PROTEIN tái tổ hợp và VIRUS GUMBORO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NỘNG LÂM TP.HCM Báo cáo chuyên đề: PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ VIRUS GUMBORO Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Phan Thành 1    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Gumboro hay gọi Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) virus ARN sợi đôi, gây viêm túi Fabricius, xuất huyết cơ, hư hại thận thể cấp gà Làm chậm tăng trưởng, gây suy giảm miễn dịch, tạo tỉ lệ chết khoảng 5-20% (nhiều thống kê cho lên đến 60-100% đàn gà nuôi) Virus lây lan nhanh qua nhiều đường Việc kiểm sốt phịng bệnh khó khăn, đặc biệt chủng IBDV xuất làm cho vaccine phòng bệnh trở nên hiệu (nhiêu nơi vaccine bị tác dụng) Vì vấn đề tìm hiểu IBDV tìm lọai vaccine để thay quan trọng II TỔNG QUAN Virus Gumboro – Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) 1.1 Lịch sử: Năm 1962, Cosgrove phát mô tả bệnh mới, xuất thành phố Gumboro, vùng Dalaware Hoa Kỳ Bệnh thường thấy gà với bệnh tích thường gặp chủ yếu thận túi Fabricius Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh biến thể bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) bệnh tích thận tương đối giống Sau này, Winterfield Hitchner chứng minh gà miễn dịch với IB nhiễm bệnh viêm túi Fabricius Cuối năm 1962, Winterfield phân lập từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm gà (bệnh tích túi Fabricius thận) 2    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Năm 1986-1987, lần dòng biến thể IBDV công bố Năm 1987, nguy hiểm IBDV lần công bố Belgium The Netherlands Năm 1970, Hitchner đề nghị tên thức cho bệnh Infectious Bursal Disease (IBD) hay gọi Gumboro Virus gây bệnh Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) 1.2 Đặc điểm cấu trúc: Thuộc họ Birnaviridae, có kích thước khoảng 55-65nm, phân tử khối 2.106 Dalton (Nick, 1976) Bộ gen gồm hai đoạn ARN sợi đôi (đọan nhỏ B đọan lớn A), có kích thước khác nhau, khoảng 2800 3400 bp (nên gọi Birnavirus) Virion khơng có vỏ capsid, có cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, cấu thành 32 capsomer tạo thành protein có khối lượng phân tử 90, 41, 32, 28, 17 kD Đoạn nhỏ (segment B) mã hóa VP1-là ARN polymerase virus Polypetide diện virus nghỉ ngòai tế bào chủ (virion), mang chất protein tự protein liên kết genome (còn gọi VPg) VPg cố định vào đuôi 5’ sợi dương mạch genome (Dobos, 1993) Đoạn lớn (segment A) có hai khung đọc mở (ORF- Overlapping open Reading Frame) Khung lớn monocistron mã hóa tiền protein 110 kD phân cắt thành VP2, VP3, VP4 VP2 VP3 protein cấu trúc chính, VP2 coi kháng ngun bảo vệ (host protective antigen) đồng thời kháng nguyên đặc hiệu type (serotype specific antigen) chịu trách nhiệm cảm ứng tạo kháng thể trung hòa VP3 kháng nguyên đặc hiệu nhóm (group specific antigen) serotype phát kháng thể không trung hòa (nonneutralising antibodies) phản ứng chéo serotype serotype VP4 protease virus tham gia vào trình phân cắt polyprotein (cắt serine-lysine) 3    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khung nhỏ mã hóa cho protein khơng cấu trúc VP5, khơng cần thiết cho trình chéo virus in vitro lại quan trọng khả gây bệnh virus (Mundt et al., 1997) Hình 1: Cấu trúc virus Gumboro (expasy.org) Hình 2: Cấu trúc genome vủa virus Gumboro (expasy.org) 4    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.3 Đặc điểm kháng nguyên miễn dịch Có hai serotype virus Gumboro khác trọng lượng đoạn ARN định kháng nguyên VP2: serotype gây bệnh gà serotype không gây bệnh Hai serotype phân biệt phản ứng trung hịa (VN) mà khơng thể phân biệt phản ứng kháng thể huỳnh quang ELISA Gây miễn dịch serotype không bảo vệ gà gây nhiễm virus serotype Bằng kỹ thuật huyết học (VN MCA-monoclonal antibodies) người ta phát Mỹ có nhiều biến chủng khác với chủng cổ điển serotype (Rosenberger, 1985) Các virus vaccine hành thuộc chủng cổ điển không tạo miễn dịch đầy đủ biến chủng Các virus có độc lực cao phát lần đầu Bỉ, Hà Lan số nước khác châu Âu (1987) Và châu Á, bệnh gây tỉ lệ chết cao có cấu trúc kháng nguyên tương tự serotype cổ điển Ở Việt Nam, nhà khoa học phân lập số chủng cường độc thuộc serotype (Lê Thanh Hòa ctv 1992) GSG4  99  NUCLEOTIDE  GvxBL  100  Gvx2512  BDG23  D78  JD1  99  99  99  CHÂU MỸ 52‐70  SH92  100  OKYM  HK46  99  BDG  99  100  0,005  CHÂU Á  GT1ST  GPT  100  GHUT1  5    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com AMINO ACID  100 BDG23  Gvx2512  99  GSG4  100 100  CHÂU MỸ GvxBL  100  52‐70  D78  JD1  HK46  100  100  OKYM  SH92  BDG  100  GT1ST CHÂU Á GPT  0,002  GHUT1  Hình 3: Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc chủng BDG23 (chủng thu thập Bình Dương), GPT (chủng thu thập Phúc Thọ) chủng châu Á, châu Mỹ (sử dụng chương trình MEGA4.0, 1000 bootstrap) (Lê Thị Kim Xuyến, Lê Thanh Hòa, 2008) Protein VP2 VP3 có điểm định kháng nguyên kích thich thể sinh kháng thể Ở gà mẹ, kháng thể truyền sang gà 3-4 tuần tuổi Virus Gumboro biết nguyên nhân gây suy giảm miễn dịch gà Các virus Gumboro không gây bệnh cho người động vật khác Virus Gumboro nuôi cấy phôi gà môi trường tế bào có nguồn gốc từ gà CEF (chicken embryo fibroblast), CEK (chicken embryo kidney), CEB (chicken embryo bursa) dòng tế bào động vật hữu nhủ (MA-104, Vero, BGM-70) 6    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khi nuôi cấy virus vào màng CAM phôi gà 10 ngày tuổi, phôi chết sau 3-5 ngày với bệnh tích phù vùng bụng, xung huyết da có xuất huyết lỗ chân lông Sưng lách hoại tử gan bệnh tích đặc trưng số biến chủng virus Gumboro Khi nuôi cấy môi trường tế bào, chu kỳ phát triển tế bào thai gà từ 10 đến 36 giờ, tế bào động vật hữu nhủ thời gian chậm (48 giờ) Biến đổi bệnh lý tế bào (CPE) xuất khoảng 48 đến 96 tùy thuộc vào chủng Gumboro Đặc trưng CPE virus Gumboro thảm tế bào trở nên lỏng lẻo, tế bào trở nên lỏng lẻo, tế bào co tròn, tách khỏi thành chai, treo lơ lửng môi trường 7    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.4 Sức đề kháng Có sức đề kháng lớn Có thể sống sót điều khiện chăn ni khí hậu khác Có thể sống bốn tháng điều kiện chăn ni bình thường Ở 56oC tồn giờ, -58oC 18 tháng mà độc lực không suy giảm Chỉ bị vô hoạt pH = 12 chịu pH = Trong chất thải, phân, nước tiểu,… IBDV giữ nguyên tính gây nhiễm gây bệnh vịng 52 ngày IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform IBDV tồn phenol 0,5% timerosal 1,125% 50oC giờ, formalin 0,5% giờ, chloramin 0,5% 10 phút Thuốc sát trùng chloramin T, formol (1-2%) phun lên chuồng diệt virus 1.5 Truyền nhiễm học 1.5.1 Loài mắc bệnh Các dòng gà mắc, thường dòng Leghorn Tuổi gà cảm thụ 2-15 tuần thường 3-6 tuần bị nặng Nhỏ tuần tuổi thường bị nhiễm thể ẩn đưa đến ức chế miễn dịch Gà tây, gà nhà, vịt, ngỗng, cút nhiễm không biểu bệnh 1.5.2 Đường xâm nhập lây lan Xâm nhập chủ yếu qua đường tiêu hóa, ngồi cịn qua đường hơ hấp Có thể lây trực tiếp từ qua khác lây qua thức ăn, nước uống tiếp xúc với mơi trường nhiễm bệnh Nhưng gà lướt qua bệnh đóng vai trị vật mang virus thầm lặng Khơng lây qua trứng Gà nở bị nhiễm virus dính ngồi vỏ trứng 8    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.5.3 Cơ chế làm suy giảm miễn dịch Virus chọn túi Fabricius làm quan đích (túi Fabricius quan miễn dịch cao tạo điều kiện cho lympho B thành thục mang kháng thể IgM trở thành tế bào tiết kháng thể tế bào nhận tín hiệu từ kháng nguyên Nhưng túi Fabricius nhận tín hiệu nang lympho túi nguyên vẹn Do virus phá hủy túi cách trầm trọng nên chức miễn dịch túi bị phần hay toàn Người ta gọi tượng chức miễn dịch tượng suy giảm miễn dịch Gà cảm nhiễm sớm với virus Gumboro dễ thụ cảm viêm phế quản truyền nhiễm, viêm khí quản truyền nhiễm, thương hàn,… 9    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.6 Các phương pháp sinh học phân tử phát virus Gumboro 1.6.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang Nguyên lý: Dùng chất đánh dấu (chất màu huỳnh quang) gắn vào kháng thể kháng nguyên để phát kháng nguyên kháng thể tương ứng chưa biết mức vi thể kính hiển vi huỳnh quang Gồm hai phương pháp trực tiếp gián tiếp 1.6.2 Phản ứng kết tủa khuếch tán thạch (Agar gel precipitation test, AGP) Nguyên lý: Sự kết hợp đặc hiệu kháng nguyên hòa tan kháng thể tương ứng xảy hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, phức hợp kháng nguyên-kháng thể đạt mức độ định có bảo hịa, lúc xảy tượng kết tủa Nếu thiếu thừa thành phần kết tủa khó xảy Sự kết tủa biểu chất cặn màu trắng xám trơng rõ Sự kết tủa địi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải 1.6.3 RT-PCR Nguyên tắc: Phát gel điện di gene IBDV sau khuyếch đại đoạn cDNA phiên mã ngược từ RNA virus 1.6.4 RFLP Nguyên lý: Dùng cDNA DNA genome mẫu dị để phát đoạn DNA có độ dài khác tạo sau cắt đọan DNA genome mẫu nghiên cứu phân tích điện di gel 11    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.6.5.Phương pháp trung hòa virus (Virus Neutralization-VN) Nguyên lý: Khi trộn virus với huyết miễn dịch tương ứng bị ứng chế khơng gây độc cho tế bào 1.6.6 ELISA Phát mầm bệnh hay kháng thể dựa phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Protein tái tổ hợp (recombinant protein) Protein tái tổ hợp protein tạo từ đoạn DNA tái tổ hợp Đối với Gumboro, protein tái tổ hợp thường VP2 tái tổ hợp Do protein coi kháng nguyên bảo vệ, đồng thời kháng nguyên đặc hiệu type chịu trách nhiệm cảm ứng tạo kháng thể trung hòa Trong chẩn đoán, VP2 tái tổ hợp sử dụng kháng nguyên cố định giá thể text kháng nguyên-kháng thể (như ELISA) dùng cho việc chẩn đốn bệnh hay nghiên cứu Trong phịng bệnh, VP2 tái tổ sử dụng kháng nguyên vaccine, để kích thích thể gà tạo kháng thể để phịng bệnh Ngày có nhiều nghiên cứu việc biểu gene mã hóa VP2, báo cáo tơi xin trình bày hai nghiên cứu: cloning biểu gene VP2 IBDV tế bào eukaryotic (nhóm nghiên cứu người Iran); biểu protein VP2 baculovirus, sử dụng chẩn đoán (Jackwood ctv) 12    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.1 Cloning biểu gene VP2 IBDV tế bào eukaryotic IBDV chủng virus gây thiệt hại nặng cho ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt dịng IBDV xuất vaccine sử dụng virus nhược độc dạng cũ khơng cịn hiệu Để khắc phục nhược điểm này, nhiều nghiên cứu thực để phát triển vaccine mạnh hơn, dựa công nghệ DNA tái tổ hợp Để làm điều đó, nghiên cứu nhóm tác giả người Iran sử dụng đoạn cDNA VP2 plasmid (pTZ57RVP2) E.coli chủng TOP10F để khuyếch đại đọan cDNA VP2 dùng cho cloning Vector nhận vector biểu pCDNA4 (vì vector thiết kế đặc biệt cho việc biểu protein tế bào nhân chuẩn, dài 5,3 Kb chứa promoter CMV, gene kháng ampicillin, gen kháng zeocin, upstream histidin để sàn lọc protein) Dịng tế bào nhận COS-7 (một nguyên bào sợi) Các enzyme cắt sử dụng EcoRI, Xbal ligated Quá trình nghiên cứu sau 2.1.1 Khuyếch đại đoạn gene chứa cDNA VP2 DNA plasmid pTZ57RVP2 chiết xuất từ E.coli Roche Plasmid Mini Kit Cặp mồi sử dụng: mồi xuôi (5'GCCGGAATTCATGACAAACCT GCAAGAT-3') mồi ngược (5'GCCGTCTAGAAACCTTATGGCCCGGAT-3') Các chu kỳ PCR thiết lập sau: ban đầu 100ºC phút để biến tính, 30 chu kỳ của trình khuyếch đại 95 º C phút, bắt cặp mồi DNA plasmid 58ºC phút kéo dài chuổi 72ºC phút Đoạn VP2 khuếch đại (1365bp) vector pCDNA4 cắt với EcoRI, XbaI ligated sau lọc từ 1% agarose gel 13    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.1.2 Biểu gene mã hóa VP2 Các đoạn gene VP2 sau khuyếch đại chuyển vào pCDNA4 chuyển tiếp vào COS-7 để biểu protein Dịng COS-7 chuyển gen ni cấy Dolbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), bổ sung 10% FBS, trì 37°C CO2 5% Để xác định biểu protein, tế bào trì mơi trường bổ sung thêm zeocin 24 để lựa chọn Sau lựa chọn với kháng sinh, tế bào lại ủ 24 để VP2 biểu tối đa Thu lấy tế bào tiến hành đóng băng-tan băng lần để phá vỡ tế bào Protein VP2 tái tổ hợp dung dịch sau phá vỡ tế bào phát phương pháp dot blotting, với huyết gà chống IBDV (độ pha loãng 1:50), huyết dê kháng huyết gà IgG (H + L), peroxidase liên hợp (độ pha loãng 1:30) 4cloro-1 Naphtol Hình 5: Kết dot blotting từ tế bào có chứa vector biểu mang gene VP2 từ tế bào vector biểu mang gene VP2 2.2 Biểu protein VP2 baculovirus, sử dụng chẩn đốn Thí nghiệm sử dụng vector p360v17 làm vector mang gene mã hóa VP2 để chuyển vào baculovirus Nghiên cứu thực ba chủng baculovirus: 9A5, 6A3 chủng hoang dại Kết cho thấy rằng: protein sinh từ ba chủng có kích thước 56,7 kDa (có khác biệt với 14    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com số nghiên cứu khác-như nghiên cứu Toh-Kyung Kim Sang-Geon Yeo cho thấy protein tái tổ hợp VP2 tạo từ Spodoptera frugiperda với vector biểu pFastBacHTa khoảng 48 kDa) Nghiên cứu tiến hành sử dụng VP2 tái tổ hợp nhằm phát kháng thể kháng IBDV Bằng cách cố định VP2 tái tổ hợp hạt resin, nghiên cứu cung cấp kit phát nhanh kháng thể trung hòa IBDV chẩn đốn Ngồi hai nghiên cứu cịn nhiều nghiên cứu khác biểu gene mã hóa protein VP2 IBDV eukaryotic lẫn prokaryotic Nhưng cịn hạn chế khả tìm kiếm thơng tin, nên chưa biết có vaccine protein tái tổ hợp sản xuất để phòng virus Gumboro hay chưa Đó hạn chế báo cáo        M          1        2         3        4        5        6        M       1          2         3         4         5         6 97 kDa‐  68 kDa‐  48 kDa 43 kDa‐  A  B  Hình 6: Phát protein VP2 (48 kDa) biểu DNA VP2 tái tổ hợp từ bacmid tế bào Spodoptera frugiperda SDS-PAGE (A) Western blotting với huyết gà kháng IBDV (B): protein từ tế bào không mang vector tái 15    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tổ hợp; 3, 4, protein từ tế bào mang vector tái tổ hợp (Toh-Kyung Kim Sang-Geon Yeo, 2003) A  B  Hình 7: Phát biểu protein từ gene VP2 nhờ vector bacmid tế bào Spodoptera frugiperda kiểm tra với kháng thể phát huỳnh quang: A tế bào không mang vector tái tổ hợp, B tế bào mang vector tái tổ hợp (Toh-Kyung Kim Sang-Geon Yeo, 2003) III KẾT LUẬN Với hậu nghiêm trọng mà virus Gumboro gây cho ngành chăn ni chế biến gia cầm, việc phịng chẩn đoán bệnh nhanh cần thiết Vì vấn đề nghiên cứu, sản xuất sử dụng protein tái tổ hợp VP2 cần phải đẩy mạnh 16    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vaccine chứa protein VP2 tái tổ hợp giúp khắc phục khuyết điểm dòng vaccine sống Hay protein tái hợp dùng để chẩn đoán bệnh giúp phát nhanh gia cầm bị bệnh nhầm có biện pháp cách ly kịp thời hướng đắn 17    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Website: www.Gumboro.com www.Expasy.org www.thuvienkhoahoc.com Nguyễn Bá Thành, Khảo sát bệnh Gumboro thử nghiệm bốn quy trình tiêm phịng gà thịt Arbor Acrec ni thị xả Thủ Dầu Một-tỉnh Bình Dương, luận án thạc sỹ thú y, trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, 1999 Đặng Mai Tuyết Trang, Khảo sát miễn dịch thu chống Gumboro Newcastle gà ISA-Brown 1-6 tuần tuổi, luận văn tốt nghiệp khoa chăn nuôi thú y, trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, 1996 Lê Thị Kim Xuyến Lê Thanh Hòa, Phát chủng cường độc Gumboro nguồn gốc Âu-Mỹ Việt Nam phương pháp sinh học phân tử phân tích gene VP2, tạp chí Khoa học Phát triển tập VI số 5, 2008 Toh-Kyung Kim and Sang-Geon Yeo, Expression of VP2 gene protein of IBDV detected in Korea, Gyeongsang National University, South Korea, 2003 Roozbeh Hushiarian and et al, Cloning and expression of VP2 gene of IBDV in eukaryotic cells, Iranian journal of biotechnology Vol No 4, 2007 Jackwood and et al, IBDV VP2 fusion protein expressed by baculovirus,use as diagnostic, 1995 18    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC I Đặt vấn đề II Tồng quan Vi rus Gumboro 1.1 Lịch sử 1.2 Đặc điểm cấu trúc 1.3 Đặc điểm kháng nguyên miễn dịch 1.4 Truyền nhiễm học 1.5 Sức đề kháng 1.6 Các phương pháp sinh học phân tử phát virus Gumboro 12 Pr otein tái tổ hợp 13 2.1 Cloning biểu gene VP2 IBDV tế bào eukaryotic 13 2.2 Biểu protein VP2 baculovirus, sử dụng chẩn đoán 15 III Kết luận 17 Tài liệu tham khảo 18 19    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... nguyên kháng thể Protein tái tổ hợp (recombinant protein) Protein tái tổ hợp protein tạo từ đoạn DNA tái tổ hợp Đối với Gumboro, protein tái tổ hợp thường VP2 tái tổ hợp Do protein coi kháng... protein tái tổ hợp VP2 cần phải đẩy mạnh 16    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vaccine chứa protein VP2 tái tổ hợp giúp khắc phục khuyết điểm dòng vaccine sống Hay protein. .. quang: A tế bào không mang vector tái tổ hợp, B tế bào mang vector tái tổ hợp (Toh-Kyung Kim Sang-Geon Yeo, 2003) III KẾT LUẬN Với hậu nghiêm trọng mà virus Gumboro gây cho ngành chăn nuôi chế