Phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở một số tr-ờng hợp thuộc các dân tộc Kinh, Mường, Racley và Tày ở Hà Nội, Hoà Bình, và Khánh Hoà potx

TCNCYH 23 (3) 2003 Phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở một số trờng hợp thuộc các dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày ở Hà Nội, Hoà Bình, và Khánh Hoà Trần Thị Chính 1 , Nguyễn Thị Ngọc Dao 2 , Kaoru Nishiyama 3 , Taku Shirakawa 3 , Tạ Thị Tĩnh 4 , Nguyễn Trờng Giang 2 , Huỳnh Diễm Thuý 1 , Quách Xuân Hinh 5 , Đoàn Hạnh Nhân 4 , Hoàng Hạnh Phúc 6 , Vũ Triệu An 1 1 Đại Học Y Hà Nội, 2 Viện Công nghệ sinh học - Trung tâm KHTN và CNQG, 3 Đại học Tổng hợp Kobe, Nhật Bản, 4 Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ơng, 5 Viện Quân Y 10, 6 Viện Nhi trung ơng Thiếu hụt G6PD là bệnh lý enzym di truyền hồng cầu hay gặp nhất ở ngời, bệnh ảnh hởng đến trên 400 triệu ngời trên toàn thế giới. Trên 100 dạng đột biến gen mà hầu hết là đột biến điểm đã đợc công bố. Đến nay, nghiên cứu về các dạng đột biến của thiếu hụt G6PD ngời Việt Nam mới chỉ là bắt đầu. Trong nghiên cứu này 119 ngời trong tổng số 2871 ngời thuộc các dân tộc Kinh quanh Hà Nội, Mờng Hoà Bình, Racley và Tày Khánh Hoà đã đợc phát hiện có thiếu hụt G6PD. 37 mẫu DNA của 32 ngời thiếu hụt G6PD và 5 ngời bình thờng đã đợc phân tích gen. 7 dạng đột biến của 30 trờng hợp thiếu hụt G6PD đã tìm thấy, đó là Viangchan, Chatham, Chinese-5, Union, Canton, Kaiping và Silent. Dạng đột biến Union và Chinese-5 chỉ tìm thấy ở nhóm ngời Mờng, trong đó Union gặp tới 8/18 trờng hợp đợc phân tích. Cũng ở nhóm đân tộc này, có hai gia đình, trong đó bố và mẹ đều mang gen bệnh [cha lấy đợc máu của con] và 1 gia đình, mẹ và con trai đều bị bệnh dạng Canton. I. Đặt vấn đề Thiếu hụt Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase (G6PD) là bệnh lý enzym hồng cầu hay gặp nhất ở ngời [3], số ngời thiếu hụt G6PD trên toàn thế giới có khoảng trên 400 triệu [3,4,5]. Bệnh thờng gây ra tình trạng thiếu máu tan huyết sau sử dụng một vài loại thuốc, thức ăn hay nhiễm khuẩn [3]. Thiếu hụt G6PD là bệnh di truyền qua nhiễm sắc thể [NST] giới tính. Locus gen qui định cấu trúc của G6PD nằm trên nhánh dài vùng 2 băng 8 của NST X (Xq.28), gen chứa 13 exon và dài khoảng 20 Kb, exon 1 không mã hoá [5,8]. Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử thì cơ sở gen học của thiếu hụt G6PD, các dạng đột biến gen của nó đã và vẫn đang đợc nghiên cứu. Mỗi dạng đột biến gây ra những bệnh cảnh và mức độ nặng nhẹ khác nhau trớc sự tấn công của thuốc và các chất oxy hoá [1,3]. Theo y văn thế giới tỷ lệ thiếu hụt G6PD cũng nh các dạng đột biến gen của nó có sự khác nhau giữa các dân tộc và vùng địa lý. Châu á, trong đó có Việt Nam, đợc xếp vào 99 TCNCYH 23 (3) 2003 khu vực có tỷ lệ thiếu hụt G6PD cao (0,5 - 20%) [2,3,4,5]. ở nớc ta, từ những năm 70 đến nay đã có nhiều công bố về tỷ lệ thiếu hụt G6PD của một số dân tộc và địa phơng, đặc biệt ở những vùng có sốt rét lu hành [1,2]. Tuy nhiên những nghiên cứu về đột biến gen mới chỉ là bắt đầu. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở một số trờng hợp bệnh lý thuộc các dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày ở quanh Hà Nội, và các tỉnh Hoà Bình, Khánh Hoà - Việt Nam. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu: 1819 ngời Kinh trong đó 840 trẻ sơ sinh Hà Nội và 979 bệnh nhân vào khám tại Viện Quân Y 108 Hà Nội, 250 ngời Mờng Hoà Bình, 720 ngời Racley và 82 ngời Tày Khánh Hoà. 2. Phơng pháp nghiên cứu: - Máu lấy từ gót chân (trẻ sơ sinh), đầu ngón tay (ngời lớn) vào giấy Whatman 1 hoặc S&S 903, lấy máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA. - Phát hiện và đánh giá mức độ thiếu hụt: Kỹ thuật huỳnh quang định tính Kít của hãng Sigma; kỹ thuật tạo vùng Formazan bán định lợng Kít của hãng Sigma; kỹ thuật định lợng hoạt tính enzym Kít của hãng Boehringer Mannheim. - Phân tích gen: DNA tách từ máu toàn phần, chống đông bằng EDTA theo qui trình chuẩn dùng phenol và chloroforn. Phản ứng PCR dùng các cặp mồi thích hợp cho 12 exon khác nhau của G6PD, sản phẩm thu đợc sẽ là khuôn cho phản ứng PCR đặc hiệu tiếp theo để phát hiện nhanh các điểm đột biến - MPTP [Multiplex PCR using Tandem Primers] theo mô tả của Shiratawa và CS [7], kít của hãng Sigma. Thực hiện PCS lần một 6 bớc 40 chu kỳ, lần 2 MPTP 6 bớc 30 chu kỳ trên máy PCR Beckman 9700. Đọc tình tự DNA trên máy phân tích tự động Model 310 của hãng ABI Prism. Kết quả đợc xử lý bằng chơng trình tự động so sánh với dữ liệu DNA chuẩn (GENETYX MAC). - Vị trí số 1 là chứng âm - Vị trí số 2 là chứng dơng 100 TCNCYH 23 (3) 2003 - Vị trí số 25, 26, 27 là dơng tính [+] - Vị trí số 6 đợc xác định là dơng tính [++] - Vị trí 10, 12, 18 là dơng tính [+++] ảnh 1: Minh hoạ kết quả xác định thiếu hụt G6PD bằng kỹ thuật tạo vòng Fomazan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 229bp 146bp 94bp 200bp 150bp 100bp ảnh 2: Điện di sản phẩm của phản ứng MPTP - Vạch 1: Marker 50 - Vạch 2, 3: Ngời bình thờng - Vạch 4, 5, 6: Những trờng hợp không có đột biến ở exon 9 - Vạch 7: Trờng hợp có đột biến [thiếu 1 vệt] ở exon 9- Dạng Viangchan - Vạch 8: Chuẩn có đột biến dạng Viangchan ở exon 9 [thiếu 1 vệt] - Vạch 9: Nớc cất III. Kết quả Bảng 1: Phát hiện thiếu G6PD ở các dân tộc trong nhóm nghiên cứu Thiếu hụt G6PD Dân tộc Địa điểm n n % Kinh Hà Nội 1819 19 1,04 Mờng Hoà Bình 250 65 26,0 Racley Khánh Hoà 720 21 2,92 Tày Khánh Hoà 82 14 17,07 Tổng 2871 119 4,14 101 TCNCYH 23 (3) 2003 Bảng 2: Các dạng đột biến gen G6PD gặp ở các dân tộc trong nhóm nghiên cứu Vị trí biến đổi Tên dạng đột biến Exon Nucleotid Acid amin tơng ứng Viangchan 9 871 G ặ A 291 Val ặ Met Chatham 9 1003 G ặ A 335 Ala ặ Thr Chinese - 5 9 1024 C ặ T 342 Leu ặ Phe Union 11 1360 C ặ T 454 Arg ặ Cys Canton 12 1376 G ặ C 459 Arg ặ Leu Kaiping 12 1388 G ặ A 463 Arg ặ His Silent 11 1311 Cặ T TAC - TAT: Tyrosin Bảng 3: Các dạng đột biến gen G6PD gặp ở từng dân tộc Dạng đột biến Dân tộc Viangchan Viang+Sil Chatham+ Silent Chinese-5 Union Canton Kaiping Silent Tổng Kinh 0/2 1 2 1 6 Mờng 2/1 1 8 3 3 18 Racley 0/1 1 2 Tày 0/1 2 1 4 Tổng 2/5 = 7 1 1 8 8 2 3 30 IV. Bàn luận Trong nghiên cứu này, để phát hiện thiếu hụt G6PD chúng tôi sử dụng kỹ thuật tạo vòng Formazan bán định lợng, kỹ thuật huỳnh quang định tính và một số trờng hợp có định lợng hoạt tính enzym bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ. Phản ứng tạo vòng Formazan là kỹ thuật lần đầu tiên đợc sử dụng tại Việt Nam. Nó đợc nhiều nhà khoa học ở nhiều nớc trên thế giới đánh giá cao bởi tính đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện thích hợp cho sàng lọc trong cộng đồng, không đòi hỏi trang thiết bị gì nhiều ngoài những khay nhựa và một số dụng cụ thông thờng của phòng thí nghiệm [6]. Dựa vào đờng kính và đậm độ màu xanh vòng Formazan ta có thể đánh giá mức độ thiếu hụt G6PD. Kết quả sàng lọc 2871 ngời trong đó gồm 1819 ngời Kinh Hà Nội và các vùng lân cận (bệnh nhân đến khám tại Viện quân y 108), 250 ngời Mờng Hoà Bình, 720 ngời Racley và 82 ngời Tày ở Khánh Hoà, chúng tôi phát hiện đợc 119 ngời bị thiếu hụt G6PD, tỷ lệ chung trong quần thể là 4,14%. Tách riêng từng dân tộc, chúng tôi thấy tỷ lệ thiếu hụt 102 TCNCYH 23 (3) 2003 G6PD của ngời Mờng Hoà Bình là cao nhất 26% tiếp đó là Tày 17,07% rồi Racley Khánh Hoà 2,92% và thấp nhất là ngời Kinh quanh Hà Nội 1,04% (Bảng 1) nh thế tần suất thiếu hụt G6PD có sự khác nhau giữa các dân tộc, cũng giống nh nhận xét của nhiều tác giả khác [2,3,4]. Trong số 119 trờng hợp thiếu hụt G6PD của cả 4 dân tộc chúng tôi đã tiến hành phân tích gen 32 trờng hợp cùng với 5 trờng hợp ngời bình thờng. Bảng 3 là kết quả thu đợc của phân tích gen 30 trờng hợp bệnh lý, trong đó có 6 Kinh, 18 Mờng, 2 Racley và 4 Tày. Kết quả phân tích gen cho thấy tất cả có 7 dạng đột biến khác nhau [Bảng 2]. Chúng tôi không phát hiện đợc dạng nào mới cha đợc nói tới trong tổng số 100 dạng đã đợc công bố [9]. Trong 7 dạng đột biến đã tìm thấy [bảng 2] thì có 1 dạng đột biến gen nhng không ảnh hởng đến sự mã hoá acid amin trong cấu trúc G6PD, đó là dạng Silent. Vị trí biến đổi là nucleotid số 1311 ở exon 11 (C ặ T), điểm đột biến này nằm trong vị trí cuối ở codon của Tyrosine (TAC ặ TAT) nên không làm biến đổi thứ tự acid amin. 6 dạng biến đổi khác đều là những dạng hay gặp ở các dân tộc châu á nh Nhật, Trung Quốc, ấn độ, Lào, Philippin [3]. Và cùng đều là đột biến điểm, không có trờng hợp nào mất 1 hoặc vài nucleotid. Bảng 3 cho thấy các dạng đột biến gặp ở từng dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày. Nhận xét về dạng đột biến gặp ở các dân tộc này chúng tôi thấy, nhóm ngời Mờng số trờng hợp đợc phân tích nhiều nhất [18 trờng hợp] nhng không trờng hợp nào có dạng Chatham và Kaiping nh của ngời Kinh, ngợc lại Mờng là nhóm duy nhất gặp dạng Union và Chinese-5. Riêng dạng Union gặp đến 8/18 trờng hợp. Dạng Canton và Viangchan cả 4 nhóm đều có. Song có điểm đặc biệt là 7 trờng hợp đột biến dạng Viangchan thì có tới 5/7 trờng hợp có kèm với đột biến dạng Silent. Nh thế là ở những trờng hợp này có 2 đột biến của 2 dạng khác nhau. Viangchan đột biến ở exon 9, nucleotid ở vị trí 871 G ặA làm thay đổi acid amin trên enzym ở vị trí 291 Val ặ Met và Silent, đột biến ở exon 11, vị trí 1311 C ặT. Hiện tợng này cũng tơng tự nh trờng hợp đột biến dạng Chatham của một ngời Kinh đó là Chatham và Silent, cũng có hai vị trí đột biến. Song nh đã nói ở trên dạng Silent không làm thay đổi thứ tự acid amin trong cấu trúc enzym do vậy mà không làm trầm trọng thêm mức độ thiếu hụt hoạt tính enzym. Khai thác thêm từ 18 trờng hợp bệnh lý ở nhóm ngời Mờng đợc phân tích gen, chúng tôi gặp hai gia đình, trong đó cả vợ và chồng đều mang gen bệnh. Rất tiếc chúng tôi không lấy đợc máu của những ngời con để phân tích gen. Một gia đình khác, bố bình thờng mẹ và con trai cùng mang gen bệnh dạng Canton. Nh thế, trong trờng hợp này ngời con trai đã nhận gen X mang bệnh từ mẹ. Vì nam giới chỉ có 1 NST X nên nếu bị bệnh thờng là nặng. Cụ thể cháu bé này, hoạt tính enzym đo đợc chỉ có 9,0 mU/10 9 hồng cầu, trong khi của mẹ là 39,4 mU/10 6 hồng cầu [bình thờng là 131 13 mU/10 9 hồng cầu]. Một đặc biệt khác trong nhóm ngời Mờng, một trờng hợp nữ bị bệnh dạng Union nhng có hoạt tính enzym rất thấp 5,0 mU/10 9 HC, chúng tôi đã đọc trình tự gen. Kết quả đúng nh dự đoán, trờng hợp này mang gen bệnh đồng hợp tử. Điều này có nghĩa ngời con đã nhận hai gen bệnh của cả bố và mẹ, một hiện tợng rất hiếm gặp trong y văn [10]. Cũng trong nhóm này có hai trờng hợp hoạt tính enzym rất thấp nhng chúng tôi cha tìm ra đợc điểm đột biến nào trong cả 12 exon. Với những kết quả thu đợc chúng tôi có nhận xét, tỷ lệ mang gen bệnh này ở ngời Việt Nam không thấp và có sự khác nhau giữa các dân tộc và địa phơng. Tỷ lệ thiếu hụt G6PD của ngời Mờng Hoà Bình là cao hơn hẳn, phải chăng là do khác biệt HLA hoặc một tình trạng ít giao lu, kết hôn gần dòng họ, về vấn 103 TCNCYH 23 (3) 2003 đề này trong một nghiên cứu khác tìm hiểu HLA và thiếu G6PD giữa ngời Mờng và Kinh chúng tôi nhận thấy nhóm ngời Mờng có tới 8/18 trờng hợp thiếu G6PD dạng Union, trong đó 7/8 trờng hợp HLA lớp II là DQB1 * 0502 trong khi alen này không có ở ngời Kinh và ngời Kinh cũng cha tìm thấy thiếu G6PD dạng Union. Đây là vấn đề rất có ý nghĩa khoa học, chúng tôi sẽ tiếp tục tìm hiểu. Nh thế trong phạm vi nghiên cứu này với những kết quả phân tích gen tuy cha nhiều nhng với những gì có đợc, ít nhiều cũng cho chúng ta cái nhìn nào đó về sự phân bố và đặc điểm các dạng đột biến gen gây thiếu hụt G6PD gặp ở các dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày ở các địa điểm nghiên cứu của Việt Nam. V. Kết luận 1. Đã phát hiện đợc 119 trờng hợp thiếu hụt G6PD trong tổng số 2871 ngời thuộc các dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày ở Hà Nội và quanh Hà Nội, ở các tỉnh Hoà Bình, Khánh Hoà. 2. Bằng kỹ thuật PCR và MPTP và phân tích trình tự gen đã phát hiện đợc 7 dạng đột biến điểm khác nhau gây thiếu hụt G6PD từ 30 trờng hợp bệnh lý đợc phân tích. 3. Nhóm ngời Mờng có tỷ lệ thiếu hụt G6PD rất cao [26%], dạng đột biến hay gặp đó là Union [8/18 trờng hợp]. Có hai gia đình trong đó bố và mẹ đều mang gen bệnh, một gia đình, mẹ và con trai cùng bị bệnh dạng Canton. Lời cám ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS Nguyễn Thu Nhạn, TS. Nguyễn Thị Hoàn Viện Nhi khoa Trung ơng đã giúp đỡ trong việc tổ chức lấy máu trẻ sơ sinh ở Hà Nội. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Phan Thị Lý: Effects of oxidizing agent on the enzyme activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase and the membrane lipid peoxidation of human and experimental animals ethrocytes: Revue Pharmacentique numerol. 1998: p37 44. 2. Đoàn Hạnh Nhân và cộng sự : Điều tra thiếu men G6PD hồng cầu ở một số dân tộc sống trong vùng sốt rét lu hành tại miền Bắc Việt Nam. 1991 1996. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét - Ký sinh trùng và Côn trùng , Tập 1: 203 209. 3. Beutler E: G6PD deficiency blood. 1994, 84 (11): 3613 3636. 4. Iwai K; Hiromo A et al: Distribution of glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations in Southeast Asia. Human Genet. 2001, 108: 445 449. 5. Percico MG, et al.: Isolation of human glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) cDNA clones. Primary structure of the protein and unsual 5 non-coding region. 1986, Nucleic acids Res 14: 2511. 6. Pujades A; Le Lewis M, et al.: Evaluation of the blu formazan spot test for screening glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: International Journal of Hematology. 1999: 234 236. 7. Shirakawa T; Nishiyama K, et al.: A complehensive method to scan for point mutation of the glucose-6- phosphatedehydrogenase gene. 1997, Japan J. Human Genet 42: 417 423. 8. Takizawa T, et al.: Human glucose-6- phosphate dehydrogenase: Primary structure and cDNA cloning. 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 4157. 9. Vulliamy T, Luzzatto L, et al.: Hematologically important mutations: glucose- 6-phosphate dehydrogenase. 1997, Blood cell Mol Dis 23: 302 13. 104 TCNCYH 23 (3) 2003 10. Vulliamy T, et al.: Independent origin of single and double mutations in the human glucose-6-phosphate dehydrogenase gene. 1996, Human mutation 8: 311 – 318. Summary Detecting G6PD deficiency and analyzing variants of DNA mutation of some individuals with G6PD deficiency from Kinh, Muong, Racley, Tay ethnic groups living Hanoi, Hoabinh and Khanhhoa provinces G6PD deficiency is one of the most frequent hereditary enzymopathy in human, affecting more than 400 millions people worldwide. Over 100 mutations, most of which are single nucleotide substitution have been reported. Up to now investigation on the variants of mutation of Vietnamese have just been carried out. In this study, 119 G6PD deficient individuals of 2871 people belong to Kinh, Muong, Racley and Tay ethnic groups living around Hanoi, and Hoabinh, Khanhhoa provinces were dectected. 37 DNA samples of the G6PD deficient individuals [32 cases] and normal people [5 cases] have been analysed. 7 mutation variants of 30 G6PD deficient individuals have been identified, including Viangchan, Chatham, Chinese-5, Union, Canton, Kaiping and Silent. The G6PD Union and Chinese-5 were only found in the Muong ethnic, in which G6PD Union was the most predominant mutation of this ethnic [8/18 cases]. In addition, there were three Muong-families, two of which G6PD mutations in both the father and the mother were found. In the family left, we identified Canton mutation in both the mother and the son. 105 . 2003 Phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở một số trờng hợp thuộc các dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày ở Hà Nội, Hoà Bình,. phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở một số trờng hợp bệnh lý thuộc các dân tộc Kinh, Mờng, Racley và Tày ở quanh Hà Nội,