NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG Aspergillus oryzae TRONG PHÂN HỦY PHÊ PHỤ LIỆU TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG Aspergillus oryzae TRONG PHÂN HỦY PHẾ PHỤ LIỆU NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn Th.S NGUYỄN NHƯ NHỨT Sinh viên thực NGUYỄN THỊ TRÚC THANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01/2011 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực luận văn, ngồi nổ lực khơng ngừng thân, em nhận nhiều quan tâm, động viên gia đình, thầy bạn bè Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc, em xin gởi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu trường Đại học Tơn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng, Bộ mơn Cơng nghệ sinh học tồn thể q thầy tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập trường Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Như Nhứt trực tiếp hướng dẫn theo sát, động viên, tận tình giúp đỡ em mặt suốt q trình thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Toàn thể anh chị làm việc chi nhánh cơng ty TNHH Gia Tường – Bình Dương, đặc biệt anh chị phịng thí nghiệm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình thực khóa luận Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ người thân gia đình ln bên động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn tốt nghiệp suốt trình học tập đạt kết ngày hôm Tuy cố gắng hoàn thành tốt luận văn tất nổ lực thân, không tránh khỏi sai sót, mong nhận đóng góp từ quý thầy cô bạn bè Một lần em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất q thầy cơ, gia đình bạn bè Sinh viên thực Nguyễn Thị Trúc Thanh i MỤC LỤC Trang Trang tựa Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách hình v Danh sách bảng vi Danh sách biểu đồ vii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA VI NẤM ASPERGILLUS 2.1.1 Vị trí phân loại Aspergillus 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh lý 2.1.3.1 Độ ẩm 2.1.3.2 Nhiệt độ 2.1.3.3 pH 2.1.4 Đặc tính sinh hóa 2.1.4.1 Nguồn dinh dưỡng carbon 2.1.4.2 Nguồn dinh dưỡng nitrogen 2.1.4.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng 2.1.4.4 Các chất sinh trưởng 2.1.5 Khả tổng hợp số enzyme 2.1.5.1 Enzyme cellulase 2.1.5.2 Enzyme amylase 2.1.5.3 Enzyme protease 2.1.5.4 Enzyme pectinase 2.1.5.5 Enzyme phytase 10 2.1.5.6 Enzyme xylanase 11 iii 2.2 SƠ LƯỢC VỀ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG 11 2.2.1 Sơ lược Aspergillus oryzae 11 2.2.2 Một số ứng dụng Aspergillus oryzae 12 2.2.2.1 Sản xuất hợp chất thứ cấp 12 2.2.2.2 Sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học 12 2.2.2.3 Xử lý môi trường 13 2.3 SƠ LƯỢC VỀ PHẾ PHỤ LIỆU 13 2.3.1 Tình hình chung phế phụ liệu nước ta 13 2.3.2 Tận dụng nguồn phế phụ liệu 14 2.3.3 Sơ lược số phế phụ liệu 15 2.3.3.1 Cám gạo 15 2.3.3.2 Bã khoai mì 17 2.3.3.3 Cám mì 17 2.3.3.4 Trấu 18 2.3.3.5 Xơ dừa 18 2.3.3.6 Bã mía 19 2.3.3.7 Mạt cưa, dăm bào 19 2.3.3.8 Bánh dầu đậu phộng 20 2.3.3.9 Bánh dầu đậu nành 20 2.3.3.10 Bã đậu nành 21 2.3.3.11 Bã bia 22 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 24 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 24 3.2 VẬT LIỆU 24 3.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 24 3.2.2 Vật liệu 24 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 24 3.2.4 Môi trường nuôi cấy nấm mốc 24 3.3 PHƯƠNG PHÁP 26 3.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm 26 3.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng cellulose Scharer Kursher 27 iii 3.3.3 Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 27 3.3.4 Phương pháp xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen 28 3.3.5 Phương pháp xác định đạm NH3 29 3.3.6 Xác định đạm amin (NH2) 30 3.3.7 Cấy chuyền giữ giống 30 3.3.8 Phương pháp định tính khả tổng hợp protease, amylase cellulase 31 3.3.9 Xác định bào tử nấm mốc phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu phương pháp Optical Density (OD) 31 3.3.9.1 Phương pháp đếm bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 31 3.3.9.2 Phương pháp đo OD 31 3.3.10 Phương pháp nuôi cấy bán rắn để thu bào tử 32 3.3.11 Phương pháp thu dịch bào tử từ canh trường nuôi cấy 32 3.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.4.1 Phương pháp chọn chủng Aspergillus có khả tổng hợp protease, amylase cellulase cao 32 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần khống lên phát triển khuẩn lạc vịng phân giải Casein, tinh bột, CMC chủng Asp oryzae chọn lọc 33 3.4.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo bào tử chủng Asp oryzae chọn môi trường nuôi cấy bán rắn 33 3.4.3.1 Ảnh hưởng loại chất riêng lẻ 33 3.4.3.2 Ảnh hưởng kết hợp loại chất 33 3.4.3.3 Ảnh hưởng độ ẩm 33 3.4.3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ thành phần chất môi trường nuôi cấy 34 3.4.3.5 Ảnh hưởng bổ sung thể tích hỗn hợp khoáng vi lượng 34 3.4.3.6 Ảnh hưởng nồng độ muối ammonium sulfate 34 3.4.3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả thu nhận chế phẩm bào tử 34 3.4.4 Nuôi cấy tăng sinh thu nhận bào tử cấp hai nấm Aspergillus môi trường bán rắn 35 iii 3.4.5 Phương pháp đánh giá sơ hiệu phân hủy phế phụ liệu chế phẩm bào tử cấp hai 35 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 4.1 KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC ENZYME PROTEASE, AMYLASE VÀ CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG ASP ORYZAE 37 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN KHOÁNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA KHUẨN LẠC VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE, AMYLASE VÀ CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG ASPERGILLUS CHỌN LỌC 41 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG TẠO BÀO TỬ CỦA CHỦNG CHỌN LỌC 47 4.3.1 Ảnh hưởng loại chất riêng lẻ 47 4.3.2 Ảnh hưởng kết hợp loại chất 48 4.3.3 Ảnh hưởng độ ẩm 50 4.3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ loại chất môi trường nuôi cấy 51 4.3.5 Ảnh hưởng bổ sung thể tích hỗn hợp khống vi lượng 53 4.3.6 Ảnh hưởng nồng độ muối ammonium sulfate 54 4.3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 56 4.4 NUÔI CẤY THU NHẬN CHẾ PHẨM BÀO TỬ CẤP HAI CỦA CHỦNG A18 VÀ A35 58 4.5 BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM 59 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 5.1 KẾT LUẬN 64 5.2 ĐỀ NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BKM : Bã khoai mì CG : Cám gạo CM : Cám mì TR : Trấu BM : Bã mía XD : Xơ dừa BĐN : Bã đậu nành PGA : Potato Glucose Agar VPG : Vòng phân giải ĐC : Đối chứng A18 : Aspergillus A18 A19 : Aspergillus A19 A24 : Aspergillus A24 A26 : Aspergillus A26 A35 : Aspergillus A35 MT : Môi trường CMC : Carbon Methyl Cellulose  OD : ODt – OD0 iv DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần cám gạo .16 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng cám mì 17 Bảng 2.3 Thành phần bánh dầu đậu phộng 20 Bảng 2.4 Thành phần bánh dầu đậu nành 21 Bảng 2.5 Thành phần bã đậu nành 22 Bảng 2.6 Thành phần bã bia tươi lên men từ mạch nha gạo ngô 22 Bảng 3.1 Các giống Aspergillus dùng thí nghiệm 24 Bảng 4.1 Đường kính khuẩn lạc vịng phân giải Casein chủng Asp oryzae sau 72 ủ môi trường Czapek 37 Bảng 4.2 Đường kính khuẩn lạc vòng phân giải tinh bột chủng Asp oryzae sau 72 ủ môi trường Czapek 38 Bảng 4.3 Đường kính khuẩn lạc vịng phân giải CMC chủng Asp oryzae sau 72 ủ môi trường Czapek 39 Bảng 4.4 Đường kính khuẩn lạc vịng phân giải chất chủng A18 sau 72 ủ mơi trường khống khác 41 Bảng 4.5 Đường kính khuẩn lạc vòng phân giải chất chủng A35 sau 72 ủ môi trường khoáng khác 44 Bảng 4.6 Ảnh hưởng loại chất riêng lẻ lên tạo thành bào tử chủng Asp oryzae chọn lọc 47 Bảng 4.7 Ảnh hưởng kết hợp loại chất lên tạo thành bào tử chủng A18 A35 .49 Bảng 4.8 Ảnh hưởng độ ẩm lên tạo thành bào tử củachủng A18 A35 50 Bảng 4.9 Ảnh hưởng tỷ lệ chất lên tạo thành bào tử chủng A18 A35 52 Bảng 4.10 Ảnh hưởng thể tích hỗn hợp khống MT4 lên tạo thành bào tử chủng A18 A35 .53 Bảng 4.11 Ảnh hưởng hỗn hợp khống có bổ sung muối ammonium sulfate với nồng độ khác lên khả tạo bào tử chủng A18 A35 55 Bảng 4.12 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tạo bào tử chủng A18 A35 57 Bảng 4.13 Lượng bào tử có chế phẩm cấp cấp chủng A18 A35 58 vi Bảng 4.14 Khối lượng khối phế liệu rau củ sau ngày ủ với chế phẩm sinh học 60 Bảng 4.15 Hàm lượng cellulose phế liệu rau củ trước sau ủ .61 Bảng 4.16 Hàm lượng loại đạm có phế phụ liệu sau ủ với chế phẩm cấp chủng A18 A35 63 vi DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Đường kính khuẩn lạc vòng phân giải Casein chủng Aspergillus 38 Biểu đồ 4.2 Đường kính khuẩn lạc vịng phân giải tinh bột chủng Aspergillus 38 Biểu đồ 4.3 Đường kính khuẩn lạc vịng phân giải CMC chủng Aspergillus 39 Biểu đồ 4.4 Đường kính khuẩn lạc chủng A18 mơi trường khống khác 42 Biểu đồ 4.5 Đường kính vịng phân giải chủng A18 mơi trường khống khác 42 Biểu đồ 4.6 Đường kính khuẩn lạc chủng A35 mơi trường khống khác 45 Biểu đồ 4.7 Đường kính vịng phân giải chủng A35 mơi trường khống khác 45 Biểu đồ 4.8 Lượng bào tử tạo thành chất riêng lẻ chủng A18 A35 48 Biểu đồ 4.9 Lượng bào tử thu mơi trường có kết hợp chất khác chủng A18 A35 50 Biểu đồ 4.10 Ảnh hưởng độ ẩm lên tạo thành bào tử chủng A18 A35 51 Biểu đồ 4.11 Ảnh hưởng tỷ lệ chất lên khả tạo thành bào tử chủng A18 A35 52 Biểu đồ 4.12 Lượng bào tử tạo thành với mơi trường ni cấy tích khống bổ sung khác chủng A18 A35 54 Biểu đồ 4.13 Lượng bào tử tạo thành với hỗn hợp khống có bổ sung muối ammonium sulfate với nồng độ khác chủng A18 A35 55 Biểu đồ 4.14 Lượng bào tử có chế phẩm cấp cấp hai chủng A18 A35 nuôi cấy môi trường chọn lọc 57 vii Phụ lục 4.12 Mật độ bào tử cấp chủng A18 A35 Chủng A18 A35 Dịch huyền phù (ml) 300 300 300 300 300 300 300 300 Pha loãng (lần) 17 17 17 17 17 17 17 17 OD trung bình 0,451 0,477 0,462 0,458 0,469 0,473 0,443 0,484 300 300 300 300 300 300 300 300 16 16 16 16 16 16 16 16 0,454 0,463 0,475 0,458 0,477 0,449 0,468 0,482 logN 6,95 7,00 6,97 6,96 6,98 6,98 6,93 7,00 6,80 6,82 6,83 6,81 6,83 6,80 6,82 6,84 Mật độ (*109 bào tử/erlen) 44,97 50,07 47,06 46,29 48,44 49,25 43,50 51,54 47,64 30,63 31,41 32,48 30,98 32,66 30,21 31,85 33,12 31,67 Phụ lục 4.13 Mật độ bào tử cấp chủng A18 A35 Chủng A18 A35 Dịch huyền phù (ml) 300 300 300 300 300 300 300 300 Pha loãng (lần) 20 20 20 20 20 20 20 20 OD trung bình 0,496 0,489 0,488 0,489 0,498 0,497 0,483 0,487 300 300 300 300 300 300 300 300 20 20 20 20 20 20 20 20 0,487 0,496 0,491 0,491 0,489 0,490 0,488 0,493 logN 7,03 7,01 7,00 7,01 7,03 7,03 7,00 7,01 6,84 6,86 6,85 6,85 6,84 6,84 6,85 6,85 Mật độ (*109 bào tử/erlen) 63,73 61,91 61,65 61,91 64,26 63,99 60,39 61,40 62,40 41,99 43,05 42,46 42,46 42,22 42,34 42,10 42,69 42,41 PHỤ LỤC 5: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM A18 A19 A24 A26 A35 Hình phụ lục 5.1 Khuẩn lạc chủng Aspergillus dùng nghiên cứu môi trường PGA sau ngày nuôi cấy A18 A19 A24 A26 A35 Hình phụ lục 5.2 Vịng phân giải Casein mơi trường Czapek chủng Asp oryzae sau ngày nuôi cấy A18 A19 A24 A26 A35 Hình phụ lục 5.3 Vịng phân giải tinh bột môi trường Czapek chủng Asp oryzae sau ngày nuôi cấy A18 A19 A24 A26 A35 Hình phụ lục 5.4 Vịng phân giải CMC môi trường Czapek chủng Asp oryzae sau ngày nuôi cấy MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Hình phụ lục 5.5 Vịng phân giải Casein mơi trường khống chủng A18 sau ngày nuôi cấy MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Hình phụ lục 5.6 Vịng phân giải Casein mơi trường khống chủng A35 sau ngày nuôi cấy MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Hình phụ lục 5.7 Vịng phân giải tinh bột mơi trường khống chủng A18 sau ngày nuôi cấy MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Hình phụ lục 5.8 Vịng phân giải tinh bột mơi trường khống chủng A35 sau ngày nuôi cấy MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Hình phụ lục 5.9 Vịng phân giải CMC mơi trường khống chủng A18 sau ngày nuôi cấy MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Hình phụ lục 5.10 Vịng phân giải CMC mơi trường khống chủng A35 sau ngày nuôi cấy Đối chứng 1‰ 2,5‰ 5‰ 7,5‰ 10‰ Hình phụ lục 5.11 Phế liệu rau củ sau ủ ngày với chế phẩm từ chủng A18 tỷ lệ khác Đối chứng 1‰ 2,5‰ 5‰ 7,5‰ 10‰ Hình phụ lục 5.12 Phế liệu rau củ sau ủ ngày với chế phẩm từ chủng A35 tỷ lệ khác Biofert UPC (4‰) Biofert M (3‰) Biofert Mx (0,3‰) Hình phụ lục 5.13 Phế liệu rau củ sau ủ ngày với chế phẩm sinh học PHỤ LỤC 6: MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU Nhà sản Thành phần Chế phẩm sinh học Tỷ lệ sử dụng xuất VSV Số lượng Chế phẩm bào tử cấp chủng Asp oryzae A18 Chế phẩm bào tử cấp chủng Asp oryzae A35 Bacillus sp Biofert UPC Biofert M Biofert Mx 3,1*109 (bào tử/g) 2,1*109 (bào tử/g) ≥ 1,9*109 (CFU/ml) Lactobacilus ≥ 1,0*107 sp (CFU/ml) Trichoderma ≥ 1,5*109 sp (CFU/g) Trichoderma ≥ 2,0*1010 sp (CFU/g) 4,0 – 5,0‰ Công ty TNHH 3,0‰ Gia Tường 0,3‰ (CFU: Colony forming unit; khuẩn lạc) PHỤ LỤC 7: BẢNG KẾT QUẢ PHÂN TÍCH AFLOTOXIN CỦA CHỦNG A18 VÀ A35 ... Thanh Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Như Nhứt khả tổng hợp enzyme khác Các hệ enzyme mà Aspergillus tổng hợp gồm có: - Hệ enzyme phân giải tinh bột, - Hệ enzyme phân giải cellulose, -. .. bột, - Hệ enzyme phân giải cellulose, - Hệ enzyme phân giải protein, - Hệ enzyme phân giải pectin, - Hệ enzyme phân giải xylan, - Hệ enzyme phân giải phytate 2.1.5.1 Enzyme cellulase[3], [4], [10]... lần, lần 30 phút trọng lượng khơng đổi Cân xác 1-2 g mẫu cho vào chén sấy sấy đến trọng lượng khơng đổi đem sấy giống chén sấy Tính kết Độ ẩm = m-(m1-m0) m 100 m (%) Trong đó: m :lượng mẫu đem