PHÁT HIỆN VIRUS GUMBORO BẰNG PHƯƠNG PHÁP kết tủa TRÊN THẠCH

PHÁT HIỆN VIRUS GUMBORO BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRÊN THẠCH GVHD:TS.Nguyễn Ngọc Hải SVTH :Phan Thị Phương Thanh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I.LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ kỹ thuật sinh học phân tử đời,nó mở cánh cửa hy vọng đầy tiềm cho nhà khoa học nói riêng cho tồn giới nói chung.Với thao tác vật liệu mức độ phân tử DNA,RNA,protein…các kỹ thuật sinh học phân tử phát loại vi khuẩn,virus gây bệnh diện thể sinh vật Ngành nơng nghiệp chăn ni gia cầm đóng vai trị quan trọng tồng thu nhập quốc gia quốc gia phát triển.Thế nhưng,ngành chăn nuôi ngày phải đối mặt với nhiều vấn đề nghiêm trọng sức khỏe vật ni.Tình hình dịch bệnh ngày lan rộng với chủng virus mới,các chủng virus đột biến gây khó khăn nhiêu cho việc chẩn đốn chữa trị cho vật ni.Do vậy,sẽ khả thi áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán chữa trị Bệnh Gumboro bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây thiệt hại lớn cho chăn nuôi gà, kể gà nuôi công nghiệp gà chăn thả vườn .Tỷ lệ chết gà bị nhiễm bệnh từ 3-20% không ghép với bệnh khác từ 21-100% nhiễm kèm với bệnh khác gây virút, vi khuẩn, ký sinh trùng.Việc áp dụng kỹ thuật phân tử vào việc phát virus Gumboro gia cầm rút ngắn thời gian việc chữa trị hạn chế lây lan mầm bệnh hiệu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.TỔNG QUAN II.1.Giới thiệu bệnh Gumboro Gumboro bệnh truyền nhiễm cấp tính gà gà tây gây Infectious bursal disease virus (IBDV),đặc trưng phá huỷ túi Fabricius Đây nhóm virus gây bệnh thuộc nhóm khơng có vỏ bọc, có sức chịu đựng cao, thời gian nung bệnh ngắn, khả truyền bệnh mạnh Mầm bệnh sống hàng tháng chuồng trại, hàng tuần nước uống, thức ăn, phân Lứa tuổi gà mắc bệnh cao từ - tuần tuổi, gà nhỏ mắc bệnh thể tiềm ẩn, không biểu triệu chứng, ảnh hưởng quan trọng làm ức chế miễn dịch, gà dễ mắc bệnh nhiễm khuẩn khác Mặt khác, trơ với việc chủng ngừa có hiệu Trong năm gần đây, nhiều dịng chủng IBDV (vvIBDV), ngun nhân gây tử vong đồng loạt gà, xuất châu Âu, Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi Trung Đông Theo điều tra gần nước ta, gà cơng nghiệp có tỷ lệ mắc bệnh cao, Gumboro coi bệnh truyền nhiễm gà Gà ta nuôi theo phương thức bán công nghiệp mắc bệnh, nhiều đàn tỷ lệ chết lên đến 20-25% II.2.Lịch sử phát Năm 1962, Cosgrove phát mô tả bệnh mới, xuất thành phố Gumboro, vùng Dalaware Hoa Kỳ Bệnh thường thấy gà với bệnh tích thường gặp chủ yếu thận túi Fabricius Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh biến thể bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) bệnh tích thận tương đối giống Lúc người ta gọi bệnh hư thận gà triệu chứng không tái hấp thu nước tiểu, làm gà tiêu chảy nặng, gây nước Về sau bệnh lan dần khắp châu lục có bệnh Sau này, Winterfield Hitchner chứng minh gà miễn dịch với IB nhiễm bệnh viêm túi Fabricius Cuối năm 1962, Winterfield phân lập từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm gà (bệnh tích túi Fabricius thận) Năm 1986-1987, lần dòng biến thể IBDV công bố LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Năm 1987, nguy hiểm IBDV lần công bố Belgium The Netherlands Năm 1970, Hitchner đề nghị tên thức cho bệnh Infectious Bursal Disease (IBD) hay gọi Gumboro Virus gây bệnh Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) Ở Việt Nam bệnh phát vào năm 1981 số trại nuôi gà công nghiệp thuộc tỉnh phía Bắc, lúc chưa ý, vào năm 1987-1993 bệnh phát triển mạnh gây chết nhiều gà, từ gây ý cho nhà chuyên môn Nhiều biện pháp phòng bệnh nghiên cứu, nhiên ngày việc khống chế bệnh cịn phía trước II.3.Sơ lược túi Fabicius Túi Fabricius quan dạng lympho, nằm gần hậu mơn Trong q trình phát triển bào thai, xuất sau tuyến ức giống tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô Túi Fabricius quan dạng lympho trung ương, q trình biệt hóa túi diễn khơng bị ảnh hưởng kích thích kháng ngun từ bên ( http://www.ag.auburn.edu) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Túi Fabricius nhỏ sớm: gà khoảng tháng thứ (tuổi dậy thì), bắt đầu teo tới tháng 11-12 hẳn Chia túi thành đơn vị cấu trúc gọi nang (Foliculum) Mỗi nang gồm có vùng vỏ giàu lympho bào vùng tủy tế bào có chứa tương bào (http://images.google.com.vn) Đây cịn nơi biệt hóa dịng lympho B II.4.Virus IBDV II.4.1.Về cấu trúc sinh học IBDV có dạng hình khối, nhiều gốc cạnh, khích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.10 Dalton (Nick, 1976) IBDV virus dạng trần, khơng có vỏ bọc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (http://images.google.com.vn) IBDV có cấu trúc mạch đơi RNA cuộn trịn phân thành đoạn riêng biệt, thuộc loài Avibirnavirus họ Birnaviridae (Leong et al., 2000) Quanh nhân vỏ protein (vỏ capsid) Lớp capsid hợp thành 32 capsomer (đơn vị hình thái) Mỗi capsomer tạo loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 VP5 (Viral Protein-VP) IBDV genome chứa hai mạch, A B Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta cho enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987) Polipeptide diện dạng virus nghỉ tế bào chủ (virion), mang chất protein tự protein liên kết genome (còn gọi VPg) VPg cố định vào đuôi 5’ sợi dương mạch genome (Dobos, 1993; LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Spies & Muller, 1990) Mạch A lớn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF) ORF nhỏ mã hóa cho protein khơng cấu trúc VP5, khơng cần thiết cho q trình chép virus in vitro lại quan trọng khả gây bệnh virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998) ORF lớn mã hóa cho polyprotein 110 kDa, tự xác tác phân cắt hình thành loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) VP4 (28 kDa) VP4, loại enzyme protease phân cắt serinelysine (Birghan et al., 2000), cịn tham gia trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999) pVP2 tách thêm RNA dư thừa Carbon cuối để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000) VP2 VP3 protein cấu trúc Trong đó, VP2 chứa vị trí kháng nguyên quan trọng hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993) II.4.2.Về miễn dịch IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, có loại serotype có khả gây bệnh gia cầm Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà Có khoảng loại kháng nguyên phụ serotype xác định thử nghiệm trung hòa ống nghiệm Những virus thuộc loại kháng nguyên phụ thường biết dạng biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong gà từ 60-100% Có khác kháng nguyên chủng cổ điển biến thể Miễn dịch chéo biến chủng nhỏ (Mc Ferran Cs 1980) Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây Về phương diện miễn dịch, hai serotype khơng có khả miễn dịch chéo với Tuy nhiên gà gà tây bị nhiễm chủng virus mà không phát bệnh II.4.3.Về sức đề kháng IBDV có sức đề kháng cao với tác nhân lý hóa mơi trường o Chịu đựng pH từ 2-12 (Benton cs, 1967) Ở 56 C, IBDV tồn o o 5h, 70 C bị tiêu diệt sau 30 phút, -50 C 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf cs, 1967) Trong chất thải, phân, nước tiểu, IBDV giữ nguyên tính gây nhiễm gây bệnh vịng 52 ngày LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform Trong phenol 0.5% o timerosal 1.125% 50 C 1h, formalin 0.5% 6h, chloramin 0.5% 10 phút Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, diệt IBDV II.4.5.Chất chứa mầm bệnh Thận túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus Ngoài ra, chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng chứa virus II.4.6.Đường xâm nhiễm lây truyền virus Gumboro Virus từ môi trường chuồng trại xâm nhập đường tiêu hóa vào thể để gây bệnh, từ gà bệnh virus thải theo thức ăn, nước uống xâm nhập đường tiêu hóa gà cịn khỏe làm lan truyền bệnh đàn Gà giống mang virus thể không truyền qua trứng, phơi khơng có virus Gumboro Gà từ ngày tuổi nhiễm virus Gumboro virus bám vào vỏ trứng qua dụng cụ chăn nuôi, chuồng trại không sát trùng mức Tuổi mẫn cảm gà virus Gumboro từ ngày tuổi đến tuần tuổi, thường gà tuần tuổi mắc bệnh II.4.7.Cơ chế xâm nhiễm Virus xâm nhập qua đường tiêu hóa gà, xuyên qua màng ruột đến đại thực bào quan Lympho ống tiêu hóa, từ Virus theo tĩnh mạch cửa vào gan lan tỏa khắp thể, đến ngày thứ virus có mặt quan sinh bạch cầu, tập trung nhiều túi Fabricius - Nếu gà nhiễm bệnh từ ngày đến tuần tuổi, máu gà chưa có bổ thể virus khơng cơng hệ thống mạch máu thận, phá hại túi Fabricius, làm túi hư hại teo nhỏ, trình nuôi dưỡng thành thục tế bào Lympho B bị đình trệ, dẫn đến hậu làm suy giảm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com việc tạo kháng thể thể gà, nguyên nhân việc gà khơng tạo miễn dịch tiêm phòng đầy đủ bệnh - Trường hợp nhiễm bệnh sau tuần tuổi, lúc máu có đầy đủ lượng bổ thể virus phát huy tác dụng gây nên triệu chứng vỡ mạch máu gây xuất huyết nhiều nơi, virus đến thận phá hoại ống thận làm gà tái hấp thu nước, hậu nước từ thận tràn vào trực tràng, gà tiêu chảy nặng, gà chết chủ yếu nước LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.4.8.Triệu chứng Gà bị nhiễm virus sớm, trước tuần tuổi mắc bệnh thể tiềm ẩn, khơng có kháng thể kháng thể mẹ truyền mức bảo hộ Gà khơng có triệu chứng lâm sàng lộ túi Fabricius bị tổn thương nặng (viêm, phù, xuất huyết sau bị teo) làm cho đáp ứng miễn dịch dịch thể bị ức chế Gà mắc thể bệnh giảm suất, khả miễn dịch yếu chủng ngừa vaccin phòng bệnh khác, đồng thời tăng khả mức độ trầm trọng mắc bệnh khác như: Cầu trùng, E.coli, Newcastle Gà nhiễm bệnh sau - tuần tuổi có biểu lâm sàng rõ rệt Mức độ nghiêm trọng bệnh tùy thuộc vào độc lực chủng virus gây bệnh Đối với gà thịt, bệnh Gumboro thường xảy lứa tuổi - tuần Cịn gà đẻ trứng bệnh phát lứa tuổi muộn hơn.Bệnh thường phát đột ngột với thời gian ủ bệnh ngắn (1 - ngày), tiến triển bệnh nhanh vòng - ngày, gần đồng loạt 100%, tỷ lệ chết cao vào ngày thứ 3, thứ 4, sau giảm dần, đến ngày thứ 7, gà hồi phục Tỷ lệ chết dao động khoảng - 30%, lên đến 60% tùy thuộc vào độc lực virus trạng thái miễn dịch đàn gà -Triệu chứng chủ yếu bỏ ăn, gục đầu vào cánh, hay mổ hậu môn lẫn nhau, uống nhiều nước, ỉa phân lỏng màu trắng nhày, thường nằm úp, mệt mỏi Gà gầy sút nhanh bị nước II.4.9.Bệnh tích II.4.9.1.Bệnh tích đại thể -Lách sưng -Thận sưng, biến đổi màu, ống niệu quản đầy muối urat -Xuất huyết đám ngực, đùi -Da chân khơ tóp lại (cơ thể bị nước tiêu chảy) -Dịch niêm mạc tăng -Túi Fabricius không ngừng bị biến đổi: Sau ngày nhiễm túi Fabricius tăng kích thước trọng lượng thủy thủng nang túi Đến ngày thứ trọng lượng tăng gấp 2-3 lần bình thường, nang viêm khơng Dịch nhày vàng lẫn hồng nang, có đám xuất huyết nang dẫn đến dịch chuyển màu vàng đục sánh, đơi có kèm bã đậu (fibrin) Có trường hớp dịch nhày bao quanh bên túi Đến LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ngày thứ trọng lượng túi Fabricius bắt đầu giảm teo dần, nang túi không đồng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.4.9.2.Bệnh tích vi thể Có hoại tử thành phần tế bào lympho như: túi Fabricius, van hồi manh tràng, lách Các thành phần tế bào lympho bị phá hủy, nhân tế bào bị teo rỗng Trong trường hợp nhẹ: Trong nang có đám thâm nhiễm lớn tế bào viêm mô nang Ở nang có tế bào rỗng tạo thành không bào (Vacuolas) thấy tượng hoại tử tế bào mảnh vụn tế bào bị phá hủy, làm thành khối Phản ứng viêm nhiễm không phân biệt rõ Việc tế bào bị phá hủy dẫn đến việc biến LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hoàn toàn nang lympho Tại chỗ chúng phát triển tế bào biểu mơ phân biệt Trong trường hợp cấp tính: Ở mơ đệm nang thường thấy đầy hồng cầu bề mặt Ở lớp tế bào thấy xuất thành phần tế bào hồn tồn bị lệch vị trí, có mảnh tế bào dịch nhày màu hồng Tóm lại: tồn q trình nhiễm có mủ hoại tử với xuất không bào III.Phản ứng kết tủa khuyếch tán thạch để phát virus Gumboro III.1.Nguyên lý Sự kết hợp đặc hiệu kháng nguyên hòa tan kháng thể tương ứng xảy hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, phức hợp kháng nguyên-kháng thể đạt mức độ định có bảo hịa, lúc xảy tượng kết tủa Nếu thiếu thừa thành phần kết tủa khó xảy Sự kết tủa biểu chất cặn màu trắng xám trơng rõ Sự kết tủa địi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải III.2.Các phản ứng kết tủa môi trường thạch agar III.2.1 Phản ứng kết tủa khuếch tán ống nghiệm Đây phản ứng lợi dụng tính khuếch tán kháng nguyên kháng thể, để chúng gặp kết hợp với nhau, chổ có đồng tương ứng kháng ngun–kháng thể có kết tủa -Ứng dụng: Phản ứng kết tủa khuếch tán ống nghiệm chủ yếu để phát kháng nguyên định lượng kháng nguyên - phương pháp thực hiện: +Phương pháp kết tủa khuếch tán thạch đơn giản Oudin Cho thạch kháng thể trộn lẩn với nha, cho vào ơng nghiệm Sau cho kháng nguyên vào mặt thạch, kháng nguyên khuếch tán xuống gặp kháng thể tương ứng, kết tủa xuất vùng mà kháng nguyên-kháng thể có tỷ lệ tương ứng +Phương pháp kết tủa khuếch tán kép Oúkeyfulthor Cho kháng thể vào ống nghiệm, cho thạch vào, sau cho kháng nguyên lên thạch Sẽ có khuếch tán lên kháng thể khuếch tán LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com xuống kháng nguyên, vùng kết tủa xuất chổ kháng nguyênkháng thể có tỷ lệ đồng tương ứng Có thể làm ngược lài cho kháng nguyên vào trước, đến thạch sau kháng thể Kết tương tự + Phản ứng kết tủa khuếch tán thach phiến kính (phương pháp Ouchterlony) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (: www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi) Thực chất phản ứng kết tủa khuếch tán kép, dễ làm, thông dụng III.2.1.2Vật liệu để chẩn đoán bệnh Gumboro theo phương pháp kết tủa khuếch tán thạch: Kháng nguyên: Thận, lách, túi fabricius gà có triệu chứng bệnh, bệnh tích đặc trưng đem nghiền nhỏ pha với dung dịch PBS với tỷ lệ ½, xử lý kháng sinh, đơng tan lần Huyết thanh: Sử dụng huyết dương tính tự chế III.2.3.Ứng dụng +Khảo sát mối quan hệ kháng nguyên, kháng thể +Định lượng sơ hiệu giá kháng thể huyết xúc vật gây miển dịch -Tiến hành: +Chuẩn bị vật liệu: * Agar Difco 1.5g * NaCl 8.5g * Phenol 0.5ml * Nước cất vừa đủ 100ml + Cách làm: Hòa muối phenol nước cất, chỉnh pH=7.5, cho agar vào đun cách thủy cho tan, lọc qua vải gạc Sau đổ thạch lên lam kính o lớp dày khoảng 3mm để lam nhiệt độ 4-10 C/10 phút cho thạch đơng lại Dùng ống sắt có dường kính 3mm đục lổ, cụm lổ, lổ lổ xung quanh: * Lỗ cho huyết biết * Các lỗ xung quanh lỗ cho kháng nguyên chuẩn dương ứng với huyết biết để làm đối chứng dương, lỗ tiếp cho kháng nguyên âm tính để làm đối chứng âm, lỗ cịn lại cho kháng ngun cần chẩn đốn o Sau cho vào tủ ấm 37 C từ 6-24h, đem đọc kết Nếu thấy huyết kháng nguyên nghi xuất vạch kết tủa giống huyết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kháng nguyên chuẩn kháng nguyên nghi tương ứng với kháng thể Có thể làm ngựơc lại cho kháng nguyên biết vào lỗ giữa, lỗ lại cho huyết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com IV.KẾT LUẬN Bệnh Gumboro bệnh nguy hiểm gà có khuynh hướng lây lan nhanh đàn gà công nghiệp gây thiệt hại mặt kinh tế cho hộ chăn nuôi Phương pháp phát virus Infectious bursal disease kỹ thuật kết tủa thạch phương pháp phù hợp để rút ngắn thời gian xét nghiệm.Do việc chữa trị mang lại hiệu cao hơn,ít gây thiệt hại mặt kinh tế Phương pháp kết tủa thạch phương pháp đơn giản,nhanh chóng tương đối rẻ tiền ,có thể áp dụng dễ dàng phịng thí nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com V.Tài liệu tham khảo 1.Nguyễn Ngọc Hải, 2007, Công Nghệ Sinh Học Trong Thú Y, NXB Nông Nghiệp 2.http://www.bioportfolio.com/search/ouchterlony_d ouble_immuno_diffusion 3.Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K29 4.http://www.ag.auburn.edu 5.http://images.google.com.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... nguyên–kháng thể có kết tủa -Ứng dụng: Phản ứng kết tủa khuếch tán ống nghiệm chủ yếu để phát kháng nguyên định lượng kháng nguyên - phương pháp thực hiện: +Phương pháp kết tủa khuếch tán thạch đơn giản... kỹ thuật kết tủa thạch phương pháp phù hợp để rút ngắn thời gian xét nghiệm.Do việc chữa trị mang lại hiệu cao hơn,ít gây thiệt hại mặt kinh tế Phương pháp kết tủa thạch phương pháp đơn giản,nhanh... tượng kết tủa Nếu thiếu thừa thành phần kết tủa khó xảy Sự kết tủa biểu chất cặn màu trắng xám trông rõ Sự kết tủa địi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải III.2.Các phản ứng kết