VIRUS PRRS và PROTEIN tái tổ hợp n ỨNG DỤNG TRONG CHẨN đoán g

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** VIRUS PRRS VÀ PROTEIN TÁI TỔ HỢP N ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Giáo viên hướng dẫn: Bộ mơn : CƠNG NGHỆ SINH HỌC PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LI NA MSSV: 06126081 Thành Phố Hồ Chí Minh 31/10/2009 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I Đặt vấn đề Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (Porcine Reproductive and Respiratoty Syndrom ) bệnh virus Nidovirales, họ Arteviridae gây Được phát Mỹ vào năm 1987 xuất rộng rãi Châu Âu nước Châu Ávà có nguy lây lan thành dịch.Đây bệnh gây thiệt hại lớn kinh tế, xếp vào nhóm B danh mục bệnh Tổ chức sức khỏe động vật giới.PRRS đặc trưng rối loạn hô hấp, xẩy thai heo nái gây tỉ lệ tử vong cao heo con, dẫn đến thiệt hại lớn kinh tế tồn cầu Trong vịng 20 năm kể từ xuất hiện, PRRS gây nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng lên chăn nuôi giới an sinh xã hội Theo báo cáo, PRRS chiếm 1/3 chi phí cho bệnh xâm nhiễm nghành công nghiệp chăn nuôi heo Mỹ, PRRS gây thiệt hại kinh tế đáng kể Châu Âu Gần biến chủng PRRS virus Trung Quốc giết 400.000 2.120.000 số heo bị xâm nhiễm vịng tháng 10 tỉnh phía đông TRung Quốc Tại Việt Nam, từ tháng đến tháng năm 2007, 44 ổ dịch bùng phát hai dịch bệnh chính, lần đầu xảy tỉnh phía bắc thời gian từ tháng đến tháng năm, lần thứ hai xảy tỉnh phía nam khoảng thời gian từ tháng đến tháng Khoảng 44000 heo bị nhiễm, 4000 bị chết Chính virus PPRS bệnh virus gây nên quan tâm nghiên cứu nhằm tìm hiểu nắm bắt chế phát sinh gây bệnh virus để phát triển phương pháp phòng chống quản lý bệnh, phát triển phương pháp chẩn đoán, phát chế tạo, sản xuất vaccine Trong báo cáo em xin trình bày kiến thức, hiểu biết virus PRRS protein tái tổ hợp Virus này, với quy trình sản xuất số protein tái tổ hợp để ứng dụng chẩn đoán chế tạo vaccine LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.Tổng quan A Tổng quan virus PRRS Lịch sử phát bệnh Được phát lần vào năm 1987 Mỹ số nghiên cứu dịch tễ học cho bệnh lưu hành trước Canada Bệnh xuất Châu âu vào năm 1990 lưu hành nhiều nước thuộc châu lục Các kiểm tra huyết học virus học cho thấy PRRS có mặt Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, nước vùng Ca-ri-bê Trong ngày gần đây, bệnh xuất Trung Quốc xuất nhiều địa phương nước ta gây thiệt hại kinh tế lớn nghành chăn nuôi heo giới Virus PRRS 2.1 Hình thái, cấu tạo phân tử virion PRRSV: Virus Nidovirales hay gọi virus PRRS (porcine reproductive and Respiratory Syndrome virus) thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus, virus ARN sợi đơn,dương có vỏ envelope bao bọc Phân tử virion PRRS có dạng hình cầu trứng với đường kính trung bình 58nm, có số phân tử có đường kính lớn 70nm, phân tử virus có bề mặt ngồi trơn với vài điểm lồi ra, cách biệt với vỏ bọc khoảng 2-3nm bên phân tử virion vịng trống với đường kính trung bình khoảng 39nm Phân tử virion PRRS bao gồm vỏ bọc lipid có chứa vài envelope protein, protein GP2, GP5, E M bao quanh vòng nucleocapsid PRRSV Protein LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com N bao bọc RNA genome virus Protein vỏ chiếm nhiểu protein nhân Protein N, protein màng GP5 M, GP2, GP4, E GP3 thành phần phụ 2.2 Cấu trúc genome PRRSV Tồn trình tự gene PRRSV giải mã thành công ghi nhận vào năm 1993, genome virus dài khoảng 15kb gồm tám khung đọc mở ORF ORF 1a 1b nằm đầu 5’ genome, chiếm hai phần ba gene mã hóa cho RNA polymerase virus xem protein chịu trách nhiệm trình nhân lên virus Sáu ORF nhỏ ORF 2-7, nằm phía sau ORF 1b, đầu 3’ genome, mã hóa cho protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion Sản phẩm ORF 5,6,7 bao gồm protein virus Cho đến người ta xác định protein cấu trúc PRRS là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa quy định ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa quy định ORF6 protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng lượng khoảng 24-25 kDa quy định ORF5 Những nghiên cứu gần cho thấy ORF 2,3 Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu PRRS virus có lẽ mã hóa cho LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com membrane-associated glycoprotein khác là: 29-30 kD GP2, , 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4(Van Nieuwstadt cộng sự, 1996) 2.3 Sự đa dạng chủng virus PRRS lưu hành giới PRRS lưu hành giới với dòng khác nhau: dòng Châu Mỹ (tiêu biểu chủng VR-2332) dòng Châu Âu (tiêu biểu Lelystad-LV) Những chủng virus hai dòng Châu Mỹ Châu Âu khác đặc tính gây bệnh chúng có khác đặc điểm gene yếu tố kháng nguyên Các chủng dòng có tương đồng cấu trúc kháng ngun Tùy theo ORF mà tương đồng gene hai dòng virus PRRS Châu Âu Châu Mỹ dao động từ 52 đến 81% Việc giải mã trình tự nucleotide ORF sở liệu phân tử quan trọng cho phép xác định sử dụng trình tự việc so sánh, chẩn đốn phân biệt dòng PRRSV xác định tiến hóa chúng Ví dụ qua phân tích gene theo dõi thay đổi trình tự nucleotide dòng PRRSV người ta xác định PRRSV dịng Châu Mỹ, ORF có tính ổn định cao, chúng gần khơng thay đổi suốt q trình tiến hóa dịng virus Tuy nhiên khác biệt dòng virus PRRS Châu Âu Châu Mỹ hai khung đọc mở rõ, chẳng hạn tương đồng trình tự acid amin ORF7 hai dịng virus vào khoảng 57-59% ORF6 7081% Trong khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều chủng dòng Châu Mỹ (giống từ 88-97%) tương đồng với dòng Châu Âu khoảng từ 51-59% Các epitope trung hòa nằm protein quy định ORF5, có biến động lớn vùng ORF5 chủng virus PRRS epitope trung hịa thường có bảo tồn tốt dòng PRRS khác Các epitope trung hòa khác nằm GP3, GP4 protein M Sự tương đồng trình tự acid amin quy định khung đọc mở ORF 2, 3, dòng Châu Âu Châu Mỹ mức độ từ 63, 58, 68% Sự khác biệt kiểu gene đương nhiên đưa đến khác biệt kiểu hình dựa vào đặc điêm gene để chẩn đốn dịng virus ngược lại Đây sở cho việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR, RFLP… để chẩn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đoán PRRSV phân biệt dịng PRRSV Châu Âu Châu Mỹ.(Nguyễn Ngọc Hải-cơng nghệ sinh học thú y, nhà xuất Nông Nghiệp, 2007) Gần Trung Quốc xuất dòng biến chủng dòng Châu Mỹ, chủng có độc lực cao hơn, nguyên nhân đưa 30acid amin protein Nsp2, gây bệnh khơng cho heo mà cịn cho heo trưởng thành, gây tỉ lệ chết cao (khoảng 20%), biến chủng khó chẩn đốn chưa có vaccine đặc hiệu, thách thức cho nhà quản lý dịch bệnh cho nhà sản xuất vaccine Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo PRRSV gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Trước PRRSV chủ yếu gây bệnh heo gây tỉ lệ tử vong thấp (Ở Châu Âu khoảng 1%) gần biến chủng Trung Quốc gây bệnh heo heo trưởng thành , ngồi gây tỉ lệ tử vong cao đàn heo bị nhiễm virus (khoảng 20%) Cũng virus khác, virus PRRS tạo điều kiện cho vi khuẩn khác cư trú thể liên cầu khuẩn tăng độc lực gây bệnh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.1 Triệu chứng lâm sàng Căn vào biểu triệu chứng bệnh, người ta chia thành hai loại triệu chứng: biểu triệu chứng rối loạn sinh sản heo nái biểu triệu chứng hô hấp Các triệu chứng sinh sản bao gồm: heo nái bị sốt 39-40°, bỏ ăn,mệt mỏi, giảm tỉ lệ thụ thai số đẻ ra, sảy thai (tỷ lệ đến 50% đàn bị nhiễm virus), giảm tiết sữa sữa hoàn toàn, thai gỗ, chết thai, đẻ non, chậm động dục không động dục trở lại, rối loạn sinh sản kéo dài đến vài tháng Biểu triệu chứng hô hấp bao gồm: loạn hô hấp, lợn biểu đau thở, hắt hơi, tăng tần số hơ hấp, thở khó, thở đứt qng Khi bị nhiễm virus PRRS heo có tỉ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn phù mắt,các nốt phồng rộp da, ỉa chảy, không vững run, đứng chỗi chân Heo lớn có biểu sốt nhẹ, bỏ ăn Các triệu chứng khác nhẹ Heo đực giống có biểu giảm hưng phấn, giảm thể tích chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực nồng độ tinh trùng) 3.2 Bệnh tích Đối với heo nái, triệu chứng sảy thai, tăng tỉ lệ thai chết, heo mắc bệnh thường khơng có bệnh tích đặc thù Đối với heo thường mang bệnh tích rõ heo trưởng thành heo nái, bao gồm: dịch thẩm thấu đường tiêu hóa đường hô hấp đặc biệt phế quản, phù, dịch xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc tung mạc, sưng hạch bạch huyết, da nhiều vùng có màu xanh tím 3.3 Phương thức truyền lây Virus thường xâm nhiễm heo thông qua đường hô hấp xâm nhập vào tế bào đại thực bào phế nang phổi nhân lên đó, chúng kích thích tạo đáp ứng interferon trước phát tán bên vật chủ Virus PRRS thích hợp với loại tế bào chuyên biệt với đại thực bào biệt hóa đại thực bào túi phổi heo (PAM) Tuy nhiên, chế xác tế bào đích LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thông tin thụ thể chuyên biệt cho virus PRRS chưa hiểu tường tận Một số thụ thể tế bào tiếp nhận PRRS báo cáo, bao gồm thụ thể CD163 có nhiểu đại thực bào PAM Trong suốt trình xâm nhiễm, PRRS tạo hội chứng bệnh rối loạn sinh sản hơ hấp Virus truyền qua tinh dịch đường từ mẹ sang gây tử vong với tỉ lệ cao PRRSV tồn thể heo, heo bị xâm nhiễm phục hồi khỏi bệnh chứa virus thời gian dài lây bệnh cho heo chưa bị nhiễm khác qua tiếp xúc trực tiếp gián tiếp Tiếp xúc heo ốm heo khỏe đường truyền lây bệnh nên bệnh lây cá thể đàn hay từ đàn sang đàn khác (nếu heo bị bệnh chuyển đàn, chuyển trại ) Heo mang virus giải phóng virus thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho cơng tác theo dõi phát khống chế bệnh Tinh dịch lợn mang trùng có khả nhiễm virus bệnh truyền qua đường sinh dục Vi rút PRRS có dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân nước tiểu lợn bị bệnh, vi rút phát tán theo gió, khơng khí (xa 3km), nước, dụng cụ bảo hộ lao động, dụng cụ chăn nuôi chim hoang truyền dẫn Virus có mặt hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn nhiều thịt có khả độc lực điều kiện lạnh (khi thức ăn) Tuy vậy, khả truyền bệnh cho ăn phụ phẩm trình giết mổ gia súc bênh chưa xác định Tuy nhiên, tốt hết nên cách ly tồn đàn lợn có nguy với loại nguồn bệnh không cho ăn nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh B Tổng quan protein tái tổ hợp dựa ORF7 ứng dụng chẩn đốn Giới thiệu Trong protein cấu trúc PRRSV người ta nhận thấy N protein quy định ORF diện với số lượng lớn phân tử LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com virion PRRS huyết heo bị xâm nhiễm PRRS phản ứng mạnh với N protein, hầu hết kháng thể đơn dòng thu từ chuột bị cho nhiễm PRRS bán tinh nhận biết đặc hiệu với N-protein Ngoài qua nghiên cứu ORF mã hóa cho Protien N có cấu trúc ổn định bảo tồn cao Chính nên N protein xem ứng viên sáng giá việc phát chẩn đoán heo bị nhiễm PRRS Hiện người ta phát triển kit thương mại chẩn đoán PRRS dựa ORF7 ELISA phương pháp thông dụng tin cậy phát chẩn đoán PRRS nay, người ta thường dùng ELISA để phát kháng thể PRRS kháng protein N sản phẩm ORF7 cần lượng lớn kháng nguyên protein N dùng kit chẩn đoán Nhưng có hạn chế PRRSV thường khó ni mơi trường tế bào Chúng phát triển tốt môi trường đại thực bào túi phổi heo (PAM) số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi, nhiên, người ta chưa thành cơng việc tuyển lựa dịng tế bào ni cấy nhân tạo Các dịng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất chủng virus PRRS Chính phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho PRRSV hướng mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein tái tổ hợp N mã hóa ORF7 mang tính ứng dụng cao thử nghiệm dùng làm vật liệu kit chẩn đoán ELISA Sản xuất protein N tái tổ hợp mở khả tạo số lượng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu chẩn đoán dịch bệnh bùng phát Sản xuất protein tái tổ hợp góp phần khắc phục nhược điểm khó ni cấy PRRSV môi trường tế bào nêu Cấu trúc phân tử Protein N Protein N gồm năm vùng cấu trúc có cấu hình xoắn α-helix Vùng I: nằm vị trí vùng amino-terminal amino acid thứ 18 52 Bao gồm vùng quan trọng định yếu tố kháng nguyên nằm amino acid thứ 30 52 Vùng nhận diện đặc hiệu kháng thể đơn dòng SDOW17 SDOW17 kháng thể đơn dòng để phát hiện, nhận diện epitope chung cho hầu hết chủng virus PRRS Châu Âu Bắc Mỹ, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com epitope nằm vị trí bên vùng bảo tồn N protein, cấu hình vùng dạng cấu hình xoắn helical, kị nước Vùng II: từ amino acid 37 đến 52, bao gồm epitope tuyến tính Vùng III, từ amino acid 52 đến 69, nằm vùng bảo tồn cao N protein Nhóm amino acid thành phần immunodominant epitope, 70% kháng thể đơn dịng nhận diện cấu hình protein diện N-52 không nhận diện đột biến loại N-69 Các amino acid từ 40 đến 66 nằm vùng ưa nước N-protein, nằm vùng dễ phát bề mặt capsid Vùng IV, trải dài từ amino acid thứ 69 tới 112, phát gắn kết đặc hiệu kháng thể đơn dòng SR30 Vùng V từ amino acid 112 đến amino acid đóng vai trị quan trọng việc trì cấu hình chung protein Sản xuất protein N tái tổ hợp 3.1 giới thiệu Trong phần trình bày người ta sản xuất protein N tái tổ hợp cách chèn gene ORF7 mã hóa cho protein nucleocapsid N Lelystad virus (LV) vào sau promoter P10 baculor virus Autographa califonia nuclear polyhedrosis Kết tạo baculovirus tái tổ hợp bac-ORF7, biểu protein 15kDa tế bào côn trùng Protein có kích thước tương tự với kích thước protein N biểu LV tế bào CL2621và giữ 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cấu trúc kháng nguyên Protein N tự nhiên Protein tái tổ hợp đem chủng cho heo kháng thể chống lại protein N tái tổ hợp sản xuất tăng lên thể heo Tuy nhiên chủng protein N tái tổ hợp không giúp bảo vệ heo khỏi xâm nhập PRRSV Qua kiểm tra hai dòng virus PRRS Châu Âu Châu Mỹ phản ứng với protein N biểu bac-ORF7, protein N tái tổ hợp sử dụng việc phát kháng thể huyết kháng lại chủng khác PRRSV Nhưng protein tái tổ hợp khơng có khả ứng dụng sản xuất vaccine chống virus PRRS 3.2 Quy trình sản xuất sau: Chuẩn bị tế bào virus: virus Autographa California nuclear polyhidrosis (AcNPV) virus tái tổ hợp ni cấy dịng tế bào Spodoptera frugiperda Sf21 LV ATCC VR2332 phát triển tế bào đại thực bào túi phổi heo(PAM) tế bào CL2621 Thiết lập plasmid: tổng hợp hai đoạn oligonucleotide chuyên biệt nằm trước sau ORF7 LV40 (59-GATTGGATCCTCGTCAAGTATGGCCGG-39) LV41 (59-CTAAGGATCCTGTCAAATTAACTTGCA-39), sử dụng làm primer phản ứng PCR để khuyếch đại ORF7 từ cDNA clone Các nu gạch chân khơng thuộc trình tự LV thêm vào để tạo vị trí BamHI mồi Vị trí cắt giới hạn BamHI thêm vào mồi để tạo dòng ORF7 sau promoter p10 baculovirus chuyển vector pACAS3 Chuyển chọn lọc protein tái tổ hợp N biểu tế bào Sf21: Chủng AcNPV DNA hoang dại pACAS3 đồng chuyển vào tế bào Sf21 Virus tái tổ hợp biểu ß-galactosidase chọn lọc ba lần kiểm tra biểu N protein DNA tế bào virus ly trích từ tế bào Sf21 chuyển gene DNA virus cắt BamHI XhoI để khẳng định gene ORF7 chèn vào locus p10 baculovirus 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đánh dấu phóng xạ phân tích protein: Sau cho xâm nhiễm Chủng AcNPV DNA hoang dại pACAS3 vào tế bào Sf21 40 đánh dấu phóng xạ với L-[35S]methionine CL2621 xâm nhiễm virus LV đánh dấu tế bào bị ly giải sau đem phân tích miễn dịch kết tủa (immunoprecipitation) Miễn dịch kết tủa điện di: kiểm tra protein tái tổ hợp phương pháp miễn dịch kết tủa điện di, protein tái tổ hợp đánh dấu phóng xạ miễn dịch kết tủa với huyết kháng LV; peptide đặc hiệu N, huyết mẫu, kháng thể đơn dòng SDOW17 WBE6 Phức hợp miễn dịch gắn với hạt protein A-Sepharose CL-4B Các hạt protein A-Sepharose hòa dung dịch buffer Laemmli, hỗn hợp đun nóng hai phút nhiệt độ 100°C trước phân tích điện di phương pháp sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE) gel polyacrylamide 12,5 % Gel ngâm Amplify 30 phút để nhuộm huỳnh quang sau làm khơ protein miễn dịch kết tủa quan sát phóng xạ tự ghi Quy trình dùng để kết tủa miễn dịch protein từ dung dịch ly giải tế bào CL2621 bị xâm nhiễm LV Đo sản lượng Protein N tái tổ hợp theo thời gian phương pháp ELISA: tế bào Sf21 xâm nhiễm với baculovirus tái tổ hợp bac-ORF7 với liều hữu hiệu TCID50s Tại 24, 48, 72 96 sau xâm nhiễm, tế bào thu hoạch, rửa với phosphate-buffered saline (PBS), ly giải đá dung dịch ly giải (30mM Tris-HCl [pH7,5], 10mM MgCl2 1% Nonidet-P40; 40×106 tế bào/ml) Dung dịch ly giải ly tâm 1400 vòng/phút để loại mảnh vỡ tế bào Dung dịch sau ly tâm bac-ORF7 bảo quản -70°C.Đĩa phản ứng ELISA phủ với dung dịch ly giải tế bào bac-ORF7 ủ qua đêm với tỉ lệ 1:125 dung dịch coating buffer (50mM NaHCO3 [pH 9,65] Đĩa rửa PBS chứa 0,05 % tween 80 ủ 37°C với độ pha loãng 1:500 ascetic fluid kháng thể đơn dòng WBE6 đặc hiệu cho protein N ELISA buffer ( PBS, 0,05% Tween 80, 4% huyết ngựa) Đĩa phản ứng rửa ủ 37°C với kháng thể horseradish peroxidase (HRPO)12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com conjugated thỏ gắn trực tiếp với Immunoglobin chuột độ pha lỗng 1:1000 ELISA buffer Sau đĩa phản ứng rửa nhuộm Blocking ELISA để phát kháng thể đặc hiệu cho protein N: dung dịch ly giải tế bào SF21 thu nhận sau cho xâm nhiễm vớ baculorvirus tái tổ hợp hai ngày sử dụng cho phản ứng ELISA mô tả Các giếng phản ứng rửa ủ với 100ml huyết thử độ pha loãng 1:4 ELISA buffer Mỗi mẫu huyết kiểm tra lần lặp lại Đối với đối chứng, sử dụng độ pha loãng (1:4 tới 1:2,048) huyết kháng LV ba huyết có phản ứng âm tính kiểm tra mối đĩa Sau ủ 37°C với MAbs HRPO-conjugated chuột Đĩa phản ứng rửa nhuộm mô tả Khi kháng thể kết gắn SDOW17 protein tái tổ hợp N bị khóa immunoglobin heo, kháng thể đơn dịng RM19ME chuột khơng thể kết gắn chứng tỏ huyết đem kiểm tra dương tính với LV Blocking tính tốn dựa theo công thức %blocking=100-OD huyết kiểm tra/ OD huyết âm tính heo)×100 Chủng heo với bac-ORF7 thử nghiệm với LV: heo hai tuần tuổi không bị mầm bệnh xâm nhiễm chủng với 2ml bac-ORF7 (tương đương 20mg protein N) ngày ngày 28 Hai heo đối chứng chủng tương tự với 2ml baculovirus kiểu hoang dại Ở ngày 42 bốn heo cho nhiễm với 1ml 105 TCID50 LV Mẫu huyết lấy ngày 0, 21, 28,42,45, 52, 58, 63 Tế bào đại thực bào bị xâm nhiễm với LV khẳng định tất mẫu huyết IPMA Blocking ELISA cho protein N thực với huyết thu thập sau chủng heo Tất heo thí nghiệm quan sát hàng ngày triệu chứng bệnh sốt rối loạn hô hấp Heo bị chết ngày 63 sau chủng mô phổi phân tích bệnh tích Kháng nguyên virus quan sát phương pháp immunoperoxidase staining với MAbs SDOW17 kháng thể chuột HRPOconjugated gắn trực tiếp với immunoglobin miêu tả 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III Kết luận PRRS virus virus quan tâm nghiên cứu nhà khoa học giới virus gây thiệt hại lớn nghành chăn nuôi heo giới mặt khác đa dạng di truyền virus với biến đổi lien tục chúng dẫn đến khó khăn chẩn đốn tạo loại vaccine đặc hiệu có hiệu cơng tác phòng chống dịch bệnh xảy Do đặc điểm khó ni cấy mơi trường tế bào nên có khó khăn định việc sản xuất kháng nguyên dùng làm vật liệu cho kit chẩn đốn virus ni cấy virus để tạo ngun liệu sản xuất vaccine nhược độc cho virus Chính protein tái tổ hợp hướng tiềm việc sản xuất kháng nguyên ứng dụng sản xuất kit chẩn đốn quy mơ lớn khắc phục nhược điểm nêu trên, protein tái tổ hợp mở tiềm cho sản xuất vaccine bảo vệ heo khỏi PRRSV Trong báo cáo em trình bày kiến thức hiểu biết chung virus PRRS hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo virus gây Đồng thời nêu nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp dựa ORF7 virus vùng có tính bảo tồn cao, có ứng dụng rõ ràng cơng tác chẩn đốn phân biệt dịng virus PRRS Hiện cịn có hướng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa ORF5 virus PRRS sản xuất vaccine protein GP5 quy định ORF có chứa epitope trung hịa quan trọng PRRSV, hạn chế báo cáo em chưa đưa nghiên cứu 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com IV Tài liệu tham khảo Nguyễn Ngọc Hải, Công nghệ sinh học thú y, nhà xuất Nông Nghiệp, 2007 Sarah k Wooton, Eric A.Nelson, and Dongwan Yoo, Department of Pathobiology, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario N1G 2W1, Canada,and Department of Veterinary Science, South Dakota State University, Brookings, South Dakota Antigenic structure of the Nucleocapsid Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus J.J.M Meulenberg, R.J.Bende, J.M.A.Pol, G.Wensvoort, and R.J.M Moormann, Department of Virology, Institute for Animal Science and Health (ID-DLO), Lelystad, The Netherlands Nucleocapsid Protein N of Lelystad Virus: Expression by Recombinant Baculorvirus, Immunological Properties, and Suitability for Detection of Serum Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken Inui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam Nguyen, Di Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong Tian, and George F Gao Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Viet Nam and China, 2007 Kyoung-Jin Yoon, assistant professor; Chih-Cheng Chang, Graduate assistant; Jeffrey Zimmerman, associated professor; and Karent Harmon, associated scientist, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine Field and Experimental Assessment of PRRSV Evolution Dee S, Deen J, Rossow K, Weise C, Eliason R, Otake S, Joo HS, Pijoan C Can J Vet Res 2003.Mechanical transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus throughout a coordinated sequence of events during warm weather T Dokland, A Deshpande, Y Fang, E Nelson, Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham; Department of Veterinary Science, South Dakota State University AM Burrell, W Xu, Q Hoang, RC Willis, R 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Shah, M Bounpheng, X Fang Applied Biosystems, Austin, Texas, Cryoelectron microscopy of PRRSV virions 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... tạng từ l? ?n nghi mắc bệnh B Tổng quan protein tái tổ hợp dựa ORF7 ứng dụng ch? ?n đo? ?n Giới thiệu Trong protein cấu trúc PRRSV người ta nh? ?n thấy N protein quy định ORF di? ?n với số lượng l? ?n ph? ?n. .. trúc kháng nguy? ?n Protein N tự nhi? ?n Protein tái tổ hợp đem chủng cho heo kháng thể chống lại protein N tái tổ hợp s? ?n xuất tăng l? ?n thể heo Tuy nhi? ?n chủng protein N tái tổ hợp không giúp bảo... heo virus g? ?y Đồng thời n? ?u nghi? ?n cứu s? ?n xuất protein tái tổ hợp dựa ORF7 virus vùng có tính bảo t? ?n cao, có ứng dụng rõ ràng cơng tác ch? ?n đ? ?n ph? ?n biệt dịng virus PRRS Hi? ?n c? ?n có hướng nghiên