Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme alcalase

i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực thân cịn có giúp đỡ tận tình người trước, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến người giúp đỡ em suốt thời gian qua, thời gian tháng thực tập phịng thí nghiệm Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.Ts Ngơ Đăng Nghĩa, Th.S Ngơ Thị Hồi Dương bên em, trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình truyền đạt kinh nghiệm quý báu để em bước hồn thành tốt đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn thầy cô trường, thầy cô khoa công nghệ thực phẩm, môn công nghệ chế biến trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức suốt thời gian em theo học nhà trường Em xin chân thành cảm ơn đến thầy, cô phụ trách phịng thí nghiệm Hóa sinh – vi sinh thực phẩm, thầy cô môn quản lý chất lượng an tồn thực phẩm, mơn cơng nghệ lạnh, anh chị trung tâm công nghệ sinh học Trung tâm ứng dụng công nghệ chế biến trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực tập Em chân thành cảm ơn chị Ngọc Hoài sinh viên cao học thạc sĩ, bạn sinh viên lớp 50CBTS, toàn thể bạn sinh viên thực tập phịng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ động viên em Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến anh chị em thân yêu, người ủng hộ nhiệt tình vật chất lẫn tinh thần trình học tập thực đề tài Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Hồng Anh Diễm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát phế liệu tôm 1.1.1 Tình hình ni trồng, chế biến xuất tôm Việt Nam 1.1.2 Sản lượng phế liệu tôm chế biến thủy sản .4 1.1.3 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng phế liệu tôm 1.1.3.1 Thành phần hóa học phế liệu tơm 1.1.4 Các hướng tận dụng phế liệu tôm 1.1.4.1 Sản xuất thức ăn chăn nuôi .7 1.1.4.2 Sản xuất chitin – chitosan dẫn xuất khác chitin 1.1.4.3 Sản xuất màu Astaxanthin 1.1.4.4 Làm sản phẩm định hình 1.1.4.5 Sản phẩm súp canh, mắm tôm gia vị .8 1.2 Enzyme protease trình thủy phân protein 1.2.1 Enzyme protease 1.2.1.1 Phân loại protease 1.2.1.2 Nguồn thu nhận protease 10 1.2.1.3 Cơ chế tác dụng protease 10 1.2.1.4 Hoạt độ enzyme 11 1.2.1.5 Enzyme Alcalase 12 1.2.1.6 Hệ enzyme protease tôm 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iii 1.2.2 Quá trình thủy phân protein enzyme protease 14 1.2.2.1 Protein thủy phân 14 1.2.2.2 Phương pháp sản xuất protein thủy phân 16 1.2.2.3 Giá trị dinh dưỡng hoạt tính sinh học dịch thủy phân protein 16 1.2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein 17 1.3 Giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 19 1.3.1 Nguyên tắc 20 1.3.2 Công dụng RMS 21 1.3.3 Ưu, nhược điểm RMS 22 1.3.4 Các mơ hình thí nghiệm RMS 22 1.3.4.1 Thiết kế Box-Behnken (BBD) 22 1.3.4.2 Thiết kế Central composit (CCD) 23 1.4 Các nghiên cứu ứng dụng nguyên liệu cịn lại từ ngun liệu tơm 25 1.4.1 Trên giới 25 1.4.2 Ở Việt Nam 27 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 28 2.1.2 Enzyme Alcalase 28 2.1.3 Hóa chất 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu xử lý số liệu 28 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1.1 Phương pháp thu nhận mẫu 28 2.2.1.2 Phương pháp phân tích tiêu 29 2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 2.3.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước thủy phân việc bổ sung enzyme đến thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv 2.3.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến trình thủy phân protein đầu tơm thẻ chân trắng 33 2.3.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa q trình thủy phân protein enzyme Alcalase đầu tôm thẻ chân trắng 34 2.3.5 Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết đánh giá ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme Alcalase đến khả thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng 39 3.1.1 Ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân protein thu 39 3.1.2 Ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme đến khả chống oxi hóa dịch thủy phân protein thu 41 3.1.3 Ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein lại bã 43 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến trình thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng 44 3.2.1 Kết đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân 44 3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố đến khả chống oxi hóa dịch thủy phân 50 3.3 Kết tối ưu hóa q trình thủy phân protein enzyme Alcalase đầu tôm thẻ chân trắng 56 3.4 Kết đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 73 4.1 Kết luận 73 4.2 Đề xuất ý kiến 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học phế liệu tôm Penaeus vannamei Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến trình thủy phân protein đầu tôm cho giá trị biên 33 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến q trình thủy phân protein đầu tơm tâm phương án 34 Bảng 2.4 Mức thí nghiệm yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa q trình thủy phân protein đầu tôm 35 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa q trình thủy phân protein đầu tôm theo RMS-CCD 36 Bảng 3.1 Bảng Effect list cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 44 Bảng 3.2 Bảng Effect list cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 50 Bảng 3.4 Kết ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RMS-CCD 57 Bảng 3.5 Bảng FIT SUMMARY hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 58 Bảng 3.6 Bảng FIT SUMMARY hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 58 Bảng 3.7 Bảng FIT SUMMARY hàm mục tiêu hiệu suất khử protein lại bã 58 Bảng 3.8 Kết phân tích ANOVA 59 Bảng 3.9 Bảng tổng hợp tiêu chí lựa chọn chế độ xử lý tối ưu cho trình thủy phân protein đầu tôm 67 Bảng 3.10 Nhận xét cảm quan dịch thủy phân protein từ đầu tôm 70 Bảng 3.11 Một số tiêu sinh hóa học dịch thủy phân protein từ đầu tôm 71 Bảng 3.12 Thành phần % axit béo 71 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Phản ứng thủy phân xúc tác protease 11 Hình 1.2 Phản ứng thủy phân protein 14 Hình 1.3 Sơ đồ chức chuyển đổi 20 Hình 1.4 Biểu diễn hình thức chức đáp ứng 21 Hình 1.5 Thiết kế Box-Behnken 23 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng cơng đoạn xử lý nhiệt xử lý enzyme đến thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng 32 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein 37 Hình 3.1 Ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân protein thu 39 Hình 3.2 Ảnh hưởng cơng đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme đến khả chống oxi hóa dịch thủy phân protein thu 41 Hình 3.3 Ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein lại bã 43 Hình 3.4 Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân 45 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 47 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng tương tác hai yếu tố nồng độ enzyme nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng protein hịa tan 48 Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng tương tác hai yếu tố nồng độ enzyme thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan 49 Hình 3.8 Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng yếu tố đến khả chống oxi hóa dịch thủy phân 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vii Hình 3.9 Đồ thị ảnh hưởng yếu tố nồng độ enzymem, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến khả chống oxi hóa dịch thủy phân 53 Hình 3.10 Đồ thị ảnh hưởng tương tác hai yếu tố nồng độ enzyme thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử 54 Hình 3.11 Đồ thị ảnh hưởng tương tác hai yếu tố nhiệt độ thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử dịch thủy phân 55 Hình 3.16 Đồ thị hàm lượng protein hịa tan , nồng độ DPPH bị khử hiệu suất khử protein lại 62 Hình 3.17 Đồ thị ei vs Run hàm lượng protein hòa tan, nồng độ DPPH bị khử hiệu suất khử protein lại 63 Hình 3.18 Biểu đồ Contour 3D-surface cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan 69 Hình 3.19 Biểu đồ Contour cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử 69 Hình 3.20 Biểu đồ Contour 3D-surface cho hàm mục tiêu hiệu suất khử protein lại bã 70 Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn thành phần % axit amin có dịch thủy phân tối ưu 72 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NL : Nguyên liệu XL : Xử lý đv : Đơn vị TLK : Trọng lượng khô DH : Độ thủy phân TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam E : Enzyme S : Cơ chất DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl TN : Thí nghiệm RMS : Phương pháp bề mặt đáp ứng BSA : Bovine serum albumin Da : Dalton (Đơn vị khối lượng phân tử peptid) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nước ta ngành chế biến thủy sản trở thành ngành kinh tế mũi nhọn đất nước, chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Trong đó, mặt hàng tôm coi mặt hàng xuất thủy sản chủ lực có mức tăng trưởng cao Với phát triển ngày cao khoa học công nghệ, bên cạnh sản phẩm chính, ngun liệu cịn lại bao gồm đầu vỏ tôm tận dụng cách tối đa hiệu sản xuất bột đạm, thức ăn chăn nuôi, tách chiết astaxanthin, sản xuất chitin-chitosan Điều góp phần to lớn việc xử lý ô nhiễm môi trường, nâng cao giá trị cho ngành thủy sản tạo thêm nhiều công ăn việc làm, thu nhập cho người dân Trong phế liệu đầu tơm có chứa tới 50% hàm lượng protein [4] với đủ thành phần axit amin không thay có giá trị cao mặt sinh học Vì việc nghiên cứu trình thủy phân protein từ đầu tôm cần thiết Một số nghiên cứu trình thủy phân protein đầu tôm quan tâm thực nước ta phương pháp bố trí thí nghiệm sử dụng chủ yếu phương pháp cổ điển, chưa đánh giá đầy đủ tác động yếu tố ảnh hưởng Nghiên cứu nhiều tác giả giới trình thủy phân protein đầu tơm q trình chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thời gian thủy phân… (Diniz and Martin 1997a; Deng et al 2002) Vì để hiểu rõ yếu tố ảnh hưởng tương tác qua lại chúng cần sử dụng công cụ toán học hỗ trợ Box Wilson giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS), công cụ hiệu cho phép nghiên cứu tối ưu trình thủy phân Trước tình hình đó, hướng dẫn thầy PGS.TS Ngơ Đăng Nghĩa Th.S Ngơ Thị Hồi Dương, em thực đề tài “Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu trình thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng enzyme Alcalase” LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 Mục đích đề tài  Xác lập chế độ thủy phân protein tối ưu đầu tôm thẻ chân trắng với Alcalase phương pháp bề mặt đáp ứng để thu hồi đồng thời protein chitin  Đặc trưng tính chất dịch thuỷ phân Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Kết đề tài liệu khoa học sử dụng enzyme thu hồi sản phẩm hữu ích từ ngun liệu cịn lại q trình chế biến tơm, đồng thời cho phép tối ưu hố q trình sản xuất qui mô pilot Nội dung đề tài  Đánh giá ảnh hưởng công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước thuỷ phân việc bổ sung enzyme Alcalase đến khả thủy phân protein đầu tôm  Đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến trình thủy phân protein đầu tôm  Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu hóa q trình thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng enzyme Alcalase  Đặc trưng hóa tính chất sinh học dinh dưỡng dịch thủy phân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 73 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận Công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu việc bổ sung enzyme ảnh hưởng đến khả thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng, đặc biệt kết hợp hai công đoạn làm tăng giá trị dinh dưỡng hoạt tính sinh học dịch thủy phân protein Do đó, cần xử lý nhiệt cho nguyên liệu bổ sung enzyme trước tiến hành thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng Các yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thời gian có ảnh hưởng đến q trình thủy phân protein đầu tơm thẻ chân trắng, đặc biệt tương tác yếu tố Chế độ thủy phân tối ưu cho q trình thủy phân protein đầu tơm thẻ chân trắng là: - Nồng độ enzyme so với chất: 0,3% - Nhiệt độ thủy phân: 62oC - Thời gian thủy phân: 2h - Tỷ lệ nước/NL: 1/1 - pH tự nhiên Giá trị dinh dưỡng hoạt tính sinh học dịch thủy phân cao thích hợp cho việc bổ sung vào thực phẩm người - Hàm lượng protein hòa tan: 2614,617 mg/100g NL - Hàm lượng peptid axit: 18,96 mg/ml - Nồng độ DPPH bị khử: 41,07 µM/100g NL - Hàm lượng astaxanthin: mg/l - Hàm lượng axit amin axit béo cao đầy đủ 4.2 Đề xuất ý kiến Cần có nghiên cứu sâu xác định chiều dài đoạn peptid Nghiên cứu tận dụng phần bã sau thủy phân để tách chiết thu hồi Astaxanthin chitin LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hữu Dũng (2005), Tận dụng phế liệu tôm, Dự án cải thiện chất lượng xuất thủy sản SEAQID, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Cao thị Nhỏ (2005), Nghiên cứu thu hồi protein astaxanthin quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Thủy Sản, Nha Trang GS.TSKH Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), GVC Đỗ Minh Phụng, TS.Nguyễn Anh Tuấn (2006), Công nghệ chế biến thực phẩm Thủy sản, Nhà xuất Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trang 117 – 122 Trang Sĩ Trung (chủ biên), Trần thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phương (2007), Chitin – chitosan từ phế liệu thủy sản ứng dụng, NXB Nông nghiệp Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thượng Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp TP.Hồ Chí Minh Trần Thị Luyến (chủ biên), Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2006), “Sản xuất chế phẩm kỹ thuật y dược từ phế liệu thủy sản”, NXB Nông nghiệp Đặng Thị Hiền (2008), “Nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp sinh học” Luận văn thạc sĩ kỹ thuật trường Đại học Nha Trang Lê Ngọc Tú (1998), Hóa sinh cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Đỗ Thị Kim Sa (2011), “Nghiên cứu khả chống oxi hóa dịch protein Artemia thủy phân enzyme nội enzyme bổ sung”, Luận án tốt nghiệp đại học Nha Trang 10 Lưu Thủy Tiên, (2009)“Các phương pháp thu nhận chế phẩm protein”, Luận án tốt nghiệp 11 Nguyễn Tiến Lực (2001), Nghiên cứu đặc điểm dinh dưỡng hồn thiện cơng nghệ sản xuất thức ăn nuôi tôm sú, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, TP Hồ Chí Minh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 75  Tài liệu nước 12 Satya S Dey · Krushna Chandra Dora (2011),“Optimization of the production of shrimp waste protein hydrolysate using microbial proteases adopting response surface methodology” 13 Neda Zangeneh, Alireza Azizian, Leonard Lye, and Radu Popescu (2002), “Application of response surface methodology in numerical geotechnical analysis”, University of Newfoundland 14 Mustapha RGUIG (2005), Méthodologie des surfaces de réponse pour l’analyse en fiabilité des plates-formes pétrolières offshore fissures, Thèse de doctorat 15 Rebeca B, Pena – Vera.MT, Diaz-Castaneda M., (1991), Production of fissh protein hydrolysates with bacterial proteases yield and nutritional value, J Food Sci 56, pp.14 – 309 16 Hui-Chun Wu, Hua-Ming Chen, Chyuan-Yuan Shiau Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus) Food Research International 36 (2003) 949–957 17 Raquel Linhares Careira cộng Analysis of Peptide Profiles of Casein Hydrolysates Prepared with Pepsin, Trypsin and Subtilisin Acta Farm, Bonaerense 23 (1):17-25 (2004)  Từ internet 18 http://thuysanvietnam.com.vn/index.php/news/details/index/1939.let 19 http://www.vasep.com.vn/Thong-ke-thuy-san/123_18494/Xuat-khau-tom- Viet-Nam-tu-11-den-1542012.htm 20 https://sites.google.com/site/projectfor2010/thongtincanbiet 21 http://phapluattp.vn/20101017104859840p0c1018/dung-vo-tom-xu-ly-bun- thai-cong-nghiep.htm 22 http://hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghiencuu/1241- 27052011.html 23 http://www.weibull.com/DOEWeb/rsm_designs.htm#Box-Behnken Designs 24 http://www.weibull.com/DOEWeb/rsm_designs.htm#Central Composite Designs LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích hóa học 1.1 Định lượng hàm ẩm phương pháp trọng lượng sấy nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700-1990  Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu thử, sau cân trọng lượng mẫu trước sau sấy khơ, từ tính phần trăm nước có thực  Dụng cụ, hóa chất: - Tủ sấy có điều chỉnh nhiệt độ - Cân phân tích, đo xác 10-4g - Cốc sấy có nắp đậy - Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm có Sillicagen - Găng tay - Kéo gắp dài  Tiến hành: - Sấy cốc đến khối lượng không đổi: rửa cốc, để khô, sấy nhiệt độ 100÷150oC khoảng 1h, lấy làm nguội bình hút ẩm  cân  sấy tiếp nhiệt độ khoảng 30 phút  làm nguội bình hút ẩm  cân  đến hai lần liên tiếp sai khác không 0.0001g - Cân xác ÷ 2g mẫu đầu tơm cho vào cốc sấy khô trên, chuyển cốc vào tủ sấy khoảng 2h nhiệt độ 60 ÷ 80oC, sau nâng nhiệt lên 100 ÷ 105oC sấy tiếp liên tục 6h Sấy xong đem làm nguội bình hút ẩm (20-30 phút) đem cân cân phân tích với độ xác Cho lại vào tủ sấy 100 ÷ 105oC 30 phút, lấy để nguội bình hút ẩm cân trọng lượng không đổi Kết lần cân liên tiếp không cách 0.5mg cho gam chất thử LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Tính kết quả: Hàm lượng ẩm mẫu phân tích tính theo cơng thức sau: G1 – G2 X = Trong đó: *100 (%) G1 – G X : hàm lượng ẩm hay hàm lượng nước mẫu phân tích (%) G1: khối lượng cốc sấy mẫu thử trước sấy (g) G2: khối lượng cốc sấy mẫu thử sau sấy (g) G : khối lượng cốc sấy (g) 1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan phương pháp Biuret theo Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949)  Nguyên lí Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành phức chất màu tím (phản ứng biuret), màu sắc phức chất tỷ lệ với số liên kết peptid (-CO NH-) protein gần không phụ thuộc vào nồng độ tương ứng albumin globulin Sự tạo phức xảy hình 2.1 Cơng thức tạo phức cho thuốc thử biuret vào protein  Hóa chất - Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375g CuSO4.5H2O 8,0571g C4H4NaKO6.4H2O 500ml nước cất, khuấy cho thêm 300ml NaOH 10% Dung dịch khuấy trộn định mức thành 1000ml nước cất LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Pha dung dịch chuẩn BSA: Hòa tan 0,5g BSA vào 50ml nước cất, khuấy đến BSA tan hết định mức lên 100ml nước cất (nồng độ BSA: 10mg/ml)  Tiến hành - Dựng đường chuẩn BSA: Chuẩn bị ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0-5 sau cho dung dịch hóa chất vào ống nghiệm với thể tích thứ tự sau: Ống nghiệm Dung dịch hóa chất BSA chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 Nước cất (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 10 Sau cho đầy đủ hóa chất, ủ ống nghiệm nhiệt độ phòng thời gian 30 phút Sau ủ, dung dịch ống nghiệm đo mật độ quang học bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (Sử dụng ống làm mẫu blank) - Dịch sau thủy phân cần kiểm tra hàm lượng protein: cho 1ml dịch vào ống nghiệm, cho thêm 4ml thuốc thử biuret vào lắc ủ 30 phút nhiệt độ phòng Sau ủ mang mẫu so màu máy so màu bước sóng 570nm Đọc giá trị mật độ quang học dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein mẫu  Kết Dựa vào kết dựng đường chuẩn giá trị mật độ quang học thu để xác định hàm lượng protein có dịch thủy phân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.3 Xác định khả chống oxi hóa dịch thu test kiểm tra khả kiểm soát gốc tự DPPH theo quy trình Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai , Toshiaki Ohshima (2010)  Nguyên lí Dựa vào độ màu gốc tự DPPH có mặt dịch thủy phân DPPH gốc khử, có chất dễ bị oxy hóa, có màu tím đậm, có mặt chất chống oxi hóa, gốc tự DPPH nhận điện tử chuyển thành phân tử DPPH màu tím Như vậy, chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh làm màu dung dịch gốc tự DPPH mạnh  Cách tiến hành Dựng đường chuẩn DPPH: Pha 50 ml DPPH 0,1mM cách cân 0,00197 g - DPPH pha vào 50 ml etanol Chuẩn bị ống nghiệm đánh số thứ tự từ – ứng với nồng độ DPPH sau: Ống 1: ml DPPH + ml nước cất + ml etanol Ống 2: 0,8 ml DPPH + 2,2 ml nước cất + ml etanol Ống 3: 0,6 ml DPPH + 2,4 ml nước cất + ml etanol Ống 4: 0,4 ml DPPH + 2,6 ml nước cất + ml etanol Ống 5: 0,2 ml DPPH + 2,8 ml nước cất + ml etanol - Lấy 1ml DPPH 0,1mM (dung môi cồn 96%) 2ml mẫu ml ethanol vào ống nghiệm, lắc ủ tối nhiệt độ phịng khoảng 30 phút Sau đó, đo mật độ quang mẫu bước sóng 517nm So sánh mật độ quang với ống đựng mẫu trắng (chỉ có 1ml thuốc thử 2ml H2O 1ml ethanol)  Kết :được tính theo cơng thức DPPH (%) = A control – Amẫu (1) A control Trong đó, DPPH (%): khả kiểm sốt gốc tự DPPH Acontrol: mật độ quang ống đựng mẫu trắng Amẫu: mật độ quang ống có mẫu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.4 Xác định hàm lượng peptid acid phương pháp Lowry  Nguyên lý Nồng độ protein xác định với hợp chất màu phenol Folin – Ciocalteu, phản ứng kép tạo phức đồng Phản ứng gồm hai bước: - Cu2+ tạo phức với liên kết peptide protein pH kiềm - Phức hợp protein – Cu2+ phản ứng với dung dịch Folin-phenol: (Na2MoO4 + Na2WoO4 + H3PO4 phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương đậm hấp thụ ánh sáng bước sóng 700nm  Hóa chất  Dung dịch Na2CO3 2% NaOH 0,1N (Dung dịch A)  Dung dịch CuSO4.5H2O 1% (Dung dịch B)  Dung dịch Sodium tartrate 2% (Dung dịch C)  Dung dịch Folin – Cicalteu phenol pha loãng HCl 1N (Dung dịch D)  Pha dung dịch ABC gồm A + B + C với tỷ lệ 100:1:1  Pha dung dịch chuẩn BSA: Hòa tan 0,5g BSA vào 50ml nước cất, khuấy đến BSA tan hết định mức lên 100ml nước cất (nồng độ BSA: 10mg/ml)  Tiến hành - Dựng đường chuẩn BSA: Pha dung dịch BSA (dải từ 0,2 mg/ml – 1mg/ml) với nồng độ khác theo bảng sau: Ống H2 O 0,8 BSA 0,7 0,1 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Đo mật độ quang học bước sóng 750nm - Chuẩn bị mẫu Cho vào ống nghiệm 0,4 ml dịch thủy phân protein (5 – 50µg) + ml hỗn hợp dung dịch ABC pha Trộn ủ nhiệt độ phòng 10 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau đó, cho vào ống nghiệm 0,2 ml dung dịch D vortex giây, đem ủ nhiệt độ phòng 30 phút  Kết Dựa vào kết dựng đường chuẩn giá trị mật độ quang học OD thu để xác định hàm lượng peptid hòa tan Phụ lục 2: Kết xây dựng đường chuẩn Kết xây dựng đường chuẩn BSA theo phương pháp Biuret Mật độ quang học mẫu đường chuẩn Ống Nồng độ BSA (mg/ml) OD570 0 0,12 0,2177 0,3177 0,419 10 0,5164 Phương trình đường chuẩn BIURET: Y=0,0511x + 0,0095 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong đó, x: Hàm lượng BSA (mg/ml) y: OD570 R2= 0,9989 Kết xây dựng đường chuẩn BSA theo phương pháp Lowry Mật độ quang học mẫu đường chuẩn Ống nghiệm Hàm lượng BSA (mg/ml) OD750 0.125 0.503 0.25 0.703 0.375 0.936 0.5 1.168 0.625 1.359 0.75 1.522 0.875 1.712 1.901 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương trình đường chuẩn y=1,5981x + 0,3266, x: Hàm lượng BSA (mg/ml) y: OD750 R2= 0,9971 Kết xây dựng đường chuẩn DPPH Mật độ quang học mẫu đường chuẩn Ống nghiệm Hàm lượng BSA (mg/ml) OD517 0.005 0.051 0.01 0.116 0.015 0.178 0.02 0.245 0.025 0.297 Phương trình đường chuẩn DPPH: Y=0,2448x - 0,0058 Trong đó, x: Nồng độ DPPH (mM) y: OD517 R2= 0,9988 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục 3: Kết so sánh pH công đoạn xử lý nhiệt nguyên liệu Lần lặp Giá trị pH Mẫu khơng gia nhiệt Mẫu có gia nhiệt Lần 7.6 7.58 Lần 7.7 7.65 Lần 7.69 7.6 Lần 7.73 7.73 Lần 7.71 7.6 Lần 7.71 7.58 Kết xử lý ANOVA so sánh pH mẫu không gia nhiệt mẫu có gia nhiệt MẪU KHƠNG GIA NHIỆT Mean Standard Error MẪU GIA NHIỆT 7.69 Mean 0.018797 Standard Error z-Test: Two Sample for Means MẪU KHÔNG GIA NHIỆT Mean 7.69 Known Variance 0.018797 Observations Hypothesized Mean Difference z 0.791606 P(Z |t| -0.40917 5.205492 -0.47736 -6.09202 1 1 0.339072 0.339072 0.339072 0.339072 -1.20672 15.35219 -1.40784 -17.9668 0.2620 < 0.0001 0.1968 < 0.0001 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Đối với hiệu suất khử protein hòa tan Treatment vs vs vs vs 4 Mean Difference Standard Error df -1.54268 15.76351 -0.34063 -17.6468 1 1 0.891007 0.891007 0.891007 0.891007 t for H0 Coeff=0 -1.73139 17.6918 -0.3823 -19.8055 Prob > |t| 0.1216 < 0.0001 0.7122 < 0.0001 Prob > 0,05  Hai mẫu không khác Prob < 0,05  Hai mẫu khác Phụ lục 5: Kết đánh giá ảnh hưởng nhân tố Kết đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân Số Yếu tố TN Hàm lượng protein hòa tan (mg/100g NL) TN X1 (%) X2 (oC) X3 (giờ) Lần Lần Lần 0,1 50 1794.87 1771.77 1771.65 0,5 50 2017.89 2041.42 2069.85 0,1 70 2119.13 2184.47 2178.88 0,5 70 1974.73 2006.45 2076.18 0,1 50 1631.72 1653.43 1689.71 0,5 50 2026.81 2088.30 2068.02 0,1 70 1961.91 1952.48 1920.11 0,5 70 2026.29 2080.68 2036.82 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến nồng độ DPPH bị khử dịch thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng Số Yếu tố TN TN X1 (%) o Nồng độ DPPH bị khử (µM/100g NL) X2 ( C) X3 (giờ) Lần Lần Lần 0,1 50 36.92 36.64 36.76 0,5 50 40.44 40.52 40.44 0,1 70 40.85 40.97 41.09 0,5 70 44.25 44.20 44.29 0,1 50 39.62 39.70 39.70 0,5 50 41.26 41.50 41.59 0,1 70 38.39 38.80 38.80 0,5 70 41.22 40.85 41.26 Kết đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất khử protein lại bã Số Yếu tố TN Hiệu suất khử protein lại bã (%) o TN X1 (%) X2 ( C) X3 (giờ) Lần Lần Lần 0,1 50 69.43 71.52 69.41 0,5 50 70.80 75.78 72.02 0,1 70 69.86 73.13 69.50 0,5 70 78.74 78.55 76.14 0,1 50 78.87 78.85 77.77 0,5 50 83.17 85.88 85.72 0,1 70 80.36 80.85 83.89 0,5 70 76.74 84.67 76.50 Phụ lục 6: Kết đo OD cho mẫu tối ưu Hàm lượng protein Nồng độ DPPH bị khử Hàm lượng peptid hòa tan (OD570) (OD517) axit (OD750) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0.47 0.48 0.46 0.22 0.19 0.21 1.31 1.34 1.35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... thuỷ phân việc bổ sung enzyme Alcalase đến khả thủy phân protein đầu tôm  Đánh giá ảnh hưởng nhân tố đến trình thủy phân protein đầu tơm  Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu hóa trình thủy. .. ảnh hưởng nhân tố đến trình thủy phân protein đầu tôm thẻ chân trắng 33 2.3.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa q trình thủy phân protein enzyme Alcalase đầu tôm thẻ chân trắng 34 2.3.5... Nghĩa cô Th.S Ngơ Thị Hồi Dương, em thực đề tài ? ?Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu q trình thủy phân protein đầu tơm thẻ chân trắng enzyme Alcalase? ?? LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com