VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA

VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM BỘ MÔN CNSH GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC IH Tiểu luận GVHD: PGS.Ts Nguyễn Ngọc Hải SVTH: Phan Thị Anh Văn Lớp: DH06SH SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải I.KHÁI QUÁT VỀ VACCINE 1.LỊCH SỬ RA ĐỜI CỦA VACCINE Vaccine gắn với tên tuổi Edward Jenner, bác sĩ người Anh Năm 1796, châu Âu có dịch đậu mùa, Jenner thực thành công thử nghiệm vaccine ngừa bệnh Thời điểm 1798, Jener công bố kết thí nghiệm mình, người ta hình dung có "mầm bệnh" gây nên truyền nhiễm Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả dịch tả tàn sát đàn gà Pasteur xác nhận giả thuyết Jenner mở đường cho khoa miễn dịch học đại 2.ĐỊNH NGHĨA Vaccine chế phẩm sinh học chứa vật chất mầm bệnh gọi "kháng nguyên".Khi đưa vào thể người động vật kích thích thể tạo trạng thái miễn dịch, giúp thể chống lại mầm gây bệnh Dù chế tạo công nghệ vaccine phải bảo đảm bốn tiêu chuẩn sau: - Không gây phản ứng tồn thân.Có thể có phản ứng cục bộ, biểu lâm sàng phải biến 24 sau tiêm phòng - Hiệu lực phòng bệnh cao kéo dài - Tiêm nhẹ tay, liều tiêm thấp bảo quản dễ dàng - Giá thành hạ 3.THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA VACCINE Có hai thành phần chủ yếu vaccine là:Kháng nguyên chất bổ trợ vaccine - Kháng nguyên:kháng nguyên hiểu chất đưa vào thể kích thích thể vật chủ sản sinh kháng thể tạora mộ lớp tế bào mẫn cảm đặc hiệu chống lại xâm nhập gây bệnh mầm bệnh - Chất bổ trợ vaccine: Là chất bổ sung vào vaccine, có khả kích thích sinh miễn dịch khơng đặc hiệu nhằm nâng cao hiệu lực độ dài miễn dịch vaccine Bổ trợ kết hợp với kháng nguyên làm tăng tính lạ kháng nguyên vào thể,nên đáp ứng miễn dịch mạnh hơn,quá trình tổng hợp protein cao hơn.Vaccine có bổ sung chất bổ trợ tạo miển dịch mạnh ,thời gian miễn dịch kéo dài 4.PHÂN LOẠI VACCINE Dựa vào thành phần kháng ngun có vaccine, vào hoạt tính mầm bệnh công nghệ chế tạo vaccine để phân loại vaccine 4.1 Dựa vào thành phần kháng nguyên vaccine hệ I – vaccine toàn khuẩn Vaccine toàn khuẩn bao gồm kháng nguyên thân, vỏ bọc độc tố nấm bệnh sản sinh trình phát triển Vaccine hệ II Trong vacxin chứa số thành phần gây bệnh mầm bệnh nguyên Vaccine hệ III-Vaccine tái tổ hợp Vaccine tái tổ hợp sản xuất nghệ gen ( genetic engeneering ) vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cúm gia cầm H5N1, vaccine tái tổ hợp LMLM v.v 4.2 Dựa vào hoạt tính mầm bệnh Trong nhóm có hai loại vaccine: vaccine vơ hoạt vaccine nhược độc SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải a.Vaccine vô hoạt Vaccine vô hoạt vaccine chứa mầm bệnh- kháng nguyên vô hoạt yếu tố vật lý như: Nhiệt độ, tia tử ngoại, sóng siêu âm; hóa chất như: Các loại thuốc nhuộm,các axit, formol v.v Vaccine vơ hoạt khơng có bổ trợ Loại vaccine gọi bacterin Vaccine bacterin chứa thành phần chủ yếu kháng nguyên Công nghệ chế tạo bacterin đơn giản phù hợp với nước có trình độ chế tạo vaccine đơn giản, có giá thành hạ Song hiệu lực vaccine thấp, độ dài miễn dịch ngắn Hiện loại vaccine sản xuất ít, thường sản xuất dạng vaccine chuồng cho số sở có u cầu *Vaccine vơ hoạt có bổ trợ vaccine Trong vaccine ngồi kháng ngun vơ hoạt cịn có bổ trợ vaccine Các bổ trợ vaccine thường dùng keo phèn, phèn chua bổ trợ dầu khoáng b Vaccine nhược độc Vaccine nhược độc vacine chứa mầm bệnh làm nhược độc vô độc, bảo tồn tính khàng ngun I.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA VACCINE Hệ miễn dịch nhận diện vắc-xin vật lạ nên hủy diệt "ghi nhớ" chúng Về sau, tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập thể, hệ miễn dịch tư sẵn sàng để cơng tác nhân gây bệnh nhanh chóng hữu hiệu (bằng cách huy động nhiều thành phần hệ miễn dịch, đặc biệt đánh thức tế bào lympho nhớ) Đây ưu điểm đáp ứng miễn dịch đặc hiệu I.3.PHƯƠNG PHÁP CHUNG SẢN XUẤT VACCINE Tạm hiểu đơn giản việc sản xuất theo cách: Cách sản xuất cổ điển: Lấy vi khuẩn gây bệnh, làm giảm độc lực (tạm gọi kháng ngun) tiêm vào người chúng khơng đủ sức gây bệnh mà kích thích thể tạo chất miễn dịch (gọi kháng thể) Lần sau gặp lại vi khuẩn, kháng thể chống lại nên thể không mắc bệnh Cách sản xuất đại: Chỉ lấy kháng nguyên vi khuẩn gây bệnh, “cấy” vào vi khuẩn lành tính, làm cho sinh sơi nảy nở, “chiết” kháng nguyên từ vi khuẩn lành tính làm vacxin Cách điều chế “cơng nghệ sinh học” dùng lượng kháng nguyên nhỏ, đỡ tốn kém, cần dùng liều nhỏ Sơ đồ sản xuất vaccine trứng Giống vi rút Tiêm cho trứng có phơi 10 ngày Thu nước trứng Sản xuất vaccine SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải sơ đồ sản xuất vaccine môt trường tế bào Mô trường tế bào Nhiễm vi rút , đẻ tủ ấm Thu hoạch tế bào có vi rút Sản xuất vaccine I.4.ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT TRONG SẢN XUẤT VACCINE DNA TÁI TỔ HỢP ADN tái tổ hợp phân tử ADN tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN lồi sinh vật khác Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường tạo thành từ việc gắn đoạn ADN có nguồn gốc khác vào vectơ tách dòng Những vectơ tách dòng mang ADN tái tổ hợp biểu thành protein tái tổ hợp sinh vật DNA vaccine Còn gọi vaccine DNA tái tổ hợp, loại nucleic acid vaccine, dựa nguyên lý gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu tiêm vào vật chủ (tế bào động vật vi sinh vật) để sản xuất kháng nguyên khởi động phản ứng miễn dịch Nhiều vaccine phòng virus (sởi, bại liệt, dại…) sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà tế bào vi sinh vật Phân lập nhiều gen từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa gen vào vịng DNA plasmid đóng lại Các vịng DNA sau đưa vào nhóm tế bào nhỏ, thường cách tiêm vào tế bào đẩy vào da nhờ súng bắn gen Các gen chọn lựa mã hóa cho kháng nguyên, chất gây đáp ứng miễn dịch, thường sản xuất tác nhân gây bệnh NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tế bào động vật tách từ mơ ni cấy loại mơi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngồi thể, chúng sinh trưởng cách tăng số lượng kích thước tế bào SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú ứng dụng để sản xuất hợp chất hóa sinh quan trọng dùng chẩn đoán hormone sinh trưởng người, interferon, hoạt tố plasminogen mô, viral vaccine kháng thể đơn dòng Một số loại vaccine nghiên cứu Sử dụng phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây loại đáp ứng miễn dịch mong muốn Thí dụ, chất nhơm phosphate oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vaccine khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay tế bào Vaccine khảm: sử dụng sinh thể quen biết để hạn chế tượng "phản tác dụng", thí dụ dùng virus vaccinia mang số yếu tố virus viêm gan B hay virus dại Vaccine polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt với phân tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 gắn MHC; đoạn peptide mô định kháng nguyên (epitope) Anti-idiotype: idiotype cấu trúc không gian kháng thể vị trí gắn kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Anti-idiotype kháng thể đặc hiệu idiotype, anti-idiotype xét mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên Vậy, thay dùng kháng nguyên X làm vaccine, người ta dùng idiotype anti-anti-X II VACCINE PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN PASTEURELLA II.1 PASTEURELLA Một số bệnh pasteurella Pasteurella giống vi khuẩn gồm nhiều lồi khác nhau, lồi thích nghi gây bệnh loại động vật khác , chúng điều gây chứng bại huyết,xuất huyết nên người ta gọi bệnh loài gia súc gia cầm tên chung bệnh tụ huyết trùng( pasteurellosis) Bệnh tụ huyết trùng trâu bò (pasteurelcosis bovum) bệnh truyền nhiễm cấp tính trâu, bị gây pasteurella boviseptica(ở bò) pasteurlla bulaiseptica(ở trâu) với kiểu đặt trưng: tụ huyết xuất huyết vùng đặt trưng thể, vi khuẩn thường xam nhập vào máu gây bại huyết Bệnh tụ huyết trùng lợn (pasteurella sunum) bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy lợn, thường phát sinh rải rát,có thành dịch địa phương Bẹnh vi khuẩn pasteurella suiseptica gây ra, đặc điểm bệnh viêm phổi ,viêm màng phổi, màng tim bại huyết Ở gia cầm, bệnh tụ huyết trùng pasteurella aviseptica gây với đặc điểm gà ,vịt , ngang, ngỗng thường chết nhanh nhiễm bệnh nhiễm đọc cấp tính với tỉ lệ chết cao Bệnh tích thường gặp viêm bao tim tích nước, mỡ vành tim xuất huyết, gan sưng tụ máu có nhiều điểm tụ nước màu vàng Ngồi pasteurella cịn gây bệnh thỏ, chim cá Phương thức truyền lây vi khẩn từ bệnh trực tiếp qua khỏe gián tiếp qua nhân tố trung gian bị ô nhiễm vi khuẩn cường độc Lây qua chất thải gia súc gia cầm hay việc giết mổ bừa bãi Nhiều bệnh tự phát đàn gia súc gia càm vi khuẩn thường kí sinh thể gia cầm, gia súc khỏe,bình thường¸giũa thể gia súc gia cầm vi khuẩn có cân SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải sinh học có mát cân ảnh hưởng ngoại cảnh oặc biến đổi thể vi khuấn tăng cường độc gây bệnh Bệnh thường bùng phát nhanh gây thiệt haị nặng nề conng tác phòng bệnh cần thiết cấp bách Đặc điểm Vi khuẩn hình gậy ngắn trịn hai đầu ( cầu trực khuẩn nhỏ có hình trứng bầu dục), kích thướt 0.25-0.4x0.41.5µm, vi khuẩn khơng có lơng, khơng di động, khơng hình thành nha bào, bắt màu gram âm Trong thể bệnh vi khuẩn hình thành giáp mơ khó quan sát nhuộm, vi khuẩn có tượng bắt màu xám hai đầu tế bào nên người ta gọi Pasteurella vi khuẩn lưỡng cực (Nguyễn Bá Hiên, 2008) Mọc môi trường thạch thường nước thịt thường Nhiệt độ tối ưu 36-380C với pH=7.2-7.4 Tùy nghi hiếu khí Trên thạch mọc thành loại khuẩn lạc S (láng): độc lực cao, M (nhày): độc lực yếu hơn, R (xù xì): độc lực yếu khơng độc lực tính biến dạng lớn: cấy chuyển qua môi trường dinh dưỡng nhiều lần tiêm qua động vật dạng S chuyển thành dạng M R ngược lại Đặc điểm quan trọng Pasteurella Multocida đặc tính dung quang khuẩn lạc chiếu ánh sang xuyên 450nm Đặc điểm lần Deruit (1921) phát Khuẩn lạc dạng S mơi trường thường có tính dung quan, khuẩn lạc dạng M R khơng có đặc tính nói Theo Smith, đặc tính có quan hệ chặt chẽ với tạo vỏ chủng tụ huyết trùng Dựa vào đặc tính chọn chủng tụ huyết trùng có tính kháng ngun miễn dịch cao Vi khuẩn tụ huyết trùng dễ bị tiêu diệt sức nóng, ánh sang mặt trời chất sát trùng Vi khuẩn bị diệt đun 580C 20 phút; 800C sau 10 phút; 1000C chết Ánh sang mặt trời chiếu trực tiếp, diệt vi khuẩn canh trùng sau ngày Trong tổ chức động vật bị thối nát, vi khuẩn sống từ 1-3 tháng, chất sát trùng thường diệt khuẩn nhanh chóng: axit phenic 5%, crezil 3%, nước vơi 1%, formol 2% Vi khuẩn sống lâu sinh sản đất ẩm thiếu ánh sang chúa nhiều muối nitrat chất hữu Trong chuồng nuôi súc vật đồng cỏ vi khuẩn sống hang tháng có hang năm 3.Cấu trúc kháng nguyên Từ 1900 Ligninere bắt đầu nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên Pasteurella Năm 1947 thí nghiệm bảo hộ chuột Robert phân lập type P Multocida kí hiệu I, II, III, IV Năm 1952, Carter phát kháng nguyên vỏ đặc hiệu biến chủng dạng S dựa phản ứng kết tủa phân loại vi trùng thành type kí hiệu A, B, C, D Về sau, việc phân lập loại dựa phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Carter phát thêm type E loại type C Nhiều thí nghiệm chứng minh mối quan hệ hai cách phân type Robert Carter sau SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải Theo Carter A B D E Theo Robert II, III, IV I 3.1 Kháng nguyên Có hai loại kháng nguyên kháng nguyên K O Kháng nguyên K có vi khuẩn tạo dạng khuẩn lạc S khơng có dạng M R kháng nguyên K nhận cách cho canh trùng nuôi cấy vào nước sinh lý chiết xuất vòng 30 phút 580C Kháng nguyên K có hai thành phần α β, chúng cấu tạo từ protein polysacharid Các kháng nguyên khác kháng nguyên thân kí hiệu kháng nguyên O Có hai nhóm kháng nguyên O đặc hiệu kháng nguyên O không đặc hiệu Theo Carter, chuẩn có serotype khác khác theo kháng nguyên O, có serotype P đồng tồn nhóm kháng nguyên O Các khuẩn lạc chuyển từ dạng láng sang xù xì giữ nguyên kháng nguyên O 3.2 Độc tố Một tính chất quan trọng P Multocida tạo nên trình bệnh lý khả tạo độc lực vi khuẩn Những độc tố loại độc tố mà cấu trúc hóa học giống kháng nguyên O hợp chất Lipo-polysacharid có trọng lượng phân tử cao chứa Nito Photphat Lipo-polysacharid Pasteurella độc với thỏ, bê, chuột, gà Chúng có tính gây viêm sốt tạo miễn dịch chống vi trùng nhiều mức độ khác Gần đây, nhiều công trình xác định Pasteurella sản sinh loài độc tố khác, độc tố loại protein có số sa lắng 2.99x103 (trong đệm photphat pH=7 M-0.6) Việc tạo độc tố coi yếu tố đánh giá độc tính vi khuẩn Cần ý chuẩn tụ huyết trùng tạo độc tố thường nguyên nhân sinh bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn Nhiều thực nghiệm chứng minh dùng độc tố Pasteurella để chế vacxin phòng chống bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm lợn có hiệu 3.3 Tính bám dính vào mơ bào Gần đây, nhiều nhà nghiên cứu ý đến khu trú bám dính vào mơ bào Pasteurella coi tiêu quan trọng để giải thích q trình sinh bệnh vi khuẩn tạo huyết trùng Theo Jacques (1987), phát chủng hai sero type A D bám vào tế bào biểu bì khí quản khơng chắn, nhiên chủng tụ huyết trùng thuộc serotype A bám dính vào phần nhám tế bào biểu bì có lơng nhung Tác giả Pizoan Trigo (1989) phát chủng hai serotype A D bám dính thưa thớt thấy chủng serotype phần lớn lại bám dính vào tế bào khơng có lơng rung 4.Cấu trúc phân tử Do tầm quan trọng Pasteurella bệnh học thú y, người ta giải trình tự gen vi khuẩn phân tích 104 gen có liên quang đến khả lây bệnh gắn gen pasteurella multocida- chiếm 7% tổng số trình tự mã hóa gen khám phá vùng dài 2,4kb chứa hai yếu tố gây độc tiềm Pm gồm: pfhB1(pasteurella filamentous identical B1) pfhB2 dài lần lược 7,845 11,757 bp có trình tự giống trừ vùng bị xóa trung tâm trình tự pfhB1 hai yếu tố pfhB1 pfhB2 chứa vùng trình tự tương đồng với filamentuos hemaglutinin (FhaB) B pertussis (19-21) FhaB chi phối việc bám dình B pertussis lên tế bao chủ thành phần chủ yếu vaccine acellular sử dụng cho bảo vệ người SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải chống lai bệnh ho gà Có nhiều ý kiến cho pfhB1 pfhB2 thành phần gây độc pasteurlla Vì có đặc điểm sau: -Thứ đầu amino – terminal pfhB1 pfhB2 theo mơ hình N(P/Q)NG(I/M) mơ hình liên quan đến tiến trình sau phiên mã tín hiệu ngoại bào -Thứ hai: vùng trung tâm chứa đựng nhiều protif đặt tính hộ Sự diện vùng bảo vệ giống với FhaB B pertussis , hai pfhB1 pfhB2 thành phần bám vi khuẩn lên tế bào chủ -Thứ ba: đầu tận cacboxy chứa vùng với độ tương đồng cao(66% aminoacid giống nhau)tương tự protein kháng huyết p76 Haemophilus somnus Khả giúp cho vi khuẩn tăng khả sống xót thể vật chủ tăng cường khả gây bệnh cho vật chủ Figure Circular representation of the genome of Pm, Pm70 The Pm genome and its coding regions with homologies, the tRNA and rRNA operons, and the overall G-C content are presented The outer circle represents the scale in base pairs with the origin noted The outer arrows represent the 57 tRNAs and the inner arrows represent the complete rRNA operons (16S–23S–5S) The 2,014 potential coding sequences are represented by colors depicting homology to both Ec and Hi (green), Ec alone (purple), Hi alone (light blue), or to organisms other than Hi or Ec or unique to Pm (red) The G-C % of each coding sequence is represented in the interior circle by different shades of pink in increments of 5%: the lightest pink represents a G-C % of 25–30% whereas the darkest pink represents 45–50% The figure was generated by using genescene software (DNAstarMadison, WI) II.2 VACCINE PHÒNG BỆNH Để phịng bệnh tụ huyết trùng, có nhiều loại vaccine khác bao gồm vaccine truyền thống vaccine sản xuất từ việc ứng dụng kỹ thuật cơng nghệ sinh hoc Sau tìm hiểu số loại vaccine Vaccine truyền thống a.Vaccine tụ huyết trùng vơ hoạt nhũ hóa keo phèn Đây loại vaccine có dạng nhũ tương nước dầu(water in oil) hiểu sau: sau nhũ hóa pha nước pha dầu gần hòa tan vào nhau, tao nên cấu trúc gồm hạt dầu bao quanh hạt kháng nguyên>> đặc điểm mà kháng nguyên tồn lâu thể có lớp dầu bảo vệ tránh bị enzyme phân hủy, tránh bị đào thải nhanh thể>> gây kích thích miễn dịch kéo dài SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải Gần số đọc giả chứng minh chủng vaccine FgHC( lợn) chủng vaccine IR, P2O5(trâu,bò) thuộc serotype B Từ nghiên cứu chủng P2O5 chọn làm chủng vaccine nhũ hóa cho trâu bị lợn Hiện ứng dụng công nghệ sinh học kháng nguyên tụ huyết trùng vaccine nói chế nồi kên men sục khí độ đậm cuả vi khuẩn tăng 20 lần Do liều tiêm điều kiện giảm hang chục lần Vật liệu kháng nguyên vỏ vaccine loại gồm vỏ polysaccharide vật liệu phân lập từ tế bào nhiều phương pháp khác giết chết vi khuẩn sản xuất vaccine hệ thống miễn dịch, phân tách dung dịch saline.Tốt là, nhiên, vật liệu kháng nguyên vỏ bao gồm protein đặc biệt lipopolysaccharide polysaccharide Nó chắn việc thêm protein lipopolysaccharide thành phần tế bào phân tách capsure làm tăng tính kháng nguyên khả miễn dịch so sánh với phân tách capsure chứa đựng chủ yếu polysaccharide Phân tách thành phần vỏ vi khuẩn theo nhiều cách thích hợp khác sử dụng dung dịch thiocyanate, Cetavlon Cetrimide Protein lipopolysaccharide sử dụng vaccine xử lý với salicylate eg aqueous sodium salicylate Trong việc chủng bị vaccine thích hợp cho thể phát triển trì, nguyên liệu kháng nguyên tương ứng đạt từ thể đưa vào vaccine Kháng nguyên vỏ đưa vào thể nhiều kỹ thuật thích hợp Chủng bị số vaccine :1 nhiệt sinh vật chết toàn (HKO) gel nhơm hydroxit(Alhydrogel)/nhũ hóa dầu(AO);2 vỏ phân tách hồn tồn chất bổ trợ Freund;3 trích gel nhơm hydroxit (Alhydrogel)- nhũ hóa dầu(AO) Việc chuẩn bị vaccine sau: Chuẩn bị vaccine - HKO AO Các sinh vật P haemolytica serotype A2, chủng FA2 nuôi cấy, đánh dấu cho tinh khiết tiêm chủng vào Oxiod No2, hai chủng nuôi 370C 18h với đảo trộn Tốc độ tăng trưởng kết cho chủng vào 1.5 l Oxiod No2, sau ấp 6h điều kiện tương tự Tốc độ tăng trưởng tìm thấy phạm vi 109 sinh vật ml, xác định phương pháp EEL đo dộ đục Vi khuẩn thu hoạch ly tâm 4oC 20 phút 12.000g vi khuẩn sau bị giết xử lý nhiệt 60oC 16 phút Nồng đọ tối ưu cho nhiệt giết vi sinh vật cho hấp phụ vào gel nhơm Hydroxit(Alhydrogel, Miles phịng thí nghiệm, Slough, Anh) xác định chủng độ theo hướng dẫn nhà sản xuất(Miles phịng thí nghiệm, Slough, Anh) Các kháng nguyên sau hút bám vào hydroxit nhôm kết thể chuyển thành dạng khối lượng Bayol F(Esso Petroleum, NJ, USA) chứa 10% Aracel A (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo., USA) - Viên nang xuất AO Serotype A2, chủng FA2, vi sinh vật nuôi thu hoạch việc chủng bị cuả HKO AO mô tả Tuy nhiên, sau thu hoạch, vi khuản lắng xuống tạo thành dịch huyền phù 0,1 natri salicylate nước cất đến 1/10 khối lượng ban đầu sau , ni có khốy trộn 37oC 3h ly tâm 2800g 4oC 40 phút Phần mặt, ống thẩm tách, thẩm tách sau đó, chống lại thay đổi dung dịch buffered phosphat saline (pH 7,2) ° C Qua khoảng thời gian 48h tập trung vào bình 37oC Các hoạt động tập trung kháng nguyên xác định SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải thử nghiệm haemagglutination gián tiếp chống lại kháng huyết thỏ tiêu chuẩn cho trường hợp tương đòng serotype cua P haemolytica Các viên nang lưu trử cất giữ -20oC Đối với vaccine HKO nồng đọ tối ưu kháng nguyên vỏ xác định chuẩn độ, thành phần trích vỏ hút bám Alhydrogel cố định kết thành dạng sữa với khối lượng Bayyol chứa Aracel cung cấp capsure A2 AO vaccine - Viên nang chiết xuất CFA Viên nang xuất loại A2, chủng FA2, vi sinh vật P haemolytica chuẩn bị mơ tả Trích lọc nồng độ capsure A2, nồng độ tương tự viên nang xuất AO vaccine, sau kết hợp homogenization nước cất vào CFA(một phần chất trích vỏ phần chất bổ trợ) b Vaccine nhược độc Pasteurella vi khuẩn có nhiều biến đổi, khơng ổn định, chúng chuyển từ dạng khơng độc thành dạng độc ngược lại việc dùng vaccine nhược độc có nhiều rủi ro, đem gieo rắc mầm bệnh, làm cho việc phòng chống bệnh trở nên phức tạp Rất khó tạo vùng an tồn sau sử dụng vaccine nhược độc Vaccine nhược độc sử dụng tình trạng cấp bách tiêm vào ổ dịch xuất Những hướng sản xuất vaccine Bệnh loài Pasteurella nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế quan trọng toàn giới Những vi khuẩn hoạt động thứ cấp sơ cấp mầm bệnh gây phổ rộng dịch bệnh, gọi chung pasteurellosis từ nhiễm trùng huyết đến viêm phổi Pasteurella multocida công nhận mầm bệnh thú y quan trọng Tên Serotype dựa capsular kết hợp kháng nguyên-kháng nguyên somatic (capsular kháng nguyên A đến F kháng nguyên soma 1-16) Một số serotypes P multocida gây nhiễm trùng huyết xuất huyết (HS), bệnh gia súc trâu với tỷ lệ tử vong cao ảnh hưởng kinh tế có ý nghĩa Châu Á Châu Phi Tại Nam Á,chiếm ưu serotype B: (36) HS pasteurellosis đặc trưng ga nhiễm trùng huyết khác biệt từ pasteurelloses khác, P multocida có vai trị phụ Cái yếu tố độc tính P multocida chịu trách nhiệm cho HS không xác định, kháng nguyên chịu trách nhiệm miễn dịch tự nhiên chưa biết Một số kiểm soát đạt với vaccine phèn-tủa vaccine nhũ hóa giết chết tế bào tiêm da(sc), vắc xin có bất lợi cung cấp miễn dịch ngắn hạn-(7) yêu cầu hàng năm quản lý cho hiệu (10) Vắc xin nhũ hóa dầu có bất lợi độ nhớt cao, mà làm cho họ không ưa chuộng người dùng trường, cải thiện Đáng kể hiệu ứng mạnh mẽ lưu trữ tiềm phèn các-tủa nhiễm trùng máu xuất huyết (APHS) Thuốc chủng ngừa báo cáo.chủng ngừa APHS, nhà khoa học thong qua nhiễm trùng thánh thức thỏ tiêm(pót 60 ngày kể từ ngày tiêm phịng),cho thấy hiệu lực 100% lưu trử 4oC 30 ngày Và hiệu lực giảm xuống 20% thời gian lưu trữ mở roongjdeends 60 nhiều ngày Ở 30oC, hiệu lực giảm 40, 40 60 tương ứng sau 30,60,90 ngày lưu trữ Trong 37 o C , hiệu lực giảm 60, 60 100% sau 30,60 90 ngày kể từ ngày lưu trũ tương ứng theo quan điểm này, vaccine nhũ hóa HS, vaccine phát trienr ni Pasteurella multocida môi trường gồm men, sucrose, trypticase bicarbonate natri, thong khí liên tục 37oC Điều nầy đưa số vi khuẩn tốt nhiều(số tối đa 15x108/ml) 10 SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải vaccine APHS thường tiêm ( ttoois đa 6x108/ml) Các vaccine OAHS nhũ tương dầu ổn định nhiệt độ phòng năm Nhật ký bảo vệ giá trị hai loại vaccine OAHS, nghiên cứu chuột, 5,2 5,3 so với 1.9 vaccine APHS Hiện nay, nước giới sử dụng vaccine vô hoạt nhũ hóa dầu để phịng bệnh pasteurella Tuy nhiên với phát triển kỹ thuật công nghệ sinh học, nhà nghiên cứu khảo nghiệm số loại vaccine sản xuất theo phương pháp Sau số đề xuất *** Nghiên cứu sử dụng gen Pasteurella lipoprotein E kháng nguyên vaccine Họ tiến hành tái tổ hợp gen vào E.coli Ecoli tổng hợp protein gen qui định phân tách để làm vaccine Trong khía cạnh, phát minh cung cấp chủng ngừa tiểu đơn vị để bảo vệ động vật từ bệnh P multocida, đặc trưng bao gồm Pasteurella lipoprotein E (PlpE) kháng nguyên, tá dược thú y chấp nhận được.Trong cách hiểu pasteurella lipoprotein E protein có trình tự axid amin liệt kê SEQ ID EF219452-EF219457 (SEQ ID No 1-6) hay axit amin với trình tự tường đồng 90% axit amin trình tự liệt kê SEQ ID EF219452-EF219457 (SEQ ID No 1-6) Trong khía cạnh khác, phát minh cung cấp sử dụng E lipoprotein Pasteurella việc kiểm soát bệnh lây nhiễm gây P multocida, rối loạn liên quan Tóm tắt nghiên cứu sau: Gen mã hóa lipoprotein E P multicoda(plpE) lipoprotein B(plpB) tạo dòng từ p multicoda chủng X- 73 serotype A:1 biểu vào E.coli Miễn dịch bảo vệ nhận PlpE tái tổ hợp(rPlpE) PlpB tái tổ hợp(rPlpB) có giá trị chuột gà Kết cho thấy, đáp ứng miễn dịch chuột với 10g rPlpE tinh khiết bảo vệ(80100%)kháng lại yếu tố gây nhiễm với 10 20 LD50 P multicoda chủng X73 ( serotype A:1), P-1059(serotype A:3) P-1662(serotype A:4) Trong nghiên cứu khơng có đáp ứng miễn dịch chuột với rPlpB không bảo vệ gà, đáp ứng miễn dịch với 100g rplpE tinh khiết bảo vệ 63-100% kháng lại yếu tố gây nhiễm với chủng X-73 P-1662 ngược lại với rplpB khơng Phân tích trình tự cho thấy plpE khác chủng P.multicoda biểu 90,8-100% tương đồng Ví dụ: Chuẩn bị tái tổ hợp Lipoprotein E (r-PlpE) P multocida E coli (1) Giống vi khuẩn phân lập DNA gen P multocida P multocida chủng chuẩn X-73 (A:1), P-1059(ATCC 15742) (A:3), P-1662 (A:4) nuôi 37oC não tâm huyền (BHI) canh(Difco phịng thí nghiệm, MI, Hoa Kỳ) vịng 18-24h.DNA gên phân lập sử dụng kit DNeasy tissue(Qiagen, Hilden, Germany) (2) tạo dòng gen vector biểu xây dựng lipoprotein E tái tổ hợp từ chủng P multocida X-73 Các gen khuếch đại sau sử dụng để thể PlpE tái tổ hợp(rPlpE) E.coli trình tự mồi P1/P2 sau: P1: 5'-CCA TGG GCA TGA AAT TAA CAA AAC TTT T-3', and P2: 5' AAG CTT CCA ACC TTT AAC TAC ACC ACC-3' P1: 5'-CCA TGG GCA TGA AAT TAA CAA AAC TTT T-3 ', P2: 5' AAG CTT CCA ACC 11 SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải TTT AAC TAC ACC ACC-3 ' mồi chứa ezyme hạn chế (NcoI XhoI) cắt vị trí đàu kết thúc 5’( gạch chân dãy), trình tự cụ thể plpE Các sản phẩm PCR nhân vào pET28a vector biểu theo hướng dẫn nhà sản xuất (Novagen, Inc Madison, Wis) đẻ thu plasmid pX73-PlpE Bản chất chền vào pET28a xá nhận qua phân tích chuỗi trình tự DNA.trình tự amino rprotein PlpE mô tả SEQ ID (3) Biểu tinh lipoprotein tái tổ hợp(r-PlpE) Plasmid tái tổ hợp pX73-PlpE thu phần (1) chuyển vào E.coli chủng BL21(DE3) protein tái tổ hợp tinh chế sắc ký niken(Chang PC, et al, 2002., Dịch cúm gà Tháng Mười Hai 46:570 80) Nói tóm lại chủng E.coli BL21 chứa plasmid tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LB 37oC hấp thu qua bước sóng 600nm đạt 0,6 Isopropylthio-.beta.-D-thiogalactose (IPTG) nồng độ cuối 0,4 mM tiếp tục nuôi cấy thêm 3h tế bào viên tròn máy ly tâm 3000 vòng/phút 20 phút, tạo huyền phù 2ml dung dịch đệm bắt buộc(20 mM Tris pH 7,9, mM imidazol, 500 mM NaCl) Kết đồng ly tâm 12000 vòng /phút 40 phút Phần nỗi mặt thu thập nộp vào cột chứa 2,5 ml dung dịch Novagen Cột rữa 25ml đệm 15 ml giải đệm((20 mM Tris pH 7,9, 50 mM imidazol, 500 mM NaCl) đẻ loại bỏ protein không cần thiết protein bị bắt giữ tách với 15ml dung dịch rữa giải đệm(20 mM Tris pH 7,9, 250 mM imidazol, 500 mM NaCl), có 3ml dung dịch tách đầu tiền thu nhận Protein quan tâm xác định cách sử dụng kít "Protein Assay" (BIO-RAD, Hercules, California, Mỹ) Các sản phẩm biểu độ tinh khiết protein tái tổ hợp quan sát SDS-PAGE western blotting, tương ứng Western blotting phân tích sử dụng kháng thể chống Hexa-histidine đơn dòng Kết cho thấy kháng thể đơn dòng phản ứng với r-PlpB r-PlpE, nữa, hai r-PlpB r-PlpE tạo hai nhóm blot Nhóm có kích cỡ tương ứng với khối lượng phân tử rPlpB r-PlpE(31,5 38,7 KDA), nhóm nhỏ có khối luong phân tử (29,3 36,3 KDA) Kết cho thấy số đột biến r-PlpB r-PlpE xảy E coli Hình Expression Lọc r-PlpB r PlpE-in E coli (A) Coomassie blue-stained SDS-PAGE protein tái tổ hợp từ chiết xuất dầu thô mẫu tinh khiết Lane M đại 12 SVTH:Phan Thị Anh Văn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VACCINE PHÒNG BỆNH DO PASTEURELLA GVHD: PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải diện cho đoàn thể đánh dấu phân tử Các đánh dấu kiểm sốt có chứa chiết xuất dầu thô E coli chứa plasmid không tái tổ hợp (B) immunoblot gel thăm dị nhân đơi với chống chuột-Hexa-histidine đơn dịng kháng thể Các nhóm tương ứng với rPlpB, r- PlpE sản phẩm chế biến họ định mũi tên Đánh giá bảo hộ Tác dụng r-PlpE Đơn vị nhỏ vắc xin BALB / c Chuột Mẫu Ba thí nghiệm tiến hành BALB / c chuột Trong thí nghiệm 2, nhóm chuột 6-tuần tuổi chích ngừa da với 10 microgram r tinh khiết-PlpB r-PlpE chất bổ trợ hydroxit nhôm (Sigma-Aldrich Co, MO, Mỹ), với bacterin gồm 1.25.times.10.sup.7 2.5.times.10.sup.7 CFU bất hoạt formalin-P multocida X-73 (A: 1) Hai tuần sau tiêm chủng, chuột thử thách với tiêm da 10-20 LD.sub.50 chủng X-73 Trong thử nghiệm 3, chuột chích ngừa mơ tả cho thí nghiệm Hai tuần sau tiêm chủng, chuột thử thách với tiêm da 10 LD.sub.50 chủng P-1059 (A: 3) P-1662 (A: 4), T2A5 chủng (mà chủng thách thức sử dụng thuốc kiểm tra Đài Loan) Mọi chuột thách thức quan sát 10 ngày tỷ lệ sống họ ghi lại Các kết tóm tắt bảng Để phân tích thống kê, tỷ lệ sống cịn so sánh Chi-bình phương thử nghiệm cách sử dụng phần mềm SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC, Mỹ) Những lần có nghĩa chết so sánh cách sử dụng thủ tục GLM phần mềm tương tự Sự khác coi đáng kể p