VACCINE PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC F G VACCINE PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN Leptospira Giáo viên giảng dạy: PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên: Trần Nam Trung Lớp: DH06SH MSSV: 06126172 1    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I Đặt Vấn Đề Leptospirosis bệnh Leptospira interrogans gây Bệnh xảy tất lồi thú Nó bệnh nội vùng lây lan quan trọng thú người Bệnh gây nhiễm trùng máu, viêm thận kẽ, vàng da xuất huyết sẩy thai hầu hết loài, đồng thời nguyên nhân gây viêm vú bị bệnh viêm mắt có tính chu kỳ ngựa (Blood, 1989) Theo chuyên gia nghiên cứu Leptospira bệnh có tất nơi giới, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi ảnh đến sức khỏe người nhiều quốc gia, đặc biệt nước vùng nhiệt đới (Adolf Weil, 1886; Blood, 1989; Epstein, 1995; Trevejo, 1998; Ko, 1999) Bệnh Leptospirosis khó tiêu diệt đa dạng nguồn nhiễm, động vật ao hồ, động vật hoang dã đặc biệt động vật ni gia đình, đồng thời Leptospira tồn lâu mơi trường tự nhiên Đặc biệt bệnh khó kiểm sốt nước nông nghiệp phát triển (kéo theo đàn gia súc đơng đúc) có tình trạng vệ sinh mơi trường (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển) Tại Việt Nam, bệnh lâu ý mặt pháp luật nhận thức nhân dân Việc mua bán gia súc bừa bãi không kiểm tra chặt chẽ mặt thú y làm cho nguy nhiễm bệnh gia súc ngày tăng, đồng thời nguy lây nhiễm sang người tăng theo Do đó, nguy nhiễm bệnh Leptospirosis Việt Nam tăng cao Như nói trên, việc điều trị bệnh khó khăn nên cần có biện pháp phịng ngừa bệnh có hiệu cao Cho nên sản xuất vaccine phòng bệnh vi khuẩn Leptospira yêu cầu cấp thiết 2    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II Tổng Quan Leptopira 1.1 Lịch sử phát bệnh Bệnh Leptospira interrogans gây phát vào năm 1850 chó Stuttgart (Đức) Năm 1886, Adolf Weil Heidelberg (Đức) mô tả dấu hiệu lâm sàng bệnh sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất đột ngột kèm theo sốt, lách to, vàng da viêm thận Năm 1916, người ta phát L Icterohaemorrhagiae serovar Leptospira interrogans gây bệnh Weil Nhật Bản Inada cộng (1918) phát serovar L Hebdomadis gây sốt ngày Nhật Bản ông thấy chủng L Autumnalis gây sốt mùa thu Nhật Bản vào năm 1925 Theo Blood (1989), bò Úc Anh nhiễm chủ yếu L Hardjo serovar nguyên nhân gây sẩy thai bị (Ellis, 1982) Những nghiên cứu tìm thấy hàng loạt serovars khác Leptospira: L Pyrogenes L Bataviae phát Indonesia năm 1923 1926; L Grippotyphosa Liên Xô năm 1928; L Canicola Hà Lan năm 1933; L Sejroe Đan Mạch năm 1939… Đến nay, người ta phát 200 serovars khác Leptospira interrogans khắp nơi giới (Terpstra, 2002) Tại Việt Nam, bệnh Ragiot Souchard phát lần người năm 1931 Sau đó, xảy vụ dịch Lai Châu (1964) gây thiệt hại nhiều gia súc nhiễm cho người (Trần Thanh Phong, 1996) Đến nay, bệnh có tất vùng miền nước 1.2 Tổng quát Leptospira Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn, gọi Leptospirosis Đây bệnh lây nhiễm truyền từ động vật sang người Bệnh bắt đầu sốt, làm suy yếu thận, xuất huyết phổi, tác động đến gan (gây vàng da) nhiều triệu chứng khác Căn bệnh tác động đến hàng chục triệu người năm đặc biệt cao khu vực nhiệt đới Do tính đa dạng triệu chứng, bệnh Leptospira khó chẩn đốn nên tỉ lệ tử vong số vùng lên đến 20%-25% Năm 1886, Weil (người Đức) phát bệnh Leptospirosis người lần đầu tiên; đến năm 1915, nhà khoa học Nhật Bản Pháp tìm thấy xoắn khuẩn L interrogans Về phân loại Leptospira thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira (Noguchi., 1917) Các lồi gồm có:L alexanderi, L biflexa, L broomii, L borgpetersenii, L fainei, L inadai, L interrogans, L kirschneri, 3    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com L licerasiae, L meyeri, L weilii, L noguchii, L santarosai, L wolbachii, L kmetyi, L wolffii, L genomospecies 1, L genomospecies 3, L genomospecies 4, L genomospecies Trong số đó, người ta phân thành lồi gây bệnh, khơng gây bệnh lồi trung gian Các loài gây bệnh Leptospira interrogans Leptospira kirschneri Leptospira noguchii Leptospira alexanderi Leptospira weilii Leptospira genomospecies Leptospira borgpetersenii Leptospira santarosai Leptospira kmetyi Các loài trung gian Leptospira inadai Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira licerasiae Leptospira wolffii Các lồi khơng gây bệnh Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genomospecies Leptospira genomospecies Leptospira genomospecies Đặc điểm sinh vật học 4    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình thể: mảnh, đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm Quan sát kính vi khuẩn đen thấy vi khuẩn di động mạnh Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana-Tribondeau phát vi khuẩn, vi khuẩn nhìn thấy mảnh sợi tóc, hai đầu cong móc câu Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần thấy vịng xoắn nhỏ, sát Tính chất nuôi cấy: xoắn khuẩn nuôi cấy điều kiện hiếu khí Thường ni mơi trường lỏng có thêm huyết động vật (thỏ) tươi (sản xuất theo Terskich Korthoff); pH 7,2- 7,5; nhiệt độ 28-30oC giàu oxy Leptospira mọc chậm, sau 6- 10 ngày phát triển tốt (đặc điểm nuôi cấy làm vẩn nhẹ mơi trường khói thuốc lá) Sức đề kháng: nói chung Leptospira có sức đề kháng yếu, song cao xoắn khuẩn khác; chết nhanh mơi trường acid Leptospira sống tự đất, nước môi trường mặn (sống hàng tháng) có ánh sáng mặt trời nhanh chết Cấu tạo kháng nguyên: dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại Leptospira chia làm 20 nhóm; nhóm có nhiều type huyết Các type huyết có nhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo Ở Việt Nam thường gặp 12 type huyết sau: L australis L canicola L autumnalis L grippothyphosa L bataviae L hebdomalis L ictero- haemorrhagiae L mitis L ponoma L saxkoebing 5    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com L poi 1.3 L sejroe Cách sinh bệnh Cơ chế phát bệnh Leptospira interrogans tường tận phong phú serovars gây bệnh Thông thường xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh cho động vật sau vào thể, chúng xâm nhập vào máu nhân lên nhanh chóng Sau 1-2 ngày có đến tuần, xoắn khuẩn gây tượng nhiễm trùng huyết Trong giai đoạn này, phân lập Leptospira máu hầu hết phủ tạng dịch não tủy Pha nhiễm trùng huyết chấm dứt với xuất kháng thể kháng Leptospira máu Các kháng thể phát sau 5-10 ngày đạt mức tối đa khoảng tuần sau Hiệu giá kháng thể thường đạt từ 1/1.000 đến 1/100.000 (với thử nghiệm MAT) sau giảm dần Sau giai đoạn nhiễm trùng huyết, Leptospira định vị ống lượn gần thận Tại đây, chúng nhân lên tiết vào nước tiểu Tùy thuộc vào vật mắc bệnh serovars gây nhiễm thời gian mà cường độ trùng qua nước tiểu thay đổi Ngồi ra, Leptospira cịn sinh độc tố phá hủy hồng cầu, phá hủy thành mao mạch, gây vỡ tắc nghẽn mao mạch dẫn đến hoại tử xuất huyết niêm mạc 6    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Leptospira sau xâm nhập vào thể qua đường da niêm mạc, chúng tự nhân lên tạo tình trạng bạo huyết, sau 7-10 ngày gây nhiễm dẫn đến biểu lâm sàng (hồng đản, thiếu máu…) Sau đó, Leptospira theo máu đến thận sống tiểu quản thận gây viêm thận (albumine niệu, ure huyết), đến gan gây viêm gan, đến não gây viêm màng não đau Thời kỳ nung bệnh kéo dài khoảng 10-20 ngày, tùy thuộc vào trạng thái thể, mức độ chăm sóc, nuôi dưỡng, đường xâm nhập, số lượng độc tố mầm bệnh Sau khỏi bệnh, vật có miễn dịch miễn dịch với serovars gây bệnh trước 1.4 Triệu chứng 1.4.1 Dạng cấp tính Bại huyết phát triển nhanh sau vài nhiễm, sốt cao 40-41oC suy nhược nặng Có thể chia làm thể: - Thể thương hàn: Vật bệnh có biểu xuất huyết trầm trọng viêm kết mạc mắt với nhũng điểm xuất huyết da niêm mạc, ói máu phân sậm màu có máu, thú bị nước nhanh chết 24 ngày với giảm thấp thân nhiệt, thường thấp bình thường - Thể hồng đản : Chó bệnh có biểu viêm kết mạc mắt, hồng đản, vàng da khó thở tăng dần với ăn, ói mửa, khơng chữa trị giai đoạn cuối chó có tăng cao nhiệt độ khó thở, thở Tiêu chảy đơi xuất huyết biểu viêm não trước hắt hơi, thú chết khoảng 5-8 ngày mắc bệnh 1.4.2 Thể bán cấp tính mãn tính - Thể tương ứng với phát triển hội chứng sinh urea huyết hậu viêm thận mà biểu chứng tiểu nhiều, chứng khát nước nhiều với ói mửa tiêu chảy Sau thời gian mê urea huyết chó chết - Thể thở khó có mùi urea miệng xáo trộn hơ hấp –viêm màng móng mắt, viêm cơ… 1.5 Bệnh tích 1.5.1 Thể cấp tính - Thể thương hàn: + Viêm dày ruột xuất huyết 7    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Xuất huyết da niêm mạc + Có thể gặp gan sưng, hạch bạch huyết xuất huyết - Thể hoàng đản: + Da vàng bụng, gang bàn chân, lỡ tai + Niêm mạc vàng + Bàng quang chứa nhiều nước tiểu vàng sậm xuất huyết 1.5.2 Thể bán, mãn tính - Viêm thận kẻ hay viêm thận mãn tính - Vết lở miệng lưỡi gặp chó có urea máu 1.6 Tính miễn dịch Tính miễn dịch hình thành vào giai đoạn bệnh Leptospira gây Thể cấp tính đề cập giai đoạn miễn dịch, biến cảu vi trùng khỏi dòng máu xảy đồng thời với xuất kháng thể Sự trầm trọng lâm sàng bệnh thường xuất với biểu trầm trọng mô học Sự sinh phức hợp miễn dịch gây viêm hệ thần kinh trung ương Phức hợp miễn dịch hệ tuần hoàn mức độ khác có liên quan đến mức độ trầm trọng mặt triệu chứng Ở thú vượt qua bệnh, phức hợp miễn dịch giảm với cải thiện mặt lâm sàng 1.7 Bệnh Leptospira người 8    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Theo WHO (2002), bệnh Leptospira xảy người biểu sau: a Sự truyền lây sang người Bệnh xảy người ta thao tác thú nhiễm bệnh hay quan Mầm bệnh truyền qua vết thương Các nhà chăn ni, bác sĩ thú y nhiễm trực tiếp nước tiểu thú bị bệnh trại chăn nuôi hay chuồng điều trị Phần lớn bệnh truyền sang người qua nước ao hồ bị nhiễm bẩn, bùn lầy nhiễm Leptospira người ta tắm lội qua, mầm bệnh xâm nhập qua da hay niêm mạc hầu họng, niêm mạc mắt… người vào thể b Triệu chứng Bệnh Leptospira gây hoàng đản xuất huyết Biểu hoàng đản xuất huyết thường thấy người bị bệnh Leptospira gây Bệnh phát triển có tính chu kỳ Thời kỳ ủ bệnh 7-12 ngày Bệnh khởi phát đột ngột, người bệnh sốt cao 39-40oC kèm theo biểu ớn lạnh suy yếu Biểu hoàng đản chia thành pha: + Pha tiền hoàng đản: người bệnh thường bị bại huyết kéo dài 4-5 ngày Nhiệt độ lên cao, đau xáo trộn vận mạch, vết đỏ sần, hội chứng màng não ói mửa, cứng vịng ót, đau đầu + Pha hồng đản: bệnh nhân bị hoàng đản Leptospira tác động lên gan, thận Hoàng đản xuất vào ngày thứ kéo dài 2-3 ngày Hoàng đản quan sát niêm mạc Đi tiểu nhiều có albimine nước tiểu Ure máu tăng g/l, sau dần trở nên bình thường Đơi có xuất huyết (chảy máu cam, xuất huyết đường tiêu hóa…) + Pha hình thành miễn dịch: pha kháng thể bắt đầu xuất máu bệnh nhân thường vào ngày thứ 10 bệnh biểu triệu chứng giảm dần + Pha sốt hồi quy: thường đến ngày bị bệnh thứ 15, bệnh nhân bắt đầu sốt trở lại sau vài ngày không sốt Nhiệt độ thể tăng đến 39-40oC, kéo dài 5-8 ngày hội chứng màng não, hoàng đản yếu thận giảm Mức độ nặng nhẹ hoàng đản cho phép xác định bệnh nặng hay nhẹ Hoàng đản trầm trọng thường kèm với viêm gan, viêm thận cấp tính, vơ niệu (khơng có nước tiểu bàng quang), xuất 9    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com huyết, xáo trộn thần kinh chết vài ngày Hồng đản nhẹ thường mang tính chất tạm thời không rõ ràng Bệnh Leptospira khơng gây hồng đản Người bị bệnh Leptospira khơng gây hồng đản thường biểu triệu chứng nhẹ thấy rõ, khơng có biểu hồng đản Tuy nhiên, gặp thể bệnh sau: + Những thể màng não túy Ví dụ bệnh nhân bị nhiễm serovars L Ponoma, L Tarassovi… từ heo + Những xáo trộn thần kinh (lầm lẫn cảm giác, ảo giác) thường nhiễm serovars L Sejroe, L Hardjo + Những thể cúm serovars L Groppotyphosa L Hardjo + Những thể sốt, sốt ngày bệnh sốt Nhật Bản ngày L Hebdomadis hay sốt đồng ruộng L Bataviae Những thể bệnh khơng gây hồng đản chữa trị mà không để lại di chứng (Hoeden, 1964; WHO, 2002) Những biểu bệnh 10    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vaccine phòng bệnh Leptospira Có nhiều loại vaccine phịng bệnh Leptospira: vaccine protein tái tổ hợp, vaccine lipopolysaccharide (LPS), vaccine bất hoạt, vaccine DNA Trong phần trình bày chủ yếu tập trung sâu vào vaccine DNA (vì phương pháp mới) 2.1 Vaccine protein tái tổ hợp Vaccine protein tái tổ hợp loại vaccine có tiềm lớn phịng bệnh Leptospira Nó xây dựng với phương pháp công nghệ sinh học đại Những đặc trưng bảo vệ vaccine omp tái tổ hợp kiểm nghiệm, gồm: protein ngoại màng (ompL1), lipoprotein (lipL41), protein immunoglobin Những đoạn DNA gen mã hóa protein ngoại màng cắt enzyme XhoI XbaI, sau DNA để dùng làm khn để khuếch đại đoạn gen mã hóa omp nhờ PCR Sau khuếch đại đoạn gen chèn vào vector (E.coli) để tổng hợp omp Sau tách chiết omp để tạo vaccine 2.2 Vaccine LPS Những kết phân tích LPSs mở hướng phát triển cho vaccine Quá trình tổng hợp LPS Leptospira tương tự vi khuẩn Gram âm (-) Những LPS Leptospira kích hoạt đại thực bào thơng qua CD14 Tolllike receptor (TLR2) Vaccine LPS không đặc hiệu cho dịng serovar độc lập, ví dụ vaccine từ L bilexa serovar Patoc chống lại L interrogans serovar Manilae, hiệu bảo vệ loại vaccine phụ thuộc vào liều tiêm thời gian tiêm Nhưng vaccine xem vaccine đặc hiệu cho serovar, ví dụ vaccine từ vài dịng serovar khác khơng thể tạo đáp ứng miễn dịch vài dòng serovar khác Như cần phải nghiên cứu để xác định tính đặc hiệu hay khơng đặc hiệu vaccine LPS Nếu vaccine LPS không đặc hiệu người động vật khác tạo loại vaccine có hiệu đơn giản 11    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3 Vaccine bất hoạt Vaccine bất hoạt vaccine sử dụng vi khuẩn làm yếu chết, hay sử dụng kháng nguyên thu nhận từ nhiều dòng serovar phù hợp (như Leptospira borgpetersenii serovar hardjo, Leptospira interrogans serovar hardjo dòng L interrogans serovar khác) Vaccine thường sử dụng cho chủng ngừa gia súc Trước đem sử dụng, vaccine kiểm tra nhiều lần Mỗi lần kiểm tra thử nghiệm 10 thú để xác đinh liều dùng có hiệu Đợt thử nghiệm tiến hành 14 ngày, tiếng sau tiêm vaccine ngày thú kiểm tra nhiệt độ Sau thử nghiệm hiệu vaccine vaccine đem sử dụng Vaccine sử dụng cho thú từ tháng tuổi trở lên Vaccine tiêm đợt để thú kích thích tạo kháng thể tốt chống lại dịng serovar nói 2.4 Vaccine DNA Vaccine DNA loại vaccine nghiên cứu gần đây, có nhiều ưu so với vaccine cổ điển như: tạo kháng thể đặc hiệu (vì kháng nguyên tạo thể), dễ kiểm soát, dễ thực Phương pháp tạo vaccine DNA: Chuẩn bị dịch chất tế bào Leptospira Dung dịch chứa tế bào Leptospira thu từ phase log nuôi cấy vi khuẩn Môi trường nuôi cấy ly tâm 12000 v/p 25oC 30 phút Thu lấy kết tủa, rửa muối buffer phosphate, pH = 7,4 ; lần ly tâm Cuối cho phần thu trở trạng thái lỏng nước chưng cất siêu tinh khiết (UDW) Dung dịch mang đem đánh sóng âm 20 kHz nước đá khoảng phút Thu nhận lượng protein Lượng protein sử dụng để xác định chuẩn kháng thể huyết chuột miễn dịch thông qua phương pháp ELISA gián tiếp Chuẩn bị DNA gen Leptospira DNA gen trích từ tồn tế bào L.interrogans, serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni thu nhận phase log q trình ni cấy Tế bào vi khuẩn rửa bước phần tế bào thu từ ly tâm lần cuối (ly tâm lần trên) chuyển vào buffer TE (10 mM Tris-HCl, pH = mM EDTA) Phần chuẩn bị cho thêm vào buffer lysis 12    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chứa 10% SDS, ul 20 ul/ml proteinase-K, ul 20 mg/ml RNase A ủ 30oC tiếng Sau thêm vào M sodium chloride cetyltrimethylammonium bromide (CTAP) Cho thể tích thể tích phenol-chloroform-isoamyl để tạo hỗn hợp Phần chuẩn bị ly tâm 12000 v/p , 25oC phút Phần dung dịch bên chuyển sang ống mới, isopropanol thêm vào để kết tủa DNA Rửa phần kết tủa thu sau ly tâm ethanol 70% sấy khô DNA sấy khơ hịa tan vào buffer TE Chất lượng phần chuẩn bị đánh giá thông qua khuếch đại PCR đoạn gen 16S RNA (sử dụng primer oligonucleotide, primer forward: 5’-GGCGGCGCGTCTAAACATG-3’ primer reverse: 5’-TTCCCCCCATTGAGCAAG-3’ tạo từ chuỗi 16S rDNA L.interrogans, serovar Canicola dòng Moulton PCR amplicon thu nhận để điện di gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide nhận diện tia UV (Biodoc-ITTM Imaging System, UVP Transilluminator, Cambridge, UK) DNA chất lượng tốt thu nhận phần chuẩn bị sau sử dụng làm khn để khuếch đại ompLI Thiết kế primer khuếch đại ompLI PCR Những đoạn primer oligonucleotide dùng để khuếch đại ompLI PCR thiết kế từ chuỗi DNA (ID LIC 10973) mã hóa ompLI L.interrogans, serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni liệu GenBank Chuỗi primer forward 5’-GGCTCGAGCCATGGCATTATCTTCGGCTGCA-3’ với chuỗi Kozak vị trí giới hạn XhoI đầu 5’ ; chuỗi primer reverse 5’GCTCTAGACTGTAGATTTGCCCACCGA-3’ với vị trí giới hạn XbaI đầu 3’ PCR gradient sử dụng để xác định nhiệt độ tối ưu primer Hỗn hợp PCR gồm: 16,25 ul UDW, 2,5 ul buffer (10x), ul 200 nM dNTPs mix, ul loại primer, ul DNA khuôn, 0,25 ul Taq polymerase (2 U/ul) Gradient nhiệt độ 52-61oC Mỗi PCR amplicon thu nhận để điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide để xác định nhiệt độ tối ưu primer, nhiệt độ mà tạo số lượng DNA mục tiêu cao với DNA nhiễm thấp Cloning vị trí ompLI vector chọn lọc E.coli mang vector-plasmid chuyển Những ompLI amplicon tinh cách sử dụng ethanol để kết tủa DNA sau tinh gắn vào vector pGEM-Easy thông qua gắn kết sole (plasmid-T gắn với A-DNA) Vector tái tổ hợp dịng hóa tế bào E.coli JM 109 chun dùng thơng qua phương pháp hóa biến nạp (hoặc súng bắn gen) Chọn lọc lại E.coli mang gen chuyển (bằng cách nuôi cấy môi trường agar có kháng sinh Luria-Bertani(LB)-ampicillin (100 ug/ml), 100 mM IPTG 5% X-gal, khuẩn lạc có vịng sáng trắng bao quanh phát triển mạnh E.coli có chứa vector mang gen) cho vào mơi trường nước thịt có trộn LB13    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ampicillin (50 ug/ml) Sau đem nuôi cấy lắc 37oC 18 tiếng Thu nhận tế bào sau nuôi cấy cách ly tâm 4000 v/p 25oc phút Những plasmids tách chiết từ tế bào phương pháp alkaline lysis tiêu chuẩn cắt endonucleases XhoI XhaI Những phần plasmid cắt điện di gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide nhận diện tia UV Những dòng E.coli có mang ompLI-plasmid tái tổ hợp chọn lọc để tiếp tục sử dụng Chuẩn bị vaccine ompLI-plasmid Đoạn ompLI tạo dòng phụ vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) Nói tóm lại, plasmid ompLI-pGEM-T tách chiết từ tế bào E.coli JM109 chuyển gen, sau cắt enzyme endonucleasea nhận diện điện di gel agarose 1% Những đoạn DNA mang ompLI tin từ mảng gel cắt vị trí xác định cách sử dụng kit GENECLEAN-II (Bio101, LA, USA) gắn kết vào pcDNA3.1(+) tương ứng nhờ enzyme ligase T4 DNA Những plasmid tái tổ hợp đưa vào E.coli Top10 nhờ phương pháp hóa biến nạp Những tế bào mang plasmid tái tổ hợp nuôi chọn lọc môi trường agar LB-ampicillin Về việc chuẩn bị DNA plasmid-ompLI, dòng đơn E.coli Top10 mang plasmid tái tổ hợp cho tăng trưởn qua đêm môi trường agar LB-ampicillin cho vào 500 ml môi trường nước thịt có LB-ampicillin đựng bình lít ủ 37oC, lắc 200 rpm 18 tiếng Những tế bào thu thu nhận thông qua ly tâm 4000 v/p 25oC 30 phút Phần rắn thu đem rửa với dung dịch nước muối ; plasmid tách chiết từ tế bào phương pháp alkaline lysis tinh phenol-chloroform Quá trình chép DNA opmLI-plasmid tế bào động vật hữu nhũ Để chắn plasmid ompLI-pcDNA3.1(+) biểu tế bào động vât, plasmid tái tổ hợp thường sử dụng để gây nhiễm tế bào COS-7 thông qua nuôi cấy mô mRNA opmLI phiên mã tế bào COS-7 phát RT-PCR Nói tóm lại, tế bào COS-7 phát triển môi trường thiết yếu tối thiểu Dulbecco với 10% huyết thai bò bất hoạt nhiệt diện tích bề mặt ni cấy 25 cm2 37oC tủ ấm CO2 5% phát triển 75% bề mặt nuôi cấy Những tế bào bề mặt nuôi cấy rửa với PBS vô trùng, pH = 7,4 sau bổ sung thêm ml huyết tươi DMEM chứa 1% penicillin-streptomycin Plasmid tái tổ hợp ompLIpcDNA3.1(+) (10 ug 10 ul DMEM) trộn với 15 ul Polyfect (Qiagen, Germany) hỗn hợp trộn giữ 25oC 15 phút trước cho vào tế bào bề mặt nuôi cấy Plasmid pcDNA3.1(+) khơng có ompLI trộn với Polyfect 14    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cho vào tế bào bề mặt nuôi cấy khác Cả bề mặt nuôi cấy ủ 37oC tủ ấm CO2 5% 48 tiếng Những tế bào bề mặt nuôi cấy thu nhận riêng biệt rửa với PBS vơ trùng, sau RNA tổng cộng tách chiết từ tế bào, sử dụng thuốc thử Trizol DNA bề mặt nuôi cấy loại bỏ enzyme DNase DNA tổng hợp từ RNA tổng số thông qua kit tổng hợp cDNA (Invitrogen) Những cDNA sử dụng làm khuôn PCR cho việc khuếch đại ompLI thông qua primer forward reverse Nhưng loại vaccine nghiên cứu, chưa thật đem vào thực tế dụng Kết thử nghiệm chuột lông vàng Syrian: Hai mươi bốn chuột lông vàng Syrian, tuần tuổi, đem thử nghiệm Lấy mẫu máu để thu mẫu huyết trước tiêm ngừa vaccine (ngày 0) Những chuột chia thành nhóm, nhóm Mỗi chuột nhóm chủng ngừa vaccine vào với liều lượng 100 ug ompLI-pcDNA3.1(+) 100 ul PBS chuột nhóm tiêm pcDNA(+) với liều lượng giống nhóm 1, tức miễn dịch giả Nhóm tiêm với 100 ul PBS Quá trình tiêm nhắc lại lần vào tuần sau với cách tiêm liều lượng lần Lấy mẫu máu để thu mẫu huyết chuột vào ngày 7, 14, 28, 42 sau lần tiêm Những chuột từ nhóm 1-3 tiêm vào màng bụng với 10 LD50 (1000 tế bào) L.interrogans, serogroup Pomona, serovar Pomona vào ngày thứ 49 Vì vậy, chuột nhóm chắn nhiễm leptospirosis chuột nhóm hồn tồn khơng nhiễm Tất chuột cho nuôi lại chuồng với thức ăn viên nước ad libitum Chúng theo dõi tình trạng bệnh ngày (nhiệt độ trực tràng, trọng lượng thể, lượng nước thức ăn tiêu thụ), tử vong kéo dài đến thử nghiệm kết thúc vào ngày thứ 21 sau tiêm Leptospira (ngày 70 từ lần tiêm thứ 1) Tim, phổi, gan, lách thận thu nhận từ chuột chết ngày thứ 21 sau tiêm Leptospira từ chuột sống sót sau thí nghiệm Tất mô nuôi cấy môi trường dung dịch EMJH có bổ sung 5fluorouracil ủ 30oC cho việc phục hồi sống cho Leptospira Kết đạt từ thử nghiệm: Việc chuẩn bị vaccine ompLI DNA gen mã hóa ompLI thu nhận thành công từ L.interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni, 16S rDNA khuếch đại từ gen DNA (dãy 1, fig 1A) DNA sử dụng khuôn cho việc khuếch đại ompLI gradient PCR nhiệt đọ tối ưu 54,6oC Vị trí ompLI amplicon 917 bp (dãy 2, fig 1A) Đoạn ompLI tạo dịng phụ thành cơng vào 15    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com pcDNA3.1(+), đưa vào E.coli Top10 Mẫu dãy DNA XhoI XhaI cắt plasmid ompLI-pcDNA3.1(+) từ E.coli Top10 có mang vector tái tổ hợp sau điện di gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide Dòng E.coli Top10 mang vector tái tổ hợp lựa chọn mang ompLIpcDNA3.1(+) dòng E.coli mang pcDNA3.1(+) phát triển riêng biệt môi trường canh thịt có LB-ampicillin; plasmid thu nhận tinh phương pháp phenol-chloroform (fig 1B) Quá trình phiên mã DNA ompLI-plasmid tế bào COS-7 RT-PCR amplicon sử dụng cDNA chuẩn bị từ RNA tổng cộng tế bào COS-7 gây nhiễm với pcDNA3.1(+) khuôn (dãy 2, fig 2) chứng tỏ có q trình phiên mã diễn tế bào động vật Khơng có sản phẩm RT-PCR phat cDNA tổng hợp từ RNA tổng số tế bào COS-7 nhiễm pcDNA3.1(+) Hiệu bảo vệ vaccine chuột 16    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Những chuột tất nhóm khơng biểu dấu hiệu giảm sức sống sau miễn dịch Vaccine [100 ug plasmid ompLI-pcDNA3.1(+)] giả vaccine [pcDNA3.1(+)] tiêm cho chuột nhóm Sau tiêm Leptospira cho chuột từ nhóm 1-3, tất chuột có biểu giảm sức sống, tức lượng tiêu thụ thức ăn nước uống giảm trọng lượng giảm Tuy nhiên, chuột nhóm khơng phát sốt chuột nhóm nhiệt độ trực tràng tăng, 37,74 +_ 0,35oC (nhóm 1) 37,81 +_ 0,41oC (nhóm 2) [biên độ nhiệt trực tràng thơng thường chuột 36,2 đến 37,5oC] Những chuột nhóm sức khỏe bình thường suốt q trình thử nghiệm Tất chuột nhóm (khơng tiêm Leptospira) sống sót đến cuối đợt thử nghiệm (ngày thứ 70) Tỷ lệ sống chuột thể qua Fig.3 Những chuột nhóm (giả vaccine) nhóm (tiêm Leptospira sống) tất chết từ ngày thứ sau tiêm Leptospira Đối với nhóm (vaccine), chuột nhóm chết vào ngày thứ 9, chết vào ngày thứ 11 18 Hai sống sót đến ngày thứ 21 17    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Từ kết đạt được, nhà khoa học dần cải thiện nghiên cứu thêm vaccine DNA III Tổng Kết Nhìn chung, Leptospira nhóm vi khuẩn nguy hiểm, chúng khơng gây hại động vật mà cịn lây nhiễm người; đồng thời chúng nhóm lây nhiễm, từ động vật (thường chuột) sang người, từ mơi trường (do chúng tồn lâu môi trường) đất, nước ao hồ… Bên cạnh đó, việc điều trị bệnh khó khăn dễ dẫn đến tử vong Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine vấn đề cấp thiết Đã có nhiều loại vaccine đưa cải thiện, chẳng hạn vaccine DNA, hướng nghiên cứu đầy tiềm với ưu (kháng nguyên tạo thể nên thể tạo kháng thể sẵn, đơn giản không cần tiêm vaccine nhắc lại…) Tóm lại, vaccine phịng bệnh Leptopira nói riêng loại vaccine khác nói chung đã, nghiên cứu xa để tạo tường bảo vệ người động vật khỏi tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus…) IV Tài Liệu Tham Khảo www.impe-qn.org.vn , Viện sốt rét ký sinh trùng côn trùng Quy Nhơn, 1-8 www.microbialcellfactories.com, 8-10 European Pharmacopoeia, Inactivated, 10 18    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, DNA Vaccine for Leptospirosis, 2007, 11 – 18 19    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... nói trên, vi? ??c điều trị bệnh khó khăn nên cần có biện pháp phịng ngừa bệnh có hiệu cao Cho nên sản xuất vaccine phòng bệnh vi khuẩn Leptospira yêu cầu cấp thiết 2    LUAN VAN CHAT LUONG download... kính vi khuẩn đen thấy vi khuẩn di động mạnh Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana-Tribondeau phát vi khuẩn, vi khuẩn nhìn thấy mảnh sợi tóc, hai đầu cong móc câu Dưới kính hiển vi. .. CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vaccine phịng bệnh Leptospira Có nhiều loại vaccine phòng bệnh Leptospira: vaccine protein tái tổ hợp, vaccine lipopolysaccharide (LPS), vaccine