kl dang ngoc tu 912104s

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐƠNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ************ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH PROTOCORM-LIKE BODIES GIỐNG LAN RENANTANDA “RED NUMBER ONE” Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS HÀ THỊ LOAN ĐẶNG NGỌC TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:  Ban giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng Bộ môn Công Nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trường  Thạc sĩ Hà Thị Loan , người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em thực hiện khóa luận này  Anh Nguyễn Phúc Trường, người trực tiếp hướng dẫn, dạy động viên em hồn cảnh khó khăn Đề tài hồn thành với nhiều nhiệt tình tâm huyết anh  Em cảm ơn anh Quân , chị Vi, chị Thảo và các anh chị phòng Công nghệ sinh học Thực vật , thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP HCM Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị suốt thời gian em thực tập  Cảm ơn lớp 09sh thân yêu và các bạn thân đã cùng chia sẻ tất cả những nỗi buồn vui suốt bốn năm đại học  Và hết, cảm ơn bố mẹ, em trai yêu quý đã chăm lo , ủng hộ, tin tưởng , cảm ơn cả nhà vì đã cho chỗ dựa vững chắc nhất cuộc sống Tháng 12/2009 Đặng Ngọc Tú ii TÓM TẮT Đặng Ngọc Tú, Đại học Tôn Đức Thắng TP.HCM, tháng 12/2009 “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH PROTOCORM-LIKE BODIES GIỐNG LAN RENANTANDA “RED NUMBER ONE”” Giáo viên hướng dẫn: Thạc sĩ Hà Thị Loan Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học Thực vật – Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện từ tháng đến tháng 12 năm 2009 Cùng với phát triển kinh tế-xã hội, nhu cầu hoa lan, kiểng trang trí để phục vụ hội nghị, đám tiệc, cưới hỏi, sinh nhật… nhu cầu giải trí khác ngày nhiều thành phố khơng có khả đáp ứng đủ nhu cầu phục vụ nên có lượng hoa lan lớn phải nhập từ nước ngoài, đa phần từ Thái Lan Để phát triển ngành trồng hoa lan, trước mắt cần phải chủ động nguồn giống, nhập giống, lai tạo số giống có chất lượng cao để cung cấp cho thị trường nước sau hướng tới xuất sang thị trường khác Ngồi ra, kỹ thuật nhân nhanh ni cấy mơ công cụ đắc lực để giúp có đủ giống thời gian ngắn Từ những nhu c ầu cần thiết, chúng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả nhân nhanh protocorm -like bodies giống lan Renantanda “red number one”” Kết quả đạt được sau các thí nghiệm:  Môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh PLBs của giống lan Renantanda “red number one” là môi trường khoáng bản MS có bổ sung nồng độ BA mg/l và nồng độ NAA 0,1 mg/l Ngoài ra, có thể tạo chồi cho giống lan này bằng cách sử dụng môi trường khoáng bản MS mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng  Qua phương pháp ni cấy hệ thống ngập chìm tạm thời mơi trường có agar, chúng tơi nhận thấy: hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã hội đủ những điều kiện cần thiết cho việc nhân nhanh PLBs cách tối ưu, thời gian ngập không quá lâu , thoáng khí tớt giúp PLB s bị thủy tinh thể , tăng cường khả iii quang hợp nên PLBs phát triển khá đều đặn, trọng lượng tăng nhanh, số PLBs và số chồi tạo được nhiều so với nuôi cấy môi trường agar iv MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ii Tóm tắt luận văn iii Mục lục v Danh mục chữ viết tắt viii Danh sách các chất và môi trường thí nghiệm viết tắt ix Danh mục bảng x Danh mục hình xi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Mục tiêu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô .3 2.1.1 Lịch sử thành tựu đạt nuôi cấy in vitro 2.1.2 Đặc điểm kỹ thuật nuôi cấy in vitro 2.1.2.1 Ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy in vitro 2.1.2.2 Tầm quan trọng 2.1.2.3 Ý nghĩa 2.1.3 Các phương pháp nuôi cấy mô hiện 2.1.3.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật giá thể agar 2.1.3.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật môi trường lỏ ng 2.1.3.3 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 2.1.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 12 2.1.4.1 Khoáng đa lượng 12 2.1.4.2 Khoáng vi lượng .13 2.1.4.3 Vitamin .13 2.1.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng vai trò chúng vi nhân giống 13 2.1.4.5 Ảnh hưởng pH 16 v 2.1.4.6 Carbon nguồn lượng 17 2.1.4.7 Các hợp chất hữu bổ sung không xác định 18 2.1.4.8 Amino acid nguồn cung cấp Nitrogen khác 19 2.1.4.9 Than hoạt tính 19 2.1.4.10 Yếu tố làm đặc môi trường .19 2.2 Giới thiệu về giống lan Renanthera Renantanda “red number one” 20 2.2.1 Sơ lược về giống lan Renanthera 20 2.2.2 Một số giống lan Renanthera .21 2.3 Tình hình nhân giống lan Renantanda 29 2.3.1 Nhân giống tự nhiên 29 2.3.1.1 Phương pháp tách chiết 29 2.3.1.2 Sự nảy mầm hạt 29 2.3.2 Phương pháp in-vitro 29 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 30 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 30 3.2 Nội dung nghiên cứu 30 3.3 Vật liệu thí nghiệm .30 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 30 3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 31 3.3.2.1 Phịng chuẩn bị mơi trường 31 3.3.2.2 Phòng cấy 31 3.3.2.3 Phòng tăng trưởng 31 3.3.3 Hóa chất mơi trường thí nghiệm 32 3.3.4 Điều kiện nuôi cấy .33 3.4 Bố trí thí nghiệm 33 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên khả nhân nhanh protocorm-like bodies (PLBs) 33 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả nhân nhanh PLBs môi trường nuôi cấy agar và hệ thống ngập chìm tạm thời .34 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .37 vi 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điề u hòa sinh trưởng lên khả nhân nhanh PLBs .37 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả nhân nhanh PLBs môi trường nuôi cấy agar và hệ thống ngập chìm tạm thời 42 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ctv Cộng tác viên CV Coefficient of Variation g Gram LSD Sai số nhỏ L Lít mg Miligram ml Mililít ns Khác biệt khơng có ý nghĩa PLBs Protocorm-like bodies TTCNSH Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh viii DANH MỤC CÁC CHẤT VÀ MƠI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM VIẾT TẮT BA 6-benzyl aminopurine CW Nước dừa (Coconut water) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid IBA β –indole butyric acid MS Murashige – Skoog, 1962 NAA α-naphthaleneacetic acid Suc Đường sucrose ix DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng việc thay đổi nồng độ chất điều hòa sinh trư ởng BA NAA, kết hợp với nồng độ cố định nước dừa, sucrose lên tăng sinh PLBs Bảng 3.2 Khả nhân nhanh PLBs nuôi cấy hệ thớng ni cấy ngập ch ìm tạm thời và môi trường agar ở các thể tích nuôi cấy 200ml và 250ml Bảng 4.1 Kết quả của thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất điều h òa sinh trưởng BA và NAA đến khả nhân nhanh PLBs Bảng 4.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát khả nhân nhanh PLBs hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời và môi trường agar ở các thể tích 200 ml và 250 ml x Hình 4.11: PLBs thu nhận được ở nghiệm thức nuôi cấy hệ thống ngập chìm tạm thời với môi trường khoáng bản MS có bổ sung BA 1mg/l NAA 0,1mg/l ở thể tích 250ml 47 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tháng ến ti hành khảo sát khả nhân nhanh PLB s giống lan Rennantanda “red number one”, tổng hợp các ghi nhận và phân tích , xin có rút các kết luận sau: Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh protocorm-like bodies (PLBs) kết nhận thấy: Môi trường MS có bổ sung nồng độ BA 1mg/l NAA 0,1mg/l cho số PLBs cao là 231,8 PLBs Ngoài thí nghiệm cho thấy, mơi trường MS khơng bổ sung BA NAA có khả tạo chồi nhiều từ PLBs Các môi trường lại tạo PLB s (117,7 - 156,2 PLBs) tạo chồi (18,83 – 34,33 PLBs) thấp Thí nghiệm 2: Khảo sát khả nhân nhanh PLB s môi trường nuôi cấy agar và hệ thống ngập chìm tạm thời , nhận thấy thời gian ni cấy hệ thống ngập chìm tạm thời cho số PLBs (543,7 – 692,5 PLBs), chồi (133,5 – 150,5 PLBs) cao so với PLBs (189,3 – 260,0 PLBs) và chồi (31,33 – 41,27 chồi) thu được nuôi cấy môi trường thạch Và thể tích 250ml hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời số PLBs (692,5 PLBs) số chồi (150,5 chời) thu cao 5.2 Đề nghị Vì thời gian làm đề tài có hạn nên chúng tơi thực tháng, đề nghị Trung Tâm tiếp tục khảo sát giai đoạn nuôi cấy tạo hồn chỉnh khả sinh trưởng mơ vườn ươm Nhân rộng mơ hình ni cấy hệ thống ngập chìm tạm thời với giống lan có nhu cầu phát triển cao để giảm thời gian nhân giống thời gian sản xuất, đồng thời hạ giá thành cho sản phẩm Nghiên cứu và tìm hiểu thiết kế hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời để có thể chế tạo hệ thống từ các vật liệu nước nhằm giảm giá thành của hệ thống này 48 PHỤ LỤC Hình 4.12 PLBs thu được ở nghiệm thức nuôi cấy môi trường khoáng bản MS không bổ sung BA NAA sau 2,5 tháng ni cấy Hình 4.13 PLBs thu được ở nghiệm thức nuôi cấy môi trường khoáng bản MS bổ sung BA mg/ l NAA 0,5 mg/l sau 2,5 tháng ni cấy Hình 4.14 PLBs thu được ở nghiệm thức nuôi cấy môi trường khoáng bản MS bổ sung BA mg/ l NAA 0,1 mg/l sau 2,5 tháng nuôi cấy Hình 4.15 PLBs thu được ở nghiệm thức nuôi cấy môi trường khoáng bản MS bổ sung BA mg/ l NAA 0,5 mg/l sau 2,5 tháng ni cấy Hình 4.16: PLBs thu nhận được ở nghiệm thức nuôi cấy hệ thống ngập chìm tạm thời với môi trường khoáng bản MS có bổ sung BA 1mg/l NAA 0,1mg/l ở thể tích 200ml Hình 4.17: PLBs thu nhận được ở nghiệm thức nuôi cấy agar với môi trường khoáng bản MS có bổ sung BA 1mg/l NAA 0,1mg/l ở thể tích 250ml Hình 4.18: PLBs thu nhận được ở nghiệm thức nuôi cấy agar với môi trường khoáng bản MS có bổ sung BA 1mg/l NAA 0,1mg/l ở thể tích 200ml PHỤ LỤC Bảng 2.1 Bảng số liệu thí nghiệm Nghiệm thức Số lần lặp lại Trọng lượng Số lượng Số lượng tươi (g) PLBs chồi I 14,105 163,0 34,0 II 14,845 156,0 39,5 III 15,535 149,5 56,0 I 13,230 210,0 20,0 II 12,745 229,5 15,5 III 15,900 256,0 21,0 I 7,870 121,0 19,0 II 8,585 147,0 25,0 III 11,860 164,5 30,5 I 6,950 132,5 28,0 II 8,670 128,5 21,5 III 8,625 119,5 35,5 I 6,740 119,0 31,5 II 8,230 121,0 40,5 III 8,295 113,0 31,0 Bảng 2.2 Bảng số liệu thí nghiệm Nghiệm thức Số lần lặp lại Trọng lượng Số lượng Số lượng tươi (g) PLBs chồi I 57,08 819,25 257,70 II 45,72 569,34 97,03 III 43,39 689,00 96,72 I 42,22 638,67 171,18 II 46,82 418,96 124,06 III 38,55 573,52 105,10 I 21,69 239,49 41,91 II 20,03 254,89 33,87 III 23,28 285,62 48,02 I 15,38 189,00 40,00 II 14,87 203,00 28,00 III 15,68 176,00 26,00 PHỤ LỤC 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh protocorm-like bodies (PLBs) 3.1.1 Phân tích trọng lượng tươi: 3.1.1.1 Bảng phân tích ANOVA Function: ANOVA-1 Data case no to 15 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable 2: TRONG LUONG TUOI ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 10 135.383 33.846 17.536 1.754 19.300 0.0001 Total 14 152.919 Coefficient of Variation = 12.28% 3.1.1.2 Bảng trắc nghiệm LSD Error Mean Square = 1.754 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.427 Original Order at alpha = 0.010 Ranked Order Mean 1= 14.83 A Mean 1= 14.83 A Mean 2= 13.96 A Mean 2= 13.96 A Mean 3= 9.300 B Mean 3= 9.300 B Mean 4= 8.080 B Mean 4= 8.080 B Mean 5= 7.760 B Mean 5= 7.760 B 3.1.2 Phân tích số lượng PLBs: 3.1.2.1 Bảng phân tích ANOVA Function: ANOVA-1 Data case no to 15 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable 3: PLBs ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 10 24626.000 6156.500 2238.833 223.883 27.499 0.0000 Total 14 26864.833 Coefficient of Variation = 9.63% 3.1.2.2 Bảng trắc nghiệm phân hạng LSD Error Mean Square = 223.9 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 38.72 Original Order at alpha = 0.010 Ranked Order Mean 1= 156.2 B Mean 2= 231.8 A Mean 2= 231.8 A Mean 1= 156.2 B Mean 3= 144.2 B Mean 3= 144.2 B Mean 4= 126.8 B Mean 4= 126.8 B Mean 5= 117.7 B Mean 5= 117.7 B 3.1.3 Phân tích số lượng chồi: 3.1.3.1 Bảng phân tích ANOVA Function: ANOVA-1 Data case no to 15 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable 4: CHOI ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 10 1038.767 259.692 500.833 50.083 5.185 0.0159 Total 14 1539.600 Coefficient of Variation = 23.67% 3.1.3.2 Bảng trắc nghiệm phân hạng LSD Error Mean Square = 50.08 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 12.87 Original Order at alpha = 0.050 Ranked Order Mean 1= 43.17 A Mean 1= 43.17 A Mean 2= 18.83 Mean 5= 34.33 AB Mean 3= 24.83 BC Mean 4= 28.33 BC Mean 4= 28.33 BC Mean 3= 24.83 BC Mean 5= 34.33 AB Mean 2= 18.83 C C 3.2 Thí nghiệm : Khảo sát khả nhân nhanh PLB s môi trường nuôi cấy agar và hệ thống ngập chìm tạm thời 3.2.1 Phân tích trọng lượng tươi: 3.2.1.1 Bảng phân tích ANOVA Function: ANOVA-1 Data case no to 12 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable 2: TRONG LUONG TUOI ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 2328.281 776.094 147.256 42.163 0.0000 18.407 Total 11 2475.537 Coefficient of Variation = 13.38% 3.2.1.2 Bảng trắc nghiệm phân hạng LSD Error Mean Square = 18.41 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 11.75 Original Order at alpha = 0.010 Ranked Order Mean 1= 48.73 A Mean 1= 48.73 A Mean 2= 42.53 A Mean 2= 42.53 A Mean 3= 21.67 B Mean 3= 21.67 B Mean 4= 15.31 B Mean 4= 15.31 B 3.2.2 Phân tích số lượng PLBs: 3.2.2.1 Bảng phân tích ANOVA Function: ANOVA-1 Data case no to 12 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable 3: PLBs ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 505133.238 168377.746 58182.612 7272.826 23.152 0.0003 Total 11 563315.849 Coefficient of Variation = 20.24% 3.2.2.2 Bảng trắc nghiệm phân hạng LSD Error Mean Square = 7273 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 233.6 Original Order at alpha = 0.010 Ranked Order Mean 1= 692.5 A Mean 1= 692.5 A Mean 2= 543.7 A Mean 2= 543.7 A Mean 3= 260.0 B Mean 3= 260.0 B Mean 4= 189.3 B Mean 4= 189.3 B 3.2.3 Phân tích số lượng chời: 3.2.3.1 Bảng phân tích ANOVA Function: ANOVA-1 Data case no to 12 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable 4: CHOI ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between Within 34079.146 19773.590 11359.715 4.596 0.0376 2471.699 Total 11 53852.736 Coefficient of Variation = 55.78% 3.2.3.2 Bảng trắc nghiệm phân hạng LSD Error Mean Square = 2472 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 93.61 Original Order at alpha = 0.050 Ranked Order Mean 1= 150.5 A Mean 2= 133.5 AB Mean 2= 133.5 AB Mean 3= 41.27 BC Mean 3= 41.27 BC Mean 4= 31.33 C Mean Mean 1= 4= 150.5 A 31.33 C TÀI LIỆU THAM KHẢO Dương Công Kiên, 2002 Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại Học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trần Hợp, 2000 Phong lan Việt Nam Nhà xuất Văn hóa Dân tộc Nguyễn Đức Lượng , Lê Thị Thủy Tiên , 2002 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Cung Hoàng Phi Phượng , 2006 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời nhân giống lan Hồ Điệp lai (Phalaenopsis hybrid) Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM Nguyễn Văn Uyển, 1996 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất Nông nghiệp, tập 1, Bùi Trang Việt, 2000 Sinh lý thực vật đại cương Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Hợi Nghị Khoa Học , 2007 Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa Nhà xuất bản Nông nghiệp E F Geogre, D J M Puttock & H J Geogre Plant culture media, Volume 1, Formultion and uses http://www.hcmbiotech.com.vn/home.php 10 http://en.wikipedia.org/wiki/Renantanda 11 http://www.hoalanvietnam.org/ 12 http://www.rhs.org.uk/plants/registerpages/orchiddetails.asp?ID=70422 13 http://www.1888orchids.com/Red_Renanthera_Orchids_in_Elegant_Glass_Vase_ p/t888018.htm 49 ... tía Tuy nhiên, vài chất thị gây độc cho mẫu cấy (Roscoe Bell, 1981) (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên – 2006) 2.1.4.6 Carbon nguồn lượng Thực vật thu nhận nguồn lượng từ trình quang hợp Tuy... sucrose 30 g/l, agar g/l, pH 5,7 – 5,8) Sau khoảng 8-10 tu? ??n nuôi cấy, phôi tiếp tục phát triển thành cấu trúc hình cầu màu xanh đậm (PLBs) Sau 12 tu? ??n PLBs tách cấy chuyền sang môi trường tăng sinh... ni cấy chồi Ơng thành công việc chuyển non sen cạn white -lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu Tuy nhiên, việc nhân giống chưa hồn thiện Sau nhiều nhà nghiên cứu khám phá thành phần dinh dưỡng