảng 4.7: Các băng DNA xuất bố lai 33 Bảng 4.8: Các băng DNA xuất mẹ lai 33 Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng sản lƣợng lai 35 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng sản lƣợng lai nghiên cứu Con lai Ký hiệu Trung bình sinh trƣởng cm % ĐC Phân cấp 11 115.24 12.2 127.7 9.9 102.99 10.6 110.82 12.7 132.39 10.1 105.22 12.7 132.57 11.3 118.37 12.2 127.35 11.5 120.39 10.7 111.34 10.7 112.04 12.4 129.09 11.3 118.37 13.5 140.92 11.6 121.26 10.9 114.13 12 125.68 11.8 123.59 11.9 124.43 LH03/069 148 LH03/011 149 LH03/018 150 LH03/011 151 LH03/033 152 LH03/075 153 LH03/037 155 LH03/072 158 LH03/037 159 LH03/017 160 LH03/022 161 LH03/054 162 LH03/022 163 LH03/051 164 LH03/044 165 LH03/022 166 LH03/053 167 LH03/051 168 LH03/022 169 LH03/022 170 Nguồn: Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam Trung bình sản lƣợng Gam % ĐC Phân cấp 0.021 5.59 0.056 14.49 0.313 81.64 1.302 340.03 0.005 1.26 0.35 91.38 0.001 0.26 0.001 0.26 0.028 7.4 1.402 366.01 0.019 4.96 0.421 109.97 0.001 0.26 0.001 0.26 0.046 11.92 0.003 0.87 0.014 3.57 0.001 0.26 0.002 0.47 0.151 39.32 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LH03/0695 LH03/0370 LH03/0115 LH03/0181 LH03/0723 LH03/0225 LH03/0371 LH03/0222 LH03/0548 LH03/0531 LH03/0515 LH03/0514 LH03/0228 LH03/0227 LH03/0446 LH03/0226 LH03/0179 LH03/0114 LH03/0338 LH03/0752 LH03/0695 0.64 0.72 0.81 Similarity coefficient 0.89 0.98 Hình 4.3: Phân nhóm di truyền lai đƣợc thiết lập dựa sở liệu phân tích RAPD, sử dụng phƣơng pháp phân tích cluster UPGMA Kết phân nhóm cho thấy chƣa có mối liên hệ đƣợc phát đặc tính nơng học (sinh trƣởng sản lƣợng) marker RAPD thông qua primer A18 OPB12 Điều nói lên với việc sử dụng primer A18 OPB12, marker RAPD chƣa thể nhận diện đƣợc đặc tính sinh trƣởng sản lƣợng cao su giai đoạn tuyển non Với primer đƣợc sử dụng phân tích RAPD khơng thể phủ hết tồn bộ gen đối tƣợng nghiên cứu Việc sử dụng nhiều primer khuếch đại đƣợc nhiều vùng trình tự gen hơn, nhƣ cho phép tìm đƣợc marker đặc hiệu liên kết với tính trạng số lƣợng 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Quy trình ly trích DNA chu trình nhiệt thực phản ứng RAPD Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam đáp ứng đƣợc yêu cầu hàm lƣợng DNA nhƣ thực thành công phản ứng khuếch đại DNA marker RAPD Kỹ thuật RAPD bƣớc đầu cho phép đánh giá biến lƣợng di truyền quần thể lai tổ hợp PB260 x RO44/268 Trong tổng số 24 băng DNA đƣợc phát hai primer có đến 21 băng đa hình (chiếm tỷ lệ 87,5%), primer A18 có 10/12 băng đa hình với tỉ lệ 83,33%, primer OPB12 có 11/12 băng đa hình chiếm tỉ lệ 91,67% Biến lƣợng di truyền quần thể lai tổ hợp PB260 x RO44/268 rộng Tổng số băng DNA đƣợc phát lai dao động từ 11 đến 22 băng tổng số 24 băng phát Khoảng cách di truyền quần thể lai biến thiên từ 0,024 (đƣợc tìm thấy lai LH03/0227 LH03/0228) đến 0,478 (đƣợc tìm thấy lai LH03/0338 LH03/0370) Marker RAPD với hai primer A18 OPB12 phản ánh đƣợc biến lƣợng di truyền quần thể lai tổ hợp PB260 x RO44/268 Qua kết phân tích phân nhóm (cluster analysis) nhận thấy rằng: sử dụng marker RAPD với hai primer A18 OPB12 không nhận diện đƣợc khác biệt di truyền lai có thành tích sinh trƣởng sản lƣợng khác 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5.2 ĐỀ NGHỊ Sử dụng marker RAPD công tác kiểm tra biến lƣợng di truyền quần thể lai chƣơng trình lai tạo giống cao su Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam Bên cạnh primer A18 OPB12, cần mở rộng phân tích RAPD nhiều primer khác nữa, nhằm đánh giá biến lƣợng di truyền cách xác Tăng số lƣợng lai tổ hợp lai nguồn di truyền Wickham Amazone để khai thác tốt biến lƣợng di truyền quần thể lai Cần mở rộng thêm tổ hợp lai nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon nguồn di truyền Wickham truyền thống, nhằm bƣớc cải thiện gi ới h ạn nguồn di truyền Wickham nhƣ bƣớc khắc phục tƣợng xói mịn gen cơng tác lai tạo giống cao su 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp Lê Thị Thanh Tuyền, 2005 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne phương pháp marker phân tử Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành công nghệ sinh học Đại học Nông lâm Tp HCM Lê Duy Thành, 2000 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 159 trang Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng.1997 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng 2000 Sinh học phân tử Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Nguyễn Hoàng Luân, 2002 Phân nhóm di truyền theo isozyme cho tập đồn giống cao su vườn Lai hoa Lai Khê 2002 Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học mở - Bán Công Tp.HCM Nguyễn Quỳnh Anh, 2005 Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Anacardium occidental L.) tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật RAPD AFLP Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Nông lâm Tp.HCM Nguyễn Thị Huệ, 1997 Cây cao su kiến thức tổng quát kỹ thuật nông nghiệp Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu Công nghệ sinh học Nhà xuất Nông nghiệp 10 Phạm Hải Dƣơng, 2002 Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Trƣờng Đại Học Huế 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 11 Trần Thanh, Lại Văn Lâm, Vũ Thị Quỳnh Chi Lê Mậu Túy 2006 Báo cáo kết năm 2006 đề tài Nghiên cứu đa dạng di truyền quỹ gen cao su kỹ thuật RAPD – PCR Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam 12 Trần Thanh Lê Thị Thùy Trang, 2004 Báo cáo kết khóa tập huấn kỹ thuật sinh học phân tử trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam 13 Trần Thị Thuý Hoa, 1998 Luận án Tiến sỹ khoa học nông nghiệp Trƣờng Đại học Nông lâm TP.HCM 14 Võ Thị Thu Hà, 1996 Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học Trƣờng Đại học Tổng hợp TP.HCM TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 15 An Zewei, Cheng Han, Sin Aihua, Fang Jialin and Huang Huasun Identification of rubber clones by RAPD markers International Natural Rubber Conference in India, 2005 Preprints papers, pp 88-92 16 Lai Van Lam et al., 2006 Potential of the IRRDB’81 germplasm in Hevea breeding program International Rubber Conference, 349-362, November 2006, Ho Chi Minh City, Vietnam 17 Lai Van Lam, Vu Van Truong, Le Mau Tuy and Tran Thanh, 2005 Wood potentials of the IRRDB’81 Hevea Germplasm Second workshop on Rubber wood, Croping and Research, 25-27 May 2005 - RWCR Bangkok, Thai Lan 18 Lekawipat N., Teerawatanasuk K., Rodier-Goud M., Seguin M., Vanavichit A., Toojinda T and Tragoonrung S (2003) Genetic Diversity Analysis of Wild Germplasm and Cultivated Clones of Hevea brasiliensis Muell Arg by Using Microsatellite Markers Journal of rubber research 6: 36-47 19 Lespinasse D, Rodier-Goud M, Grivet L, Leconte A, Legnate and Seguin M (2000a) A saturated genetic linkage map of rubber tree (Hevea spp.) 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com based on RFLP, AFLP, microsatellite, and isozyme markers.Theoretical and applied genetic 100:975-984 20 Nei M & Li W.H (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of retriction endonucleases Proc Natl Acad Sci., USA, 76: 5269-5273 21 Seguin M., Gay C., Xiong T.C., Rodier-Goud M (2001) Microsatellite markers for genome analysis of rubber tree (Hevea spp.) Proceedings IRRDB Symposium 2001 – Biotechnology & Rubber Tree – Montpelier, France 22 Sumarmadji & Darmono T.W (2004) Country report, Indonesia In: Chow K.S and Yeang H.Y (eds) Report on the International Rubber Research and Development Board, Biotechnology Workshop, Sungei Buloh, Malaysia, 9-11 Feb 2004, pp 22-30 23 Tran Thi Thuy Hoa, 2006 Supports of the Vietnam Rubber Association for Rubber Industry International Rubber Conference, 515-521, November 2006, Ho Chi Minh City, Vietnam 24 Varghese Y.A., Knaak C., Sethuraj M.R and Ecke W (1997) Evaluation of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in Hevea brasiliensis Plant Breeding 116:47-52 25 Venkatachalam P., Thomas S., Priya P., Thanseem I., Saraswathyamma C.K and Thulaseedharan A (2002) Identification of DNA polymorphism among clones of Hevea Brasiliensis Muell Agr Using RAPD analysis Indian Journal of Natural Rubber Research 15: 172-181 26 Venkatachlam, P., Sailasree, R., Priya, P., Saraswathyamma, C K and Thulaseedaran, A., (2001) Identification of a DNA marker associated with drawf trait in Hevea brasiliensis (Muell.) Arg through random 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com amplified polymorphic DNA analysis Proceedings IRRDB Symposium 2001-Biotechnology & Rubber tree-Montpellier, France 27 Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de Lee T, Horners M, Frijter A, pot A, Peleman J, Kuiper M, and Jabeau M (1995) AFLP: A new technique for DNA Fingerprinting Nucleic Acid Research 23: 4407 4414 28 William JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA and Tingey SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids research 18: 6531 – 6535 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình tách chiết DNA cao su điều kiện Việt Nam Cân 0,2 g tƣơi rửa sạch, cho vào cối, nghiền mẫu với 1,3 ml dịch trích DNA (DNA extraction buffer, pH = 8)  Thêm vào 500 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), vortex 1.400 vòng 10 phút, ly tâm 10.000 vòng phút 10oC  Chuyển lấy dịch bên Thêm vào 500 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), vortex 1.400 vòng 10 phút, ly tâm 10.000 vòng phút 10o C Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 0,8 µl RNase (nồng độ: 10mg/ml), ủ 37oC  Thêm vào 250µl dung dịch Isopropanol lạnh Để tủa -20oC qua đêm  Lấy phần dịch nghiền cho vào eppendorf (loại 1,5ml), vortex kỹ, đem ủ 65oC 45 phút  Ly tâm 10.000 vòng phút 10oC Đổ bỏ dịch  Thêm vào 300 µl TE 1X, ủ 37 oC  Thêm vào 20 µl Sodium acetate 3M 640 µl Ethanol 96%, trộn đặt nhiệt độ -20oC 30 phút  Ly tâm 10.000 vòng 10 phút 10oC, đổ bỏ phần dịch  Rửa kết tủa với 400 µl Ethanol 70% cách ly tâm 10.000 vòng phút 10oC, đổ bỏ phần dịch  Rửa kết tủa lần với 400 µl Ethanol 70% cách ly tâm 10.000 vòng phút 10oC, đổ bỏ phần dịch trong, để khơ kết tủa hịa tan kết tủa 100 µl TE 1X (tùy theo hàm lƣợng DNA thu đƣợc), ủ 37oC 30 phút  Bảo quản mẫu DNA thu đƣợc điều kiện 4oC 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 2: Kết kiểm giá trị OD mẫu DNA ly trích Ký hiệu Con lai 148 149 150 151 152 153 155 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 229 LH03/0695 LH03/0115 LH03/0181 LH03/0114 LH03/0338 LH03/0752 LH03/0370 LH03/0723 LH03/0371 LH03/0179 LH03/0225 LH03/0548 LH03/0226 LH03/0515 LH03/0446 LH03/0222 LH03/0531 LH03/0514 LH03/0228 LH03/0227 PB260 RO44/268 OD260 Lần 0.277 0.659 0.348 0.844 0.539 0.817 0.246 0.533 0.559 0.204 0.529 0.09 0.312 0.489 0.13 0.063 0.645 0.357 0.065 0.315 0.356 0.784 Lần 0.277 0.66 0.348 0.844 0.539 0.817 0.246 0.534 0.561 0.204 0.529 0.092 0.313 0.489 0.131 0.063 0.645 0.357 0.066 0.316 0.356 0.784 Lần 0.277 0.66 0.348 0.844 0.539 0.817 0.247 0.534 0.561 0.204 0.529 0.091 0.314 0.489 0.131 0.064 0.646 0.358 0.066 0.316 0.357 0.784 OD280 Lần 0.156 0.369 0.205 0.591 0.297 0.452 0.148 0.3 0.326 0.126 0.296 0.057 0.174 0.274 0.081 0.04 0.359 0.207 0.043 0.184 0.208 0.432 OD260/OD280 Lần 0.156 0.37 0.205 0.59 0.297 0.452 0.148 0.301 0.327 0.125 0.297 0.059 0.175 0.274 0.081 0.04 0.359 0.207 0.043 0.184 0.208 0.432 Lần 0.156 0.37 0.204 0.591 0.297 0.452 0.149 0.301 0.327 0.126 0.297 0.058 0.175 0.274 0.081 0.041 0.359 0.208 0.044 0.185 0.209 0.433 1.78 1.78 1.7 1.43 1.81 1.81 1.66 1.77 1.72 1.62 1.78 1.57 1.79 1.78 1.61 1.57 1.8 1.72 1.52 1.71 1.71 1.81 DNA (ng/µl) 1192.54 2846.69 1466.64 3214.18 2344.32 3546.85 1025.59 2297.11 2371.98 839.07 2282 367.23 1353.37 2110.3 535.6 255.7 2794.41 1516.24 259.61 1335.16 1506.25 3408.71 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LH03/0695 LH03/0115 LH03/0181 LH03/0114 LH03/0338 LH03/0752 LH03/0370 LH03/0723 LH03/0371 LH03/0179 LH03/0225 LH03/0548 LH03/0226 LH03/0515 LH03/0446 LH03/0222 LH03/0531 LH03/0514 LH03/0228 LH03/0227 Phụ lục 3: Bảng mã hoá băng DNA lai 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 4: Giao diện phần mềm NTYSYSpc 2.1 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 5: phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền phần mềm NTSYSpc 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 6: Phân nhóm di truyền lai vẽ phân loài SAHN 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 7: Bản đồ vùng phân bố giống cao su Wickham giống cao su Amazone Wickham RO/C AC/T MT/C AC/S AC/X AC/F AC/B MT/IT RO/J RO/A RO/PB MT/A RO/CM Natural distribution of Hevea brasiliensis MT/VB Extension of the Hevea genus 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... tài ? ?Đánh giá biến lƣợng di truyền quần thể lai cao su tổ hợp lai PB260 x RO44/ 268 kỹ thuật RAPD? ?? 1.2 MỤC TIÊU – YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu Đánh giá biến lƣợng di truyền lai tổ hợp PB260 x RO44/ 268. .. 8/2007 “ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI PB260 x RO44/ 268 BẰNG KỸ THUẬT RAPD “ Giáo viên hƣớng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ ThS LẠI VĂN LÂM KS TRẦN THANH Cây cao su. .. nhằm đánh giá biến lƣợng di truyền cách x? ?c Tăng số lƣợng lai tổ hợp lai nguồn di truyền Wickham Amazone để khai thác tốt biến lƣợng di truyền quần thể lai Cần mở rộng thêm tổ hợp lai nguồn di truyền