Các kỹ thuật của nền sinh học hiện đại

LOGO Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) Nguyen Thi Viet Anh www.themegallery.com Nội dung 1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.1. Khái niệm 1.4. Nhân dòng gen (gene cloning) 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA 2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA 2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA 2.3. Phương pháp PCR 2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA) 2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR) 1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen 2.7. Genomic và proteomic www.themegallery.com  Ngân hàng bộ gen:  Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);  Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA): • Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…); • Bao gồm exon và intron; • VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn; • tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách dòng trong tế bào chủ; • Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi. 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA www.themegallery.com 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều đoạn khác nhau Bước 3: đoạn DNA được đưa vào vector www.themegallery.com Ngân hàng cDNA  Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);  Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);  Exon;  Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…  cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào, từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng cDNA của một cơ quan nào đó.  VD: rễ lúa www.themegallery.com www.themegallery.com www.themegallery.com Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA  Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA:  Tách chiết và tinh sạch mRNA của tế bào;  Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn mồi (primer) đặc hiệu, các loại nucleotide tự do, DNA polymerase…  mRNA tổng hợp nên cDNA;  Enzyme RNase H để phân huỷ sợi khuôn RNA;  Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2 www.themegallery.com Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA  Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm phương pháp chủ yếu:  Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA (cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S 1 nuclease cắt bỏ);  Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA.  Video cDNA libraries www.themegallery.com  Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:  Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của một gen;  Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1 loại protein;  Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA [...]... đầy đủ trình tự các nucleotide của đoạn DNA www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Hạn chế của phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert:... www.themegallery.com www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Các phương pháp xác định trình tự DNA thế hệ mới:  Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật giải trình tự 454 pyrosequencing Kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự nối với chất hố học 4 màu www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP  Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA):... www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP  Ứng dụng:  Chọn lọc các cá thể; chọn giống động thực vật;  Phát hiện các cặp gen nghiên cứu là đồng hợp hay dị hợp tử hay có liên kết gen…;  Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo quy luật Mendel;  So sánh sự tiến hố của các lồi;  So sánh sự khác nhau giữa các cá thể trong lồi www.themegallery.com Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR  Kỹ thuật. .. RFLP=Restriction fragment length polymorphism;  Dựa trên đặc điểm của các loại enzyme cắt giới hạn;  Các đoạn cắt = các “dấu vân tay” (fingerprinting) đặt trưng cho từng loại phân tử;  Bản đồ di truyền các kết quả của RFLP: xác định nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hố của các lồi sinh vật www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP  Bao gồm các bước:  Tách chiết và tinh sạch DNA;  Xử lí bằng enzyme cắt... polymorphism (các đoạn DNA đa hình được khuếch đại chọn lọc);  Các cặp mồi (primer) đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA cần nghiên cứu;  Thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi được nối thêm 1 hoặc 2 nucleotide ở đầu 3’ (hoặc 5’) của mồiđể nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao;  Cho phép phân biệt mức độ giống nhau khác nhau của các đơn vị dưới lồi (quan hệ di truyền gần nhau) www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP... (quan hệ di truyền gần nhau) www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP www.themegallery.com Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR  Kỹ thuật SSR:  SSR = Simple sequence repeat (các trình tự lặp lại đơn giản, Arbitrary primerPCR, PCR mồi tự chọn); www.themegallery.com Kỹ thuật SSR  Các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeat):     Hay còn gọi là microsatellite... định trình tự của DNA (sequencing) là biết được trình tự sắp xếp của 4 loại Nu trên chuỗi DNA www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: 1 Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của DNA; 2 Xử lí với hố học làm biến đổi 1 hay 2 base (dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và NaCl làm biến đổi Cytosine…); 3 Các Nucleotide... (hoặc ít nhất là một phần của đoạn cần khuếch đại) www.themegallery.com Phương pháp PCR  Các dạng PCR mở rộng:  RT-PCR (reverse transcripstase PCR): mRNA làm khn mẫu chuyển thành cDNA cho sự khuếch đại PCR;  Real-Time PCR: PCR định lượng, có thể biết được số lượng DNA khuếch đại trong q trình khuếch đại;  PCR-ELISA: kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đốn www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự... chế của phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert:  Khó thực hiện;  Cần nhiều thơng số tối ưu từ thí nghiệm;  Xác định nồng độ giới hạn của các chất hố học; www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp dideoxy của F Sanger: 1 Dideoxynucleotide: mất nhóm OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose (nơi gắn dNTP kế cận)dừng tổng hợp DNA; 2 4 phản ứng với... www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP  Southern blotting:  Phương pháp lai giữa các đoạn DNA mạch đơn của mẫu cần nghiên cứu với các mẫu dò đánh dấu phóng xạ (các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự)  Gồm các bước: Cắt ADN bằng men giới hạn Điện di trên gel Biến tính ADN (NaOH & NaCl) Chuyển ADN sang màng (transfer) Lai với mẫu dò được đánh dấu bằng đồng vò phóng xạ Rửa màng lai Phát hiện phân tử lai