Bài viết Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225 đánh giá biểu hiện của gen đích và thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 của giống lúa chủ lực TBR225.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 9: 1220-1229 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(9): 1220-1229 www.vnua.edu.vn Ngô Thị Vân Anh1, Nguyễn Anh Minh2, Phạm Thu Hằng2, Phạm Phương Ngọc2, Lê Quỳnh Mai3, Phạm Xuân Hội2, Nguyễn Duy Phương2* Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Di truyền Nông nghiệp Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Tác giả liên hệ: phuongnd.bio@gmail.com Ngày nhận bài: 06.08.2022 Ngày chấp nhận đăng: 27.09.2022 TĨM TẮT Cadmium (Cd) có độc tính cao hầu hết sinh vật sống, bao gồm người Lúa gạo chứa hàm lượng Cd vượt ngưỡng (0,2 mg/kg - QCVN 8- 2:2011/BYT) nguyên nhân gây ngộ độc Cd OsNRAMP5 thuộc họ NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) xác định có liên quan tới q trình vận chuyển nhiều kim loại sắt (Fe), kẽm (Zn), đồng (Cu), mangan (Mn) Cd lúa Để phục vụ nghiên cứu chức OsNRAMP5, đánh giá biểu gen đích thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 giống lúa chủ lực TBR225 Bằng phương pháp xử lý nhân tạo dung dịch trồng thủy sinh có bổ sung Cd, OsNRAMP5 chứng minh tăng cường biểu mô rễ lúa TBR225 Một phần trình tự chứa ExonI OsNRAMP5 dài 0,29kb phân lập để phục vụ thiết kế sgRNA (single guide RNA) cho hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 Cấu trúc biểu sgRNA mang hai trình tự crRNA (CRISPR RNA) nhận biết ExonI OsNRAMP5 ghép nối vào vector nhị thể pCas9 Vector tái tổ hợp kiểm tra PCR giải trình tự Nu Kết nghiên cứu tiền đề cho cải tiến chất lượng giống lúa chủ lực TBR225 cơng nghệ chỉnh sửa hệ gen Từ khóa: Bất hoạt gen, Cadmium, CRISPR/Cas9, OsNRAMP5, TBR225 Designing CRISPR/CAS9 System for Knocking out OsNRAMP5 Related to Cadmium Accumulation in Rice Variety TBR225 ABSTRACT Cadmium (Cd) is highly toxic to most living organisms, including humans Rice with excessive Cd (> 0,2 mg/kg QCVN 8-2:2011/BYT) is one of the leading causes of Cd poisoning, threatening human health Several genes belonging to the NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) family are related to metal accumulation in plants; in which OsNRAMP5 has been identified to be involved in the transport of various metals such as iron (Fe), zinc (Zn), copper (Cu), manganese) Mn and Cd in rice In order to identify the function of OsNRAMP5 in elite rice variety TBR225, we evaluated the expression of the targeted gene and designed Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9 (CRISPR/Cas9) system for editing TBR225 OsNRAMP5 The increase of OsNRAMP5 expression was observed in the root tissues of TBR225 rice plant in the Cd-treatment experiment using hydroponic culture A sequence containing the ExonI region of OsNRAMP5 with a size of 0.29kb was isolated from the total DNA of TBR225 to design single guide RNAs (sgRNA) for OsNRAMP5editing CRISPR/Cas9 system The sgRNA expression construct carrying two CRISPR RNA (crRNA) sequences recognizing two different sites on the ExonI of OsNRAMP5 was ligated into the binary vector pCas9 The recombinant vector was validated by PCR and sequencing analysis The results serve as basis for the improvement of TBR225 rice variety with high quality by using genome editing technology Keywords: Cadmium, CRISPR/Cas9, Knocking out gene, OsNRAMP5, TBR225 1220 Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương - - 1221 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ µl µ Tên Trình tự NRAMP5-F GGTGTGGCTTGAGAGTTCGT NRAMP5-R CATGGTGACAGTGGAGTGCT NRAMP5-RT-F CAGCAGCAGTAAGAGCAAGATG NRAMP5-RT-R GTGCTCAGGAAGTACATGTTGAT Actin-F TGATGGTGTCAGCCACACT Actin-R TGGTCTTGGCAGTCTCCATT attL-F GTACAAAAAAGCAGGCT attL-R GTACAAGAAAGCTGGGT BtgZI-crRNA1-F TGTT[GCATCAGCTGGAGAGCTAGTG] BtgZI-crRNA1-R AAAC[CACTAGCTCTCCAGCTGATGC] BsaI-crRNA2-F GTGT[GATGATCAGCTGCTAATGA] BsaI-crRNA2-R AAAC[TCATTAGCAGCTGATCATC] Ubi-F Cas9-t-R CCCTGCCTTCATACGCTATT GCCTCGGCTGTCTCGCCA Hpt-F AAGGAGGTGATCCAGCC Hpt-R GAGTTTGATCCTGGCTCAG 1222 Gen đích OsNRAMP5 [12] Mục đích thí nghiệm Kích thước (bp) Phân lập NRAMP5-TBR 286 RT-PCR 111 OsActin [12] RT-PCR 230 pENTR4-V2 PCR vector tái tổ hợp 995 crRNA1-OsNRAMP5 Thiết kế vector 21 crRNA2-OsNRAMP5 pCas9 21 PCR vector tái tổ hợp 350 821 Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương µ µ µ µ µ µ ° ° ° ∞ 1223 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 1224 Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương – - 1225 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 Kích thước (bp) TSL DSL TBP CBP IBP % GC On-score sgRNA-1 Tên GATGATCAGCTGCTAATGA Trình tự crRNA (5’-3’) 19 - 12 40% 0,7456 sgRNA-2 GAGAGAGAGCAGTGAGAGA 19 - 11 55% 0,0912 sgRNA-3 GAGAGAGAGAGCAGTGAGAG 20 - 55% 0,1913 sgRNA-4 GTGAGAGAGGGAGCATCAGC 20 - 11 60% 0,1012 sgRNA-5 GCATCAGCTGGAGAGCTAGTG 21 SL1 10 55% 0,3903 sgRNA-6 GAGAGAGAGAGCAGTGAGAGA 21 - 55% 0,1913 sgRNA-7 GATCATCTGCGTCGAGCTTCT 21 - 11 55% 0,0323 sgRNA-8 GCAGATGATCAGCTGCTAATGA 22 - 13 45% 0,2272 Tên Trình tự đoạn DNA tương đồng crRNA hệ gen lúa Vị trí Khoảng cách (bp)* sgRNA-1 GATGATC[AGCTGCTAATGA] E OsNRAMP5 GATGAGG[AGCTGCTGATGA] E Os02g0611200 AATAATC[AGCTGCTAATCA] - 6907 Os11g0508301 GCATCAGCT[GGAGAGCTAGTG] E sgRNA-5 - 1226 Gen đích/Mã số OsNRAMP5 Ngơ Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương 1227 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 → › µ 1228 ... Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương - - 1221 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ µl µ Tên Trình tự NRAMP5-F... Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương µ µ µ µ µ µ ° ° ° ∞ 1223 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 1224 Ngơ Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu... Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương – - 1225 Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium lúa TBR225 Kích thước (bp) TSL DSL TBP CBP IBP % GC On-score