Đề tài nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths NGUYỄN THỊ THU HẰNG 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt Luận văn tốt nghiệp sinh viên phải trãi qua khó khăn vất vả Tuy nhiên, khó khăn khơng gây trở ngại cho q trình làm luận văn tơi Vì giúp đỡ động viên gia đình, thầy bạn bè suốt thời gian thực đề tài Nhân tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: Gia đình người thân tơi ủng hộ nhiều mặt tinh thần vật chất cho q trình thực tập Cơ Nguyễn Thị Thu Hằng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến q báo suốt q trình thực đề tài Thầy cô anh chị môn Sinh học Bệnh Thủy sản, khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 động viên giúp đỡ thực đề tài suốt trình học tập trường i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” thực chủng A hydrophila phân lập cá tra bệnh xuất huyết tất vi khuẩn định danh đến loài Đề tài thự thông qua nội dung: (i) kiểm tra kháng sinh đồ với kháng sinh Amoxycillin (AMX, 25µg), Ciprofloxacin (CIP, 5µg), Colistin (CS, 50µg), Doxycycline (DO, 30µg), Florfenicol (FFC, 30µg), Oxolinic acid (OA, 2µg), Streptomycin (S, 10µg), Norfloxacin (NOR, 10µg), (ii) xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh streptomycin (iii) ly trích plasmid vi khuẩn Aeromonas hydrophila Kết kháng sinh đồ cho thấy có 7/8 chủng kháng với amoxicillin, 7/8 mẫn cảm với ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin Với kháng sinh colistin có 2/8 chủng nhạy trung bình 6/8 mẫn cảm với kháng sinh Kháng sinh oxolinic acid có 3/8 kháng, 5/8 mẫn cảm Kháng sinh norfloxacin có 1/8 kháng, 1/8 trung bình nhạy, 6/8 mẫn cảm Từ kết kiểm tra kháng sinh đồ chọn loại kháng sinh (streptomycin) mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh vi khuẩn A hydrophila Qua cho thấy, đa phần chủng cho kết mẫm cảm với streptomycin với giá trị MIC dao động từ 4-16ppm Chỉ chủng kháng với streptomycin nồng độ 256ppm Bên cạnh đó, để tìm hiểu với kết kháng thuốc A hydrophila chúng có kiểu plasmid Đề tài tiến hành ly trích diện di plasmid chủng A hydrophila Kết phát plasmid chủng: CA1.2T CA1.3TT Chúng có kiểu plasmid khác nhau, biểu hai vạch không tương đồng ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH V CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh cá tra Đồng Bằng Sông Cửu Long 2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A hydrophila) 2.3 Tình hình sử dụng thuốc hóa chất ni trồng thủy sản ĐBSCL 2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc 2.5 Thuốc, hóa chất dùng nuôi trồng thủy sản 2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng nuôi trồng thủy sản .9 2.5.2 Khái niệm kháng sinh 2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng nuôi trồng thủy sản .9 2.6 Sơ lược plasmid vi khuẩn 12 2.6.1 Các loại plasmid 13 2.6.2 Plasmid tham gia vào chế tái tổ hợp gen nội bào 13 2.6.3 Plasmid có khả vận chuyển gen 14 2.6.4 Ý nghĩa sinh học plasmid .14 2.7 Plasmid kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 iii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 3.2.2 Dụng cụ 16 3.2.3 Thiết bị .16 3.2.4 Hóa chất mơi trường 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phục hồi tách ròng vi khuẩn 17 3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ .17 3.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC .19 3.3.4 Phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn (Bartie, 2004) 20 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22 4.2 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 26 4.3 Kết ly trích plasmid vi khuẩn Aeromonas hydrophila .28 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 5.1 Kết luận .32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 38 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng nghiên cứu kháng sinh đồ 18 Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn hàm lượng thuốc khác (cho chủng) 20 Bảng 4.1: Kết kiểm tra kháng sinh đồ 23 Hình 4.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila mơi trường NA 22 Hình 4.2: Kết nhuộm Gram vi khuẩn Aeromonas hydrophila .22 Hình 4.3: Kết kháng sinh đồ vi khuẩn Aeromonas hydrophila 23 Hình 4.4: Kết MIC streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila 27 Hình 4.5: Kết MIC nồng độ 256ppm (mũi tên) 28 Hình 4.6: Kết điện di chủng Aeromonas hydrophila 29 v LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) lồi cá da trơn có kích thước lớn họ Pangasiidae phân bố hạ lưu sông Mê Kông Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống ni cá tra quy mô nông hộ từ lâu đời Những thành công sản xuất giống nhân tạo vào năm 1990 thúc đẩy phát triển mạnh mẽ nghề nuôi cá tra, trở thành nghề công nghiệp nhiều nơi An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long v.v… (Dương Nhựt Long, 2003) Sản phẩm cá tra nuôi chế biến đa dạng xuất nhiều nước giới Thị trường tiêu thụ mở rộng góp phần lớn việc phát triển công nghiệp nuôi cá tra Diện tích ni mở rộng, xuất nuôi sản lượng cá tra hàng năm tăng lên đáng kể Cụ thể năm 2006 sản lượng cá tra 825.000 tấn, kim ngạch xuất 736.872.115 USD (Vũ Văn Dũng, 2007) Tuy nhiên, bên cạnh phát triển người ni cá tra ĐBSCL gặp khơng khó khăn trở ngại Trở ngại việc phát triển diện tích nuôi thủy sản với tốc độ nhanh phá vỡ quy hoạch vùng ni thuỷ sản an tồn, gây nhiễm mơi trường làm phát sinh dịch bệnh Khó khăn lớn mà người ni gặp phải tình hình dịch bệnh, làm giảm xuất sản lượng nuôi Thêm vào việc ni cá tự phát, khơng kiểm sốt năm gần đây, người ni ln gia tăng mật độ trình độ kỹ thuật cịn hạn chế Chất thải ao nuôi thải trực tiếp môi trường tạo điều kiện cho mầm bệnh phát triển, bệnh vi khuẩn chiến đa số xuất với tần xuất cao Trong đó, bệnh xuất huyết Aeromonas hydrophila gây chiếm tỉ lệ cao Mặc khác, bệnh cá nuôi xuất ngày nhiều: Xuất huyết, phù đầu, gan thận mủ,…và việc diễn biến phức tạp bệnh khiến người ni sử dụng nhiều loại kháng sinh, hóa chất với nồng độ không ngừng gia tăng (Nguyễn Quốc Thịnh, 2004−2006) Từ ngun nhân làm cho tình hình dịch bệnh ngày diễn biến phức tạp Tạo nên dòng vi khuẩn kháng thuốc làm cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn trở ngại Theo kết nghiên cứu Đặng Thị Hoàng Oanh ctv (2005), 196 dòng vi khuẩn phân lập từ hệ thống ni thủy sản ĐBSCL (có Aeromonas) hầu hết cho kết kháng thuốc có 34% kháng nhiều loại kháng sinh Với giá trị MIC có 91 % dòng vi khuẩn LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com thử nghiệm có giá trị cao (dao động 512 đến ≥1.024ppm) Bên cạnh đó, việc kháng thuốc vi khuẩn số cịn có liên quan đến việc hình thành plasmid kháng thuốc (R-plasmid) chúng (Trần Thị Thanh, 2000; Nguyễn Lân Dũng ctv, 2007 Saitanu et al., 1994) Tuy nhiên, thông tin việc hình thành plasmid kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh động vật thuỷ sản ĐBSCL cịn cần nhiều nghiên cứu để góp phần tìm hiểu rõ plasmid kháng thuốc vi khuẩn Từ vấn đề đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Nhằm tìm hiểu kiểu plasmid tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas hydrophila 1.3 Nội dung đề tài − Lập kháng sinh đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn Aeromonas hydrophila − Xác định kiểu plasmid vi khuẩn Aeromonas hydrophila LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh cá tra Đồng Bằng sơng Cửu Long Cá tra lồi có khả sống tốt điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, mật độ ni cao oxy hịa tan thấp (Dương Nhựt Long, 2003) Tuy nhiên, chúng bị số bệnh vi khuẩn, nấm ký sinh trùng… Sự diện bệnh làm giảm xuất sản lượng cá nuôi lớn, gây nhiều thiệt hại cho người nuôi cá tra thâm canh ĐBSCL Những năm 1999-2000, 2002-2003 cá tra bị bệnh, chết nhiều với biểu hiện: xuất huyết miệng hầu, nổ mắt, thận sưng có đốm trắng (Nguyễn Chung, 2008) Đặc biệt vào đầu năm 2006 sông Tiền sông Hậu xảy tượng cá tra chết hàng loạt, với đa số có biểu xuất huyết gan thận có nhiều đốn trắng (Hà Văn Bình Nguyên, 2006) Trước đây, bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (gan thận mủ) gây cá tra nuôi ĐBSCL Ferguson et al., (2001) phát xuất Việt Nam vào năm 1998 gây nhiều thiệt hại cho nghề nuôi cá nơi Hiện bệnh thường gặp gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra gồm ký sinh trùng như: Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus, nấm thủy mi, trùng dưa (Ichthyophthyrius), trùng mỏ neo (Lerneae), rận cá (Argulus), hai lồi gây thiệt hại nhiều Trichodina Dactylogyrus Bệnh vi khuẩn như: Aeromonas hydrophila, A salmonicida, A sobria, Edwardsiella ictaluri, E tarda, Pseudomonas sp,…Trong hai lồi gây thiệt hại nhiều Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết Edwardsiella ictaluri tác nhân gây bệnh mủ gan (Trần Anh Dũng, 2005) Bên cạnh bệnh ký sinh trùng số nghiên cứu Nguyễn Quang Hưng (2001), Cao Tuấn Anh (2005) bệnh ký sinh trùng cá tra giống có bệnh tương tự Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus, Ichthyophthyrius… Ngoài ra, theo kết khảo sát Huỳnh Cẩm Tú (2006), có thêm số giống loài ký sinh trùng như: Epistylis sp, Protoopalina sp, Trichodina Dactylogyrus xuất thường xuyên chiếm tỉ lệ cao Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2004), vào năm 2004 bệnh phù đầu có tần suất xuất nhiều nhất, chiếm (60%) Đây loại bệnh nguy hiểm, tốn nhiều chi phí cho LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com oxolinic acid, piromidic acid, pipemidic acid, ciprofloxacin, enoxacin, norfloxacin and ofloxacin ngoại trừ ampicillin Trong 54 chủng lại kháng với Cefazolin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline, sulfamonomethoxine, trimethoprim Kết kiểm tra MIC 30 chủng A hydrophila phân lập cá với streptomycin cho thấy có khoảng 25/30 chủng có giá trị MIC dao động từ 625ppm (µg/ml) chủng có MIC dao động 50-100ppm Ngồi ra, ông cho biết việc kháng loại thuốc vi khuẩn việc sử dụng kháng sinh thường xun q trình ni trị bệnh vi khuẩn gây Từ đó, cho thấy kháng sinh streptomycin khả khống chế vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết cá Mặc khác, nhận định việc kháng loại kháng sinh, hay giá trị MIC xác định loại kháng sinh có liên quan đến mức độ việc thường xuyên sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho đối tượng ni 10 11 Hình 4.5: Kết MIC nồng độ 256ppm (mũi tên) Ống 1: Đối chứng âm (−); ống 2: 2ppm; ống 3: 4ppm; ống 4: 8ppm; ống 5: 16ppm; ống 6: 32ppm; ống 7: 64ppm; ống 8: 128ppm; ống 9: 256ppm; ống 10: 512ppm; ống 11: Đối chứng dương (+) 4.3 Kết ly trích plasmid vi khuẩn A hydrophila Tương tự việc kiểm tra kháng sinh đồ MIC, với q trình ly trích plasmid vi khuẩn kiểm tra tính ni ống nghiệm 10ml NB Sau tiến hành ly trích plasmid điện di xác định kiểu plasmid vi khuẩn A hydrophila (Hình 4.6) 28 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com M Hình 4.6: Kết điện di chủng Aeromonas hydrophila Giếng M: CAF9; Giếng 1: CAF2; giếng 2: TN1.1T; giếng 3: CA1.3TT; giếng 4: TN2.4TT; giếng 5: CA1.2T; giếng 6: CS2.3T; giếng 7: TN2.1G; giếng 8: SĐ2.1T Kết điện di cho thấy có diện vạch plasmid chủng CA1.2T CA1.3TT Các chủng cịn lại khơng xác định vạch plasmid chúng Trong chủng xác định plasmid chúng có kiểu plasmid khác nhau, thể hai vạch plasmid khơng tương đương Trong vạch giếng số (chủng CA1.3TT) không biểu rõ vạch giếng số (chủng CA1.2T) Bên cạnh đó, kết kháng sinh đồ chủng CA1.3TT thể tượng đa kháng thuốc (kháng với AMX OA), chủng CA1.2T kháng loại kháng sinh thử nghiệm Như thế, giả thiết việc biểu vạch plasmid chủng CA1.2T điện di vi khuẩn có plasmid kháng thuốc tác động loại kháng sinh khác (ngoài loại kháng sinh đề tài sử dụng) Hoặc, plasmid chủng CAF2 có không mang gen kháng thuốc Mặc khác, chủng lại kháng với loại kháng sinh (amoxicillin) vạch plasmid chủng CAF2 kháng với 7/8 loại kháng sinh sử dụng không cho kết vạch plasmid điện di 29 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Điều chủng kháng loại kháng sinh chúng khơng hình thành plasmid kháng thuốc (R-plasmid), mà việc kháng thuốc hình thành trình sử dụng thuốc người nuôi Riêng việc không cho kết vạch plasmid chủng CAF2 chủng thể hiện tượng đa kháng thuốc, nhiễm sắc thể vi khuẩn đọc mã cho khả kháng thuốc Theo Nguyễn Lân Dũng ctv (2007), việc kháng thuốc vi khuẩn plasmid vi khuẩn đọc mã việc kháng thuốc nhiễm sắc thể đọc mã, dựa vào thay đổi hạt riboxom 30S chúng Trái lại, tính kháng kháng sinh plasmid lại dựa vào biến đổi chất kháng sinh nhờ vào tác dụng enzim Điển hình với kháng sinh streptomycin kháng sinh bị adenyl hóa enzim kháng thuốc vi khuẩn plasmid đọc mã Mặc khác, theo Nguyễn Hoàng Lộc ctv (2007) việc diện có khơng có vạch plasmid vi khuẩn có hay khơng có plasmid plasmid nằm nhiễm sắc thể vi khuẩn dạng tái tổ hợp với nhiễm sắc thể vi khuẩn Bên cạnh đó, theo Majumdar et al., (2007), việc tồn R-plasmid A hydrophila ảnh hưởng lớn đến cấu trúc bề mặt, phát triển tính độc chúng cảm nhiễm vào vật chủ Và R-plasmid định đến phát sinh dịch bệnh A hydrophila Ngoài ra, diện R-plasmid hay khơng A hydrophila cịn định tính kháng hay mẫn cảm với loại kháng sinh mà kháng trước Cụ thể, nghiên cứu ông vi khuẩn A hydrophila (được ký hiệu Wt-VB21) mang plasmid với trọng lượng khoảng 21kb (kilobazơ) chủng đa kháng với hầu hết kháng sinh: gatifloxacin (5µg), ampicillin (10µg), erythromycin (15µg), cefuroxime (30µg), chloramphenicol (30µg) tetracycline (30µg) Từ kết nghiên cứu Saitanu et al., (1994), cho thấy việc chuyển đổi Rplasmid phát từ chủng A hydrophila kháng thuốc phân lập cá Thái Lan Và nghiên cứu tác giả cho thấy hầu hết vi khuẩn kiểm tra kháng với 19 loại kháng sinh thử nghiệm Ngồi ra, tác giả cịn cho biết kháng sinh sulfamonomethoxine tetracycline sử dụng thường việc trị bệnh cho cá hầu hết chủng kháng với sulfamonomethoxine tetracycline có chứa R-plasmid Qua nghiên cứu ta hiểu để hình thành R-plasmid vi khuẩn kháng thuốc chúng vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng 30 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com sinh (có thể kháng loại kháng sinh) thể hầu hết chủng có liên quan thể tính độc hại việc gây bệnh cho vật chủ 31 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết kháng sinh đồ cho thấy: A hydrophila kháng với kháng sinh amoxycillin (87,5% số chủng) Riêng kháng sinh ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin nhạy với A hydrophila (87,5% số chủng) Colistin norfloxacin cho kết nhạy với 75% số chủng thử nghiệm có 25% kháng 25% trung bình nhạy Kháng sinh oxolinic acid có 62,5% số chủng nhạy, 37,5% trung bình nhạy Trong đó, có 12,5% số chủng (1 chủng) đa kháng với kháng sinh, 25% (2 chủng) kháng kháng sinh thử nghiệm Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) streptomycin chủng, có chủng nhạy với giá trị cao dao động từ 4-16ppm Riêng chủng ( CAF2) cho kết kháng với giá trị MIC 256ppm Kết điện di plasmid A hydrophila phát kiểu plasmid chủng: CA1.2T CA1.3TT Chúng có kiểu plasmid khác với hai vạch không tương đương 5.2 Đề xuất Cần thử nghiệm nhiều loại kháng sinh để ứng dụng nghiên cứu điều trị nhằm đạt hiệu tốt Cần thực nghiên cứu xác định phương pháp ly trích plasmid vi khuẩn chuẩn cho dòng vi khuẩn xác định trọng lượng plasmid chúng 32 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Austin, B and D Austin., 1986 Bacterial fish pathogens disease in farmed and wild fish second edition Bùi Quang Tề, 2008 Bệnh thường gặp cá trắm cỏ biện pháp phịng trị NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Bùi Quang Tề Vũ Thị Tám, 1994 Những bệnh thường gặp cá tôm nuôi Đồng Bằng Sơng Cửu Long biện pháp phịng trị NXB Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Cao Tuấn Anh, 2005 Thành phần giống loài vi khuẩn ký sinh trùng cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) huyện Tân Châu Tỉnh An Giang Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ Châu Hồng Thúy, 2008 Khảo sát tình hình xuất bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra nuôi thâm canh tỉnh Trà Vinh Luận văn tốt nghiệp cao học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ Crumlish, M., Thanh, P.C., Koesling, J., Tung, V., T and Gravningen, K., 2006 Antibiotic sensitivity profles for bacteria from natural outbreaks of Edwardsiellosis and motile Aeromonas septicaemia in Vietnamese Pangasius hypophthalmus www.pharmaq.no/Posters/DAAVI_2008_poster Dương Nhựt Long, 2003 Giáo trình kỹ thuật ni thủy sản nước Khoa Thủy Sản−Đại học Cần Thơ Dương Võ Mỹ Hạnh, 2008 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings and Alan Teale, 2005 Xác định tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ hệ thống nuôi thủy sản Đồng Bằng Sơng Cửu Long, Việt Nam Tạp chí Nghiên cứu Khoa học−Đại học Cần Thơ 4:2005, 136-144 33 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 10 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội, 2004 Bệnh học thủy sản Nhà xuất Nông nghiệp−TP Hồ Chí Minh 237 trang 11 Ferguson, H.W, J.F Turnbull, A Shinn, K Thompson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases 2001 24: 509-513 12 Hà Văn Bình Nguyên, 2006 Thơng tin tình trạng cá chết hàng loạt sông Tiền sông Hậu: Tăng cường biện pháp phịng ngừa cá chết nhiễm nguồn nước http://www.vietlinh.com.vn/dbase/VLTTShowContent.asp?ID=2324 nhật ngày 02/01/2009) (Cập 13 Huỳnh Cẩm Tú, 2006 Khảo sát thành phần mức độ cảm nhiễm ký sinh trùng cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 14 Huỳnh Chí Thanh, 2007 Xác định đặc điểm sinh hóa bước đầu thử nghiệm điều trị bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus) kháng sinh Luận văn tốt nghiệp Đại học− Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 15 Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Khoa Thủy sản Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 16 Huỳnh Văn Quang, 2008 Khảo sát tình hình nghề ni cá tra ao (Pangasianodon hypophthalmus) tỉnh Vĩnh Long Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản− Đại học Cần Thơ 17 Inglis V., R.J Roberts and N.R Bromage., 1993 Bacterial diseases of fish Institute of aquaculture 18 Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc Phạm Thanh Liêm, 2007 Thuốc hóa chất nuôi trồng thủy sản Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 19 Lê Trung Tính, 2007 Độ nhạy nồng độ diệt khuẩn kháng sinh với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh cá tra giống (Pangasius 34 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com hypophthalmus) Thực tập tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 20 Majumdar, T., S Datta., D Ghosh., S Dutta., A Chakraborty., R Goswami and S Mazumder, 2007 Role of virulence plasmid of Aeromonas hydrophila in the pathogenesis of ulcerative disease syndrome in Clarias batrachus Indian Journal of Biochemistry & Biophysies Vol 44, October 2007, pp 401-406 21 Nguyễn Chung, 2008 Kỹ thuật sinh sản nuôi cá tra NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh 22 Nguyễn Chính, 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất ni cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh An Giang Cần Thơ Luận văn thạc sĩ khoa học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 23 Nguyễn Hà Giang, 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định tiêu sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila khoa thủy sản Luận văn tốt nghiệp Đại học− Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 24 Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh 25 Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ Hà Thị Minh Thi, 2007 Giáo trình sinh học phân tử NXB Đại học Huế, Huế 217 Trang 26 Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008 Điều tra trạng bệnh, ni tình hình sử dụng thuốc – hóa chất ni thâm canh cá tra ao Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 27 Nguyễn Thị Phương Nga, 2004 Phân tích tình hình phân phối sử dụng thuốc ni trồng thủy sản Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau Luận án thạc sĩ Nuôi trồng thủy sản−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 28 Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Khoa Thủy sản Luận văn tốt nghiệp đại học− Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 29 Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005 Sưu tầm thiết lập hệ thống lưu trữ loại vi khuẩn phân lập tôm cá khoa thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ Báo cáo khoa học Đại học Cần Thơ – Bộ Giáo Dục Đào Tạo 35 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 30 Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997 Định loại vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus) bước đầu thử nghiệm thuốc phòng trị Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 31 Nguyễn Trọng Bình, 2008 Tác nhân gây bệnh đốm trắng gan, thận (bệnh gan, thận mủ) hướng ngăn ngừa bệnh Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh http://www.hcmbiotech.com.vn/salient-newsdetail.php?id=19 (cập nhật ngày 07/01/2009) 32 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2007 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục 33 Nguyễn Quang Hưng, 2001 Điều tra đánh giá mức độ cảm nhiễm bệnh ký sinh trùng vi khuẩn cá tra giống ba tỉnh An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Nông nghiệp−Đại học Cần Thơ 34 Nguyễn Minh Nhí, 2007 Hiệu lực số loại kháng sinh dòng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây cá tra giống (Pangasius hypophthalmus) Thực tập tốt nghiệp−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 35 Nguyễn Quốc Thịnh, 2004-2006 Điều tra tình hình sử dụng thuốc hóa chất nuôi cá tra (Pangasus hypophthalmus) Đề tài cấp trường Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 36 Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung Ferguson H.W., 2004 Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 120-125 37 Phạm Thanh Tuấn, 2004 Khảo sát bước đầu tình hình sử dụng thuốc hóa chất nghề nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tỉnh Đồng Tháp Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 38 Phan Trọng Duy, 2007 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cá tỉnh Cần Thơ, An Giang Thực tập tốt nghiệp Đại học Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 39 Saitanu, K., A Chongthaleong., M Endo., T Umeda., K Takami., T Aoki and T Kitao., 1994 Antimicrobial Susceptibilities and detection of Transferable R-Plasmids from Aeromonas hydrophila in Thailand Asian Fisheries Science 7(1994): 41-46 36 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 40 Sở Nơng Nghiệp Vĩnh Long, 2008 Tình hình thực công tác tháng đầu năm 2008 kế hoạch tháng cuối năm 2008 Chi Cục Thủy Sản © Cổng Thơng tin điện tử ngành Nơng nghiệp PTNT tỉnh Vĩnh Long http://snongnghiep@vinhlong.gov.vn (cập nhật ngày 21/12/2008) 41 Trần Anh Dũng, 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tỉnh An Giang Luận văn thạc sĩ khoa học−Đại học Cần Thơ 42 Trần Thị Thanh, 2000 Công nghệ vi sinh NXB Giáo Dục 43 Trần Kiều Lan Phương, 2008 Khảo sát tình hình ni cá tra (Pangasius hypophthalmus) ao hai tỉnh Cần Thơ Hậu Giang Luận văn tốt nghiệp Đại học−Khoa thủy sản−Đại học Cần Thơ 44 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh Trần Thi Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học Thủy sản Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 45 Từ Thanh Dung, 2008 Giáo trình bệnh vi khuẩn động vật thủy sinh Khoa Thủy sản−Đại học Cần Thơ 46 Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 47 Vũ Văn Dũng, 2007 Tồn giải pháp phát triển bền vững nghề nuôi cá tra, basa tỉnh ĐBSCL Tạp chí thủy sản 7:13-16 37 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Phụ lục I A Pha dung dịch nhuộm gram Dung dịch Crystal violet 2g Ethanol (95%) 20ml Ammonium oxalate 0,8g Nước cất 80ml Hòa tan crystal violet ethanol, hòa tan ammonium oxalate nước cất Trộn dung dịch lại, để yên sau 24 giờ, sau tiến hành lọc Dung dịch Iodine 1g Potassium iodide 2g Nước cất 300ml Hòa tan potassium iodide 200ml nước cất Cho thêm iodine vào để n qua đêm Sau thêm thể tích nước lại Dung dịch Pha dung dịch theo tỉ lệ: 95% ethanol : 5% acetone Dung dịch Safranin 0,25g Ethanol (95%) 10ml Nước cất 90ml Hòa tan safranin ethanol, sau cho nước cất vào B Pha nước muối sinh lý (0,85% NaCl) NaCl 8,5g Nước cất 1000ml Hòa tan 0,85g NaCl vào 100ml nước cất 38 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com C Pha ống chuẩn McFarland Ống McFarland 10 BaCl2 1% (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 H2SO4 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 Mật độ vi khuẩn khoảng (x 108 cfu/ml) 12 15 18 21 24 27 30 D Pha môi trường TSA (triptic soy agar) 40g Nước cất 1000ml NA (nutrient agar) 20g Nước cất 1000ml MHA (muller hinton agar) 38g Nước cất 1000ml Hịa tan hàm lượng mơi trường (NA, TSA MHA) tương ứng vào nước cất, sau tiệt trùng nhiệt độ 1210=C 15 phút Để nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C, tiến hành đổ môi trường đĩa Petri với độ dày khoảng 4mm E Pha NB (nutrient broth) NB 18g Nước cất 1000ml Hịa tan hàm lượng mơi trường NB cần sử dụng vào nước cất, sau tiệt trùng nhiệt độ 1210C 15 phút F Nhuộm Gram vi khuẩn Nhỏ giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trãi lên giọt nước cất Để lame khơ nhiệt độ phịng, sau hơ lướt lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn để nguội, sau tiến hành nhuộm với dung dịch nhuộm Các bước nhuộm Gram: − Nhỏ dung dịch crystal violet (dung dịch 1) lên lame, để yên phút 39 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com − Rửa lame vịi nước cho hết màu tím lame ( rửa khoảng giây) − Nhỏ dung dịch iodine (dung dịch 2) phút − Lật nghiêng lame cho hết dung dịch iodine lame − Rửa dung dịch 3: để tẩy màu, cách lật nghiêng lame nhỏ từ từ dung dịch giọt nước cuối lame khơng cịn màu tím (khoảng 2-3 giây) Rửa vảy cho nước − Nhỏ dung dịch safranin (dung dịch 4) lên lame Để khoảng phút, rửa vảy cho nước Để khơ nhiệt độ phịng − Quan sát kính hiểm vi vật kính 40X, 100X (có dầu soi kính) Đọc kết quả: − Vi khuẩn gram dương (G+) có màu tím xanh − Vi khuẩn gram âm (G-) có màu hồng đỏ Phụ lục II Kết MIC mức nồng độ khác Nồng độ (ppm) 16 32 64 128 256 512 SĐ2.1T CS2.3T CA1.2T CAF2 TN2.4TT TN2.1G TN1.1T CA1.3TT + + + − + − + + − + + + + + + + − + + − + + + − + + + − + + − Ghi chú: (+): Có vi khuẩn phát triển (−): Khơng có vi khuẩn phát triển Phụ lục III A STE buffer 0,1 M NaCl 10 mM Tris 40 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com mM EDTA pH Để pha 100ml STE cần : 0,585g NaCl, 1ml Tris 1M, 0,1ml EDTA 1M B Dung dịch 50 mM glucose 25 mM Tris 10 mM EDTA Để pha 100ml Solution I cần: 0,9g glucose, 2,5ml Tris 1M, 1ml EDTA 1M C Dung dịch 0,2N NaOH 1% SDS Để pha 100ml Solution II cần : 0,4g NaOH, 10ml SDS 10% D Dung dịch Thể tích 5M CH3COOK Glacial acetic acid Nước cất tiệt trùng 60ml 11,5ml 28,5ml E Ehanol 70% Ethanol 7ml Nước cất hai lần tiệt trùng 3ml Cho 3ml nước cất hai lần tiệt trùng vào 7ml ethanol F TE 10mM Tris 1mM EDTA 10ml TE cần : 0,1ml Tris 1M, 0,02ml EDTA 0,5M G 50 x TAE M Tris acetate 50 mM EDTA (pH8.0) H Glycerol loading buffer (X6) 0,25% bromocresol purple 50% glycerol X6 TAE pH 8.0 41 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phụ lục VII Bảng : Kết kháng sinh đồ Đường kính vịng vơ trùng Kháng sinh Vi khuẩn CAF2 TN2.4TT TN2.1G TN1.1T CS2.3T CA1.2T CA1.3TT SĐ2.1T L1 L2 TB L1 L2 TB L1 L2 TB L1 L2 TB L1 L2 TB L1 L2 TB L1 L2 TB L1 L2 TB AMX CIP CS DO FFC OA S NOR 0 9 9 10 9.5 9 19 17 18 8 10 9.5 10 10 10 0 23 23 23 25 25 25 20 22 21 21 23 22 30 28 29 23 23 23 25 25 25 13 11 12 10 11 10.5 11 11 11 10 10 10 12 12 12 10 12 11 10 12 11 11 13 12 9 26 27 26.5 25 27 26 25 27 26 25 25 25 30 30 30 30 30 30 32 32 32 11 10 10.5 31 30 30.5 32 31 31.5 30 30 30 21 19 20 30 32 31 35 34 34.5 35 35 35 0 18 19 18.5 20 18 19 19 19 19 20 20 20 18 20 19 0 0 0 0 18 18 18 18 17 17.5 18 17 17.5 16 16 16 19 17 18 21 19 20 21 21 21 0 21 22 21.5 22 22 22 20 20 20 15 15 15 25 25 25 23 23 23 23 23 23 Ghi chú: L1: Lần kiểm tra thứ L2: Lần kiểm tra thứ hai TB: Trung bình hai lần kiểm tra Kháng sinh: AMX: amoxicillin (25µg); CIP: ciprofloxacin (5µg); CS: colistin (50µg); DO: doxycycline (30µg); FFC: florfenicol (30µg); OA: oxolinic acid (2µg); S: streptomycin (10µg); NOR: norfloxacin (10µg) 42 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... TẮT Đề tài ? ?Nghiên cứu kiểu plasmid tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)? ?? thực chủng A hydrophila phân lập cá tra bệnh xuất huyết. .. kiểu plasmid tính kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài Nhằm tìm hiểu kiểu plasmid tính kháng thuốc vi khuẩn. .. DUYÊN NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH