KIỂM TRA độ NHẠY và độ đặc HIỆU của PHƯƠNG PHÁP PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA gây BỆNH TIÊU CHẢY

CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: MSSV: Nguyễn Ngọc Hải Trịnh Xuân Thảo 06126142 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu salmonella phương pháp chuẩn doán: a.Đặc diểm hình thái salmonella: b Phân loại salmonella c Các phương pháp chuẩn đoán salmonella Mục tiêu nghiên cứu : Xác định độ nhạy PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân Xác định độ đặc hiệu PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân Ưu điểm PCR đa mồi: III ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Vật liệu 2.1 Vật liệu dùng cho nuôi cấy xác định vi khuẩn 2.2 Sinh phẩm, hố chất, dụng cụ máy móc dùng PCR Phương pháp nghiên cứu 3.1 Độ nhạy PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân a.Qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân b Xác định độ nhạy hệ thống PCR đa mồi 3.2 Độ đặc hiệu PCR đa mồi 3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm PCR Xử lý số liệu IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xác định độ nhạy PCR đa mồi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Xác định độ đặc hiệu PCR đa mồi V BÀN LUẬN Độ nhạy PCR đa mồi Xác định độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi VI KẾT LUẬN - Độ nhạy Độ đặc hiệu VII Tài liệu tham khảo - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY I ĐẶT VẤN ĐỀ - Tiêu chảy vấn đề quan trọng sức khỏe toàn cầu, đặc biệt trẻ em toàn giới Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai tỷ lệ tử vong trẻ em tuổi mắc bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp), nước phát triển, có tỷ trường hợp tiêu chảy hàng năm số tử vong đến triệu Trung bình năm trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy Tại Việt nam, số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy năm trẻ từ 2,2 - lần Tại nước công nghiệp phát triển, tiêu chảy phổ biến trẻ em người già Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy, vi khuẩn đóng vai trị quan trọng.Tiêu chảy cịn nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng đến tăng trưởng phát triển trẻ Salmonella vi khuẩn có phạm vi lây lan rộng, sống ruột chim, lồi bị sát động vật có vú Nó lây sang người qua nhiều loại thức ăn từ động vật Những bệnh chúng gây (salmonellosis) tiêu biểu gồm sốt, tiêu chảy đau bụng Ở người có sức khỏe hay hệ miễn dịch suy yếu, xâm nhập vào máu gây bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm Salmonella nguyên gây tiêu chảy đề cập nhiều nghiên cứu Salmonella gây bệnh cho người, động vật cho người động vật Một số loài Salmonella LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ hay gây bệnh thường gặp S typhi, gây bệnh cho người, nguyên gây bệnh thương hàn quan trọng S paratyphi A, gây bệnh cho người, nguyên gây bệnh thương hàn, tỷ lệ nước ta đứng sau S typhi S paratyphi B, chủ yếu gây bệnh người Tại nước châu Âu, tỷ lệ vi khuẩn cao Việt Nam S paratyphi C, vừa có khả gây bệnh thương hàn vừa có khả gây viêm dày-ruột nhiễm khuẩn huyết Thường gặp nước Đông Nam Châu Á S typhimurium S.enteritidis vừa có khả gây bệnh cho người vừa có khả gây bệnh cho động vật Chúng nguyên nhân chủ yếu bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn Salmonella S choleraesuis nguyên thường gặp nhiễm khuẩn huyết Salmonella nước ta II Tổng quan tài liệu: Giới thiệu salmonella phương pháp chuẩn đoán: a.Đặc diểm hình thái salmonella: Salmonella trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 µm, có nhiều lơng xung quanh thân, trừ S.gallinarum S.pullorum (gây bệnh gà vịt) Salmonella phân lập từ đại thực bào nhiễm độc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Salmonella quan sát kính hiển vi Salmonella vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện, phát triển mơi trường ni cấy thơng thường, mọc số mơi trường có chất ức chế chọn lọc dùng phân lập vi khuẩn từ phân - Trên môi trường lỏng: sau 5-6h nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18h môi trường đục - Trên mơi trường thạch thường: khuẩn lạc trịn, lồi, bóng, khơng màu màu trắng xám Salmonella phát triển thạch máu - Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng Salmonella khơng lên men lactose, lên men đường Glucose thường sinh Sử dụng citrat môi trường Simomons Catalase (+), oxidase (-) Lysindecarboxylase (+), onPG (-), urease (-), RM (+), VP (-), H2S (-), indol () Tuy nhiên lồi có đầy đủ tính chất Những ngoại lệ xác định cần phải biết là: S.typhi lên men đường glucose không sinh citrat Simmon (-) Trong lồi S.paratyphi A có LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ số chủng sinh H2S loài kết thử citrat Simmon (-), lysindecarboxylase (-) S.arizona lên men lactose (tuy có chậm) onPG (-) Salmonella thạch McConkey Salmonella sp sau 24h thạch XLD B Phân loại: salmonella phân loại theo cách sau: • Về phân loại khoa học Salmonella xếp vào: - Giới : Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Salmonella lignieres 1900 - Loài: S bongori & S enterica • Về phân loại theo cấu trúc kháng nguyên: Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella chia thành nhóm, lồi typ huyết Lúc đầu, Salmonella đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây S typhi S paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn), theo vật chủ S typhimurium gây bệnh chuột (murine =chuột) Về sau, người ta thấy loài Salmonella gây số hội chứng phân lập nhiều lồi động vật LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ khác Vì lý đó, cuối người ta gọi loài phát theo tên địa phương phân lập S teheran, S congo, S.london Đến nay, người ta phát 1500 typ huyết Salmonella Bảng: kiểu kháng nguyên số vi khuẩn salmonella Vi khuẩn Nhóm kháng Kháng nguyên O nguyên Kháng nguyên H Phase Phase S.paratyphy A 1, 2, 12 a (1, 5) S typhimurium B 1, 4, 12 I 1, S typhi D 9, 12, (Vi) c 1, S.enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7) S gallinarum D 1, 9, 12 - - c Các phương pháp chuẩn đóan salmonella: Salmonella chuẩn đốn theo phương pháp sau: • Phương pháp phân lập • Phương pháp miễn dịch • Huyết học • ELISA • Miễn dịch huỳnh quang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ • Phương pháp phân tử • PCR • Realtime PCR • Multiplex PCR Phương pháp kinh điển xác định Salmonella trường hợp chúng gây bệnh tiêu chảy (đặc biệt thương hàn) cấy máu và/hoặc cấy phân Phương pháp định danh kinh điển sử dụng tính chất sinh vật hóa học ngưng kết với kháng huyết đặc hiệu Đã có số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử lai DNA, phản ứng khuyếch đại gen Polymerase Chain Reaction (PCR) - PCR kỹ thuật tổng hợp acid nucleic ống nghiệm Trong đó, đoạn ADN nhân lên đặc hiệu Trong kỹ thuật này, hai đoạn oligonucleotid gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích khuếch đại theo số chu kỳ lặp lặp lại Chu kỳ gồm việc làm tách hai sợi đoạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi theo nguyên tắc bổ sung kéo dài đoạn oligonucleotid tác động enzym ADN polymerase Các oligonucleotid gọi "mồi" (primer) gắn vào hai sợi đoạn ADN định hướng Do vậy, đoạn ADN tổng hợp hai mồi Trong PCR, ADN đích tăng lên theo hàm số mũ sau chu kỳ Sản phẩm PCR phát sau điện di agarose, nhuộm ethidium bromide đọc ánh sáng đèn cực tím LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ - Tuy nhiên nay, việc xác định trực tiếp Salmonella từ phân PCR chưa nghiên cứu nhiều - Trên lâm sàng, việc xác định nhanh Salmonella kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao, có ý nghĩa quan trọng chẩn đốn lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân Mục tiêu nghiên cứu : Xác định độ nhạy PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân Xác định độ đặc hiệu PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Ưu điểm PCR đa mồi: Thành phần PCR - PCR PCR đa Tiết kiệm mồi Nước cất 11,1 ml 66,6 ml 6,3 ml 60,3 ml Ðệm 2,0 ml 12,0 ml 2,0 ml 10,0 ml dNTPs 1,6 ml 9,6 ml 1,6 ml 8,0 ml MgCl2 1,6 ml 9,6 ml 1,6 ml 8,0 ml Mồi 1,6 ml 9,6 ml 6,4 ml 3,2 ml Taq polymerase 0,1 ml 0,6 ml 0,1 ml 0,5 ml DNA mẫu 2,0 ml 12,0 ml 2,0 ml 10,0 ml Thể tích 20,0 ml 120,0 ml 20,0 ml 100,0 ml Qua bảng thấy, kỹ thuật PCR đa mồi cho phép tiết kiệm thời gian nguyên vật liệu (khoảng lần) so với chạy riêng rẽ PCR để chẩn đoán vi khuẩn gây tiêu chảy III ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Chủng Salmonella typhi VCMM2, chủng Salmonella typhi (phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân), Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, E coli ATCC 11775 chủng E coli ATCC gây tiêu chảy (EAEC, EHEC, EIEC, EPEC, ETEC) Các chủng 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ (trừ chủng S typhi từ bệnh nhân) Đề án Lưu giữ nguồn gen Vi sinh vật Y học, Bộ môn Vi sinh vật, Đại học Y Hà Nội cung cấp Vật liệu 2.1 Vật liệu dùng cho nuôi cấy xác định vi khuẩn - Môi trường dùng nuôi cấy phân lập vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey (SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA), loại tube, đĩa petri, kháng huyết số vi khuẩn đường ruột, hóa chất xác định vi khuẩn API 20E Biomerieux (Pháp) 2.2 Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ máy móc dùng PCR Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi với cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella V cholerae với mục đích sử dụng để phát lúc hai vi khuẩn bệnh phẩm phân tiêu chảy - Dung dịch đệm, nước khử ion, PCR master mix (Epicentre-Đức), thạch Agarose dùng điện di gel (BBL), Ethidium bromide dùng để nhuộm gel, TAE (Tris Acetate EDTA) - Máy điều nhiệt tự động GienAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Beckman), điện di ngang Horizon®58 (Gibco-BRL Mỹ), máy soi chụp gel Geldoc (BioRad Mỹ) Phương pháp nghiên cứu 3.1 Độ nhạy PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân a.Qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Qui trình dựa nghiên cứu Trung cộng Tóm tắt qui trình sau: - Bước 1: 200 mg phân hoà thật với 1ml huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland (109 vi khuẩn/ml) ml nước cất, lắc máy lắc - Bước 2: Ly tâm huyền dịch phân bước với tốc độ 1000 vịng/phút 10 phút cho lắng thành phần có kích thước lớn Lấy nước - Bước 3: Nước từ bước ly tâm tiếp với tốc độ 2000 vòng/phút 10 phút để lắng thành phần có kích cỡ trung bình Lấy nước - Bước 4: Nước từ bước ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút 10 phút để lắng vi khuẩn Loại bỏ nước lấy cặn - Bước 5: Hồ tan cặn với 500 µl nước cất, trộn máy lắc Ly tâm với tốc độ 4000 vịng/phút phút Lặp lại q trình rửa cặn 1-2 lần đến nước không màu vàng phân Loại bỏ nước - Bước 6: Hoà tan cặn thu bước vào 300 ml nước cất Đun sôi cách thuỷ 1000C 20 phút Sau đun làm lạnh cách cho ống Eppendorf vào khay đựng đá vụn - Bước 7: Ly tâm lạnh 12000 vòng/phút 15 phút, loại bỏ cặn Nước chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR Nếu chưa dùng ngay, nước bảo quản -200C b Xác định độ nhạy hệ thống PCR đa mồi - Pha chủng Salmonella typhi vào ml nước cất để có độ đục Macfarland - Pha loãng 10 lần huyền dịch chứa 109 vi khuẩn/ml để có nồng độ từ 109, 108 đến 101,100 vi khuẩn/ml - Trộn ml huyền dịch vi khuẩn với 200 mg phân xác định khơng có Salmonella gây tiêu chảy nuôi cấy phân lập PCR 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ - Tách chiết ADN theo qui trình - Tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi với ADN thu sau tách chiết + Các thành phần tham gia phản ứng PCR sau: Mỗi phản ứng gồm 25 µl thành phần sau: 12,5 µl PCR master mix (Epicentre, Canada); 2,5 mM cặp mồi OMPCF-OMPCR ctxB2-ctxB3 (Promega, Mỹ), µl DNA mẫu Chu trình nhiệt sau 950C/2’; 30 chu kỳ: 950C/1', 570C/1’, 720C/2'; chu kỳ 720C/7', giữ 40C - Độ nhạy phản ứng PCR đa mồi (giới hạn phát hiện) xác định nồng độ vi khuẩn thấp cho kết PCR Dương tính So sánh với phương pháp tách chiết kít QIAamp DNA Stool Mini Kit hãng QIAGEN (Đức) 3.2 Độ đặc hiệu PCR đa mồi - Pha chủng Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, chủng E coli ATCC 11775, chủng E coli gây tiêu chảy vào ml nước cất để có độ đục Macfarland (tương đương với 109 vi khuẩn/ml) - Các huyền dịch chứa 109 vi khuẩn/ml pha lỗng 10 lần để có nồng độ từ 109, 108 đến 101, 100 vi khuẩn/ml - Trộn ml huyền dịch vi khuẩn với 200 mg phân xác định khơng có Salmonella - Tách chiết DNA theo qui trình - Tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi với DNA thu sau tách chiết - Độ đặc hiệu xác định tỷ lệ chủng Âm tính với PCR đa mồi tổng số chủng thử So sánh với phương pháp tách chiết kít QIAamp DNA Stool Mini Kit hãng QIAGEN (Đức) 3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm PCR Bảng Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng sản phẩm PCR 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Xử lý số liệu Các số liệu quản lý phân tích chương trình SPSS 12.0 IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xác định độ nhạy PCR đa mồi Bảng Kết độ nhạy hệ thống PCR đa mồi Kết Bảng cho thấy, nhìn chung, PCR cho kết Dương tính nồng độ 106 CFU/ml Độ lặp lại 100% qua 10 lần thử Một số lần thử cho kết Dương tính nồng độ 105 CFU/ml Tiến hành thử với chủng S typhi phân lập từ bệnh nhân cho kết tương tự Nếu sử dụng kit QIAmp, ngưỡng phát 107VK/ml cho lần thử 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Xác định độ đặc hiệu PCR đa mồi Độ đặc hiệu xác định tỷ lệ chủng Âm tính với PCR đa mồi tổng số chủng thử Bảng Độ đặc hiệu PCR đa mồi Nhận xét Kết bảng cho thấy, PCR đa mồi với vi khuẩn đường ruột khác âm tính Điều chứng tỏ độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi 100% V BÀN LUẬN Độ nhạy PCR đa mồi - Hiện nay, PCR đánh giá kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao, gần 100% Kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao PCR sử dụng cặp mồi gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích - Tuy nhiên, thực kỹ thuật PCR, người ta thấy độ nhạy phản ứng giới hạn phát phản ứng Giới hạn nồng độ đoạn ADN đích hỗn hợp phản ứng Một trình tách chiết ADN tốt cho dung dịch ADN có chất lượng cao nồng độ đủ để phản ứng PCR cho kết dương tính 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ - Theo kết Bảng 2, giới hạn phát PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân 106 CFU/ml Trong đó, độ nhạy phản ứng PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân kit thương phẩm QIAamp 107 CFU/ml Kết điện di gel đoạn ADN khuyếch đại có kích thước phù hợp (so với marker) khơng có xuất băng khơng đặc hiệu Ngồi ra, tiến hành lặp lại 10 lần, thử nghiệm cho kết tương tự - Như vậy, ưu điểm đơn giản, khơng cần máy móc trang thiết bị đắt tiền, dễ thực hiện, kinh tế hơn, thời gian hệ thống PCR đa mồi xác định Salmonella sử dụng ADN tách trực tiếp từ phân qui trình chúng tơi, có độ nhạy cao so với PCR đa mồi sử dụng ADN tách trực tiếp từ phân kít QIAamp Mặc dù có số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR phát trực tiếp Salmonella từ phân Trong nghiên cứu Pathmanathan sử dụng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen hilA S typhimurium, cho độ nhạy 105 CFU/ml tách triết trực tiếp từ phân Tuy nhiên, nghiên cứu này, tác giả không đề cập đến độ lặp lại thực nghiệm Trong nghiên cứu chúng tôi, độ lặp lại thực nghiệm 100% (10/10) lần có kết độ nhạy 106 CFU/ml 50% (5/5) lần cho độ nhạy 105 CFU/ml Ngồi ra, qui trình chúng tơi khoảng h kể thời gian chạy PCR, điện di so với 18h nghiên cứu Pathamanathan Xác định độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi - Để đánh giá độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi tiến hành với số chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Các chủng bao gồm: Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, chủng E coli ATCC 11775 chủng E coli gây tiêu chảy thuộc loại (EAEC, EHEC, EIEC, EPEC, ETEC) Kết nghiên cứu cho thấy, với tất chủng vi khuẩn thử nghiệm, PCR cho kết 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ âm tính PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân, hồn tồn đặc hiệu với Salmonella Khơng có tượng âm tính giả với vi khuẩn khác đường tiêu hóa - Thực chất, độ đặc hiệu phản ứng PCR độ đặc hiệu cặp mồi sử dụng Cặp mồi phải lựa chọn cho có khả ghép cặp tốt với trình tự đầu đoạn DNA đích Kết xác định độ đặc hiệu ghi nhận cịn cho thấy, đoạn DNA đích lựa chọn để khuyếch đại, có trình tự nucleotid đoạn gen tương đối ổn định xuất với tần số cao chủng Salmonella; lại không thấy DNA chủng vi khuẩn đường ruột khác - Một nghiên cứu trước sử dụng cặp mồi OMPCF OMPCR xác định Salmonella Kết nghiên cứu cho thấy, thử với chủng Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Shigella boydii, PCR cho kết Âm tính - Tuy nhiên, kết nghiên cứu thực với ADN tách chiết từ chủng vi khuẩn Trong nghiên cứu này, sử dụng cặp mồi nêu trên, lại thực với ADN tách chiết trực tiếp từ phân Điều có nghĩa dung dịch ADN tách chiết được, khơng có chứa ADN chủng vi khuẩn mà chúng tơi trộn vào, mà cịn có ADN từ nhiều loại vi khuẩn khác có mẫu phân Trong nghiên cứu, trộn chủng vi khuẩn đường ruột hay gây bệnh cho người vào phân, dung dịch sau tách chiết vừa có ADN chúng vừa bao gồm ADN tất chủng vi khuẩn khác có mặt mẫu phân Do vậy, thực xác định độ đặc hiệu PCR dung dịch sau tách chiết này, tiến hành thử nghiệm độ đặc hiệu PCR với tất chủng vi khuẩn khác có mặt mẫu phân Hay nói thử nghiệm 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ rút ngắn nhiều thời gian tiết kiệm nhiều vật liệu công sức VI KẾT LUẬN - Độ nhạy hệ thống PCR đa mồi xác định Salmonella 106 CFU/ml, độ lặp lại thử nghiệm 100% - Độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân 100% VII Tài liệu tham khảo - Wikipedia tiếng Việt - Công nghệ sinh học thú y _ Nguyễn Ngọc Hải _ Nhà xuất Nông Nghiệp - Làm Vi khuẩn Salmonella gây Tiêu chảy Trong Máy chủ họ ScienceDaily (Ngày 17 Tháng 10 2009) - Phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng _ google.com.vn - Hai mươi bốn phát salmonella spp thực phẩm phương pháp PCR _ Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên.Viện Pasteur Tp Hồ Chi Minh - Nguyễn Tiến Dũng, Phát phân biệt Salmonella spp S.enterica I PCR khảo sát tần số xuất tương đối S.enterica I thủy sản, nước tự nhiện Luận văn thạc sĩ khoa học-Trường ĐHKHTN TP.Hồ Chí Minh 2002 - Nguyễn Văn Hịa Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát Salmonella spp thủy sản Luận văn thạc sĩ khoa học-Trường ĐHKHTN TP.Hồ Chí Minh 1999 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY I ĐẶT VẤN ĐỀ - Tiêu chảy vấn đề... CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Xác định độ đặc hiệu PCR đa mồi V BÀN LUẬN Độ nhạy PCR đa mồi Xác định độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi VI KẾT LUẬN - Độ nhạy Độ đặc hiệu VII Tài liệu tham khảo - LUAN VAN... thấy, PCR đa mồi với vi khuẩn đường ruột khác âm tính Điều chứng tỏ độ đặc hiệu hệ thống PCR đa mồi 100% V BÀN LUẬN Độ nhạy PCR đa mồi - Hiện nay, PCR đánh giá kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu