Phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở một số tr-ờng hợp thuộc các dân tộc Kinh, Mường, Racley và Tày ở Hà Nội, Hoà Bình, và Khánh Hoà potx

Trong nghiên cứu này 119 người trong tổng số 2871 người thuộc các dân tộc Kinh quanh Hà Nội, Mường Hoà Bình, Racley và Tày Khánh Hoà đã được phát hiện có thiếu hụt G6PD.. 7 dạng đột biến

Phát hiện thiếu hụt G6PD và phân tích các dạng

đột biến gen của nó ở một số trường hợp thuộc các dân tộc Kinh, Mường, Racley và Tày ở Hà Nội,

Hoà Bình, và Khánh Hoà

Trần Thị Chính 1 , Nguyễn Thị Ngọc Dao 2 , Kaoru Nishiyama 3 , Taku Shirakawa 3 , Tạ Thị Tĩnh 4 , Nguyễn Trường Giang 2 , Huỳnh Diễm Thuý 1 , Quách Xuân Hinh 5 ,

Đoàn Hạnh Nhân 4 , Hoàng Hạnh Phúc 6 ,

Vũ Triệu An 1

1 Đại Học Y Hà Nội, 2 Viện Công nghệ sinh học - Trung tâm KHTN và CNQG, 3 Đại học Tổng hợp Kobe, Nhật Bản, 4 Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương, 5 Viện Quân Y 10,

6 Viện Nhi trung ương

Thiếu hụt G6PD là bệnh lý enzym di truyền hồng cầu hay gặp nhất ở người, bệnh ảnh hưởng

đến trên 400 triệu người trên toàn thế giới Trên 100 dạng đột biến gen mà hầu hết là đột biến điểm

đã được công bố Đến nay, nghiên cứu về các dạng đột biến của thiếu hụt G6PD người Việt Nam mới chỉ là bắt đầu

Trong nghiên cứu này 119 người trong tổng số 2871 người thuộc các dân tộc Kinh quanh Hà Nội, Mường Hoà Bình, Racley và Tày Khánh Hoà đã được phát hiện có thiếu hụt G6PD 37 mẫu DNA của 32 người thiếu hụt G6PD và 5 người bình thường đã được phân tích gen 7 dạng đột biến của 30 trường hợp thiếu hụt G6PD đã tìm thấy, đó là Viangchan, Chatham, Chinese-5, Union, Canton, Kaiping và Silent Dạng đột biến Union và Chinese-5 chỉ tìm thấy ở nhóm người Mường, trong đó Union gặp tới 8/18 trường hợp được phân tích Cũng ở nhóm đân tộc này, có hai gia đình, trong đó bố và mẹ đều mang gen bệnh [chưa lấy được máu của con] và 1 gia đình, mẹ và con trai

đều bị bệnh dạng Canton

I Đặt vấn đề

Thiếu hụt Glucose 6 Phosphate

Dehydrogenase (G6PD) là bệnh lý enzym hồng

cầu hay gặp nhất ở người [3], số người thiếu

hụt G6PD trên toàn thế giới có khoảng trên 400

triệu [3,4,5] Bệnh thường gây ra tình trạng

thiếu máu tan huyết sau sử dụng một vài loại

thuốc, thức ăn hay nhiễm khuẩn [3] Thiếu hụt

G6PD là bệnh di truyền qua nhiễm sắc thể

[NST] giới tính Locus gen qui định cấu trúc

của G6PD nằm trên nhánh dài vùng 2 băng 8

của NST X (Xq.28), gen chứa 13 exon và dài khoảng 20 Kb, exon 1 không mã hoá [5,8] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử thì cơ sở gen học của thiếu hụt G6PD, các dạng

đột biến gen của nó đã và vẫn đang được nghiên cứu Mỗi dạng đột biến gây ra những bệnh cảnh và mức độ nặng nhẹ khác nhau trước

sự tấn công của thuốc và các chất oxy hoá [1,3] Theo y văn thế giới tỷ lệ thiếu hụt G6PD cũng như các dạng đột biến gen của nó có sự khác nhau giữa các dân tộc và vùng địa lý Châu á, trong đó có Việt Nam, được xếp vào

khu vực có tỷ lệ thiếu hụt G6PD cao (0,5 -

20%) [2,3,4,5] ở nước ta, từ những năm 70

đến nay đã có nhiều công bố về tỷ lệ thiếu hụt

G6PD của một số dân tộc và địa phương, đặc

biệt ở những vùng có sốt rét lưu hành [1,2]

Tuy nhiên những nghiên cứu về đột biến gen

mới chỉ là bắt đầu Trong nghiên cứu này

chúng tôi tiến hành phát hiện thiếu hụt G6PD

và phân tích các dạng đột biến gen của nó ở

một số trường hợp bệnh lý thuộc các dân tộc

Kinh, Mường, Racley và Tày ở quanh Hà Nội,

và các tỉnh Hoà Bình, Khánh Hoà - Việt Nam

II Đối tượng và phương pháp

nghiên cứu

1 Đối tượng nghiên cứu:

1819 người Kinh trong đó 840 trẻ sơ sinh

Hà Nội và 979 bệnh nhân vào khám tại Viện

Quân Y 108 Hà Nội, 250 người Mường Hoà

Bình, 720 người Racley và 82 người Tày

Khánh Hoà

2 Phương pháp nghiên cứu:

- Máu lấy từ gót chân (trẻ sơ sinh), đầu

ngón tay (người lớn) vào giấy Whatman 1 hoặc

S&S 903, lấy máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA

- Phát hiện và đánh giá mức độ thiếu hụt:

Kỹ thuật huỳnh quang định tính – Kít của hãng Sigma; kỹ thuật tạo vùng Formazan bán định lượng – Kít của hãng Sigma; kỹ thuật định lượng hoạt tính enzym – Kít của hãng Boehringer Mannheim

- Phân tích gen: DNA tách từ máu toàn phần, chống đông bằng EDTA theo qui trình chuẩn dùng phenol và chloroforn Phản ứng PCR dùng các cặp mồi thích hợp cho 12 exon khác nhau của G6PD, sản phẩm thu được sẽ là khuôn cho phản ứng PCR đặc hiệu tiếp theo để phát hiện nhanh các điểm đột biến - MPTP [Multiplex PCR using Tandem Primers] theo mô tả của Shiratawa và CS [7], kít của hãng Sigma Thực hiện PCS lần một 6 bước 40 chu

kỳ, lần 2 MPTP 6 bước 30 chu kỳ trên máy PCR Beckman 9700 Đọc tình tự DNA trên máy phân tích tự động Model 310 của hãng ABI Prism Kết quả được xử lý bằng chương trình tự động so sánh với dữ liệu DNA chuẩn (GENETYX MAC)

- Vị trí số 1 là chứng âm

- Vị trí số 2 là chứng dương

- Vị trí số 25, 26, 27 là dương tính [+]

- Vị trí số 6 được xác định là dương tính [++]

- Vị trí 10, 12, 18 là dương tính [+++]

ảnh 1: Minh hoạ kết quả xác định thiếu hụt G6PD bằng kỹ thuật tạo vòng Fomazan

1 2 3 4 5 6 7 8 9

229bp 146bp 94bp

200bp

150bp

100bp

ảnh 2: Điện di sản phẩm của phản ứng MPTP

- Vạch 1: Marker 50

- Vạch 2, 3: Người bình thường

- Vạch 4, 5, 6: Những trường hợp không có đột biến ở exon 9

- Vạch 7: Trường hợp có đột biến [thiếu 1 vệt] ở exon 9- Dạng Viangchan

- Vạch 8: Chuẩn có đột biến dạng Viangchan ở exon 9 [thiếu 1 vệt]

- Vạch 9: Nước cất

III Kết quả

Bảng 1: Phát hiện thiếu G6PD ở các dân tộc trong nhóm nghiên cứu

Thiếu hụt G6PD

n %

Bảng 2: Các dạng đột biến gen G6PD gặp ở các dân tộc trong nhóm nghiên cứu

Vị trí biến đổi Tên dạng đột biến

Exon Nucleotid

Acid amin tương ứng

Bảng 3: Các dạng đột biến gen G6PD gặp ở từng dân tộc

Dạng đột

biến

Dân tộc

Viangchan Viang+Sil

Chatham+

Silent Chinese-5 Union Canton Kaiping Silent Tổng

IV Bàn luận

Trong nghiên cứu này, để phát hiện thiếu

hụt G6PD chúng tôi sử dụng kỹ thuật tạo vòng

Formazan bán định lượng, kỹ thuật huỳnh

quang định tính và một số trường hợp có định

lượng hoạt tính enzym bằng kỹ thuật quang phổ

hấp thụ Phản ứng tạo vòng Formazan là kỹ

thuật lần đầu tiên được sử dụng tại Việt Nam

Nó được nhiều nhà khoa học ở nhiều nước trên

thế giới đánh giá cao bởi tính đơn giản, rẻ tiền,

dễ thực hiện thích hợp cho sàng lọc trong cộng

đồng, không đòi hỏi trang thiết bị gì nhiều

ngoài những khay nhựa và một số dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm [6] Dựa vào đường kính và đậm độ màu xanh vòng Formazan ta có thể đánh giá mức độ thiếu hụt G6PD

Kết quả sàng lọc 2871 người trong đó gồm

1819 người Kinh Hà Nội và các vùng lân cận (bệnh nhân đến khám tại Viện quân y 108),

250 người Mường Hoà Bình, 720 người Racley

và 82 người Tày ở Khánh Hoà, chúng tôi phát hiện được 119 người bị thiếu hụt G6PD, tỷ lệ chung trong quần thể là 4,14% Tách riêng từng dân tộc, chúng tôi thấy tỷ lệ thiếu hụt

G6PD của người Mường Hoà Bình là cao nhất

26% tiếp đó là Tày 17,07% rồi Racley Khánh

Hoà 2,92% và thấp nhất là người Kinh quanh

Hà Nội 1,04% (Bảng 1) như thế tần suất thiếu

hụt G6PD có sự khác nhau giữa các dân tộc,

cũng giống như nhận xét của nhiều tác giả khác

[2,3,4] Trong số 119 trường hợp thiếu hụt

G6PD của cả 4 dân tộc chúng tôi đã tiến hành

phân tích gen 32 trường hợp cùng với 5 trường

hợp người bình thường Bảng 3 là kết quả thu

được của phân tích gen 30 trường hợp bệnh lý,

trong đó có 6 Kinh, 18 Mường, 2 Racley và 4

Tày Kết quả phân tích gen cho thấy tất cả có 7

dạng đột biến khác nhau [Bảng 2] Chúng tôi

không phát hiện được dạng nào mới chưa được

nói tới trong tổng số 100 dạng đã được công bố

[9] Trong 7 dạng đột biến đã tìm thấy [bảng 2]

thì có 1 dạng đột biến gen nhưng không ảnh

hưởng đến sự mã hoá acid amin trong cấu trúc

G6PD, đó là dạng Silent Vị trí biến đổi là

nucleotid số 1311 ở exon 11 (C ặ T), điểm đột

biến này nằm trong vị trí cuối ở codon của

Tyrosine (TAC ặ TAT) nên không làm biến

đổi thứ tự acid amin 6 dạng biến đổi khác đều

là những dạng hay gặp ở các dân tộc châu á

như Nhật, Trung Quốc, ấn độ, Lào, Philippin

…[3] Và cùng đều là đột biến điểm, không có

trường hợp nào mất 1 hoặc vài nucleotid

Bảng 3 cho thấy các dạng đột biến gặp ở

từng dân tộc Kinh, Mường, Racley và Tày

Nhận xét về dạng đột biến gặp ở các dân tộc

này chúng tôi thấy, nhóm người Mường số

trường hợp được phân tích nhiều nhất [18

trường hợp] nhưng không trường hợp nào có

dạng Chatham và Kaiping như của người Kinh,

ngược lại Mường là nhóm duy nhất gặp dạng

Union và Chinese-5 Riêng dạng Union gặp

đến 8/18 trường hợp Dạng Canton và

Viangchan cả 4 nhóm đều có Song có điểm

đặc biệt là 7 trường hợp đột biến dạng

Viangchan thì có tới 5/7 trường hợp có kèm với

đột biến dạng Silent Như thế là ở những

trường hợp này có 2 đột biến của 2 dạng khác

nhau Viangchan đột biến ở exon 9, nucleotid ở

vị trí 871 G ặA làm thay đổi acid amin trên enzym ở vị trí 291 Val ặ Met và Silent, đột biến ở exon 11, vị trí 1311 C ặT Hiện tượng này cũng tương tự như trường hợp đột biến dạng Chatham của một người Kinh đó là Chatham và Silent, cũng có hai vị trí đột biến Song như đã nói ở trên dạng Silent không làm thay đổi thứ tự acid amin trong cấu trúc enzym

do vậy mà không làm trầm trọng thêm mức độ thiếu hụt hoạt tính enzym

Khai thác thêm từ 18 trường hợp bệnh lý ở nhóm người Mường được phân tích gen, chúng tôi gặp hai gia đình, trong đó cả vợ và chồng

đều mang gen bệnh Rất tiếc chúng tôi không lấy được máu của những người con để phân tích gen Một gia đình khác, bố bình thường mẹ

và con trai cùng mang gen bệnh dạng Canton Như thế, trong trường hợp này người con trai đã nhận gen X mang bệnh từ mẹ Vì nam giới chỉ

có 1 NST X nên nếu bị bệnh thường là nặng

Cụ thể cháu bé này, hoạt tính enzym đo được chỉ có 9,0 mU/109hồng cầu, trong khi của mẹ

là 39,4 mU/106 hồng cầu [bình thường là 131 ±

13 mU/109hồng cầu]

Một đặc biệt khác trong nhóm người Mường, một trường hợp nữ bị bệnh dạng Union nhưng có hoạt tính enzym rất thấp 5,0 mU/109HC, chúng tôi đã đọc trình tự gen Kết quả đúng như dự đoán, trường hợp này mang gen bệnh đồng hợp tử Điều này có nghĩa người con đã nhận hai gen bệnh của cả bố và mẹ, một hiện tượng rất hiếm gặp trong y văn [10] Cũng trong nhóm này có hai trường hợp hoạt tính enzym rất thấp nhưng chúng tôi chưa tìm ra

được điểm đột biến nào trong cả 12 exon Với những kết quả thu được chúng tôi có nhận xét, tỷ lệ mang gen bệnh này ở người Việt Nam không thấp và có sự khác nhau giữa các dân tộc và địa phương Tỷ lệ thiếu hụt G6PD của người Mường Hoà Bình là cao hơn hẳn, phải chăng là do khác biệt HLA hoặc một tình trạng ít giao lưu, kết hôn gần dòng họ, về vấn

đề này trong một nghiên cứu khác tìm hiểu

HLA và thiếu G6PD giữa người Mường và

Kinh chúng tôi nhận thấy nhóm người Mường

có tới 8/18 trường hợp thiếu G6PD dạng Union,

trong đó 7/8 trường hợp HLA lớp II là

DQB1*0502 trong khi alen này không có ở

người Kinh và người Kinh cũng chưa tìm thấy

thiếu G6PD dạng Union Đây là vấn đề rất có ý

nghĩa khoa học, chúng tôi sẽ tiếp tục tìm hiểu

Như thế trong phạm vi nghiên cứu này với

những kết quả phân tích gen tuy chưa nhiều

nhưng với những gì có được, ít nhiều cũng cho

chúng ta cái nhìn nào đó về sự phân bố và đặc

điểm các dạng đột biến gen gây thiếu hụt

G6PD gặp ở các dân tộc Kinh, Mường, Racley

và Tày ở các địa điểm nghiên cứu của Việt

Nam

V Kết luận

1 Đã phát hiện được 119 trường hợp thiếu

hụt G6PD trong tổng số 2871 người thuộc các

dân tộc Kinh, Mường, Racley và Tày ở Hà Nội

và quanh Hà Nội, ở các tỉnh Hoà Bình, Khánh

Hoà

2 Bằng kỹ thuật PCR và MPTP và phân tích

trình tự gen đã phát hiện được 7 dạng đột biến

điểm khác nhau gây thiếu hụt G6PD từ 30

trường hợp bệnh lý được phân tích

3 Nhóm người Mường có tỷ lệ thiếu hụt

G6PD rất cao [26%], dạng đột biến hay gặp đó

là Union [8/18 trường hợp] Có hai gia đình

trong đó bố và mẹ đều mang gen bệnh, một gia

đình, mẹ và con trai cùng bị bệnh dạng Canton

Lời cám ơn:

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn GS TS

Nguyễn Thu Nhạn, TS Nguyễn Thị Hoàn Viện

Nhi khoa Trung ương đã giúp đỡ trong việc tổ

chức lấy máu trẻ sơ sinh ở Hà Nội

Tài liệu tham khảo

1 Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Phan

Thị Lý: Effects of oxidizing agent on the

enzyme activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase and the membrane lipid peoxidation of human and experimental

animals ethrocytes: Revue Pharmacentique –

numerol 1998: p37 – 44

2 Đoàn Hạnh Nhân và cộng sự : Điều tra thiếu men G6PD hồng cầu ở một số dân tộc sống trong vùng sốt rét lưu hành tại miền Bắc Việt Nam 1991 – 1996 Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét - Ký sinh trùng và Côn trùng , Tập 1: 203 – 209

3 Beutler E: G6PD deficiency blood 1994,

84 (11): 3613 – 3636

4 Iwai K; Hiromo A et al: Distribution of

glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations

in Southeast Asia Human Genet 2001, 108:

445 449

5 Percico MG, et al.: Isolation of human glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) cDNA clones Primary structure of the protein and unsual 5’ non-coding region 1986, Nucleic acids Res 14: 2511

6 Pujades A; Le Lewis M, et al.: Evaluation of the blu formazan spot test for screening glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: International Journal of Hematology 1999: 234 – 236

7 Shirakawa T; Nishiyama K, et al.: A complehensive method to scan for point mutation of the glucose-6-phosphatedehydrogenase gene 1997, Japan J Human Genet 42: 417 – 423

8 Takizawa T, et al.: Human glucose-6-phosphate dehydrogenase: Primary structure

and cDNA cloning 1986; Proc Natl Acad

Sci USA 83: 4157

9 Vulliamy T, Luzzatto L, et al.: Hematologically important mutations: glucose-6-phosphate dehydrogenase 1997, Blood cell Mol Dis 23: 302 – 13

10 Vulliamy T, et al.: Independent origin

of single and double mutations in the human

glucose-6-phosphate dehydrogenase gene

1996, Human mutation 8: 311 – 318

Summary

Detecting G6PD deficiency and analyzing variants of DNA mutation of some individuals with G6PD deficiency from Kinh, Muong, Racley, Tay ethnic groups living

Hanoi, Hoabinh and Khanhhoa provinces

G6PD deficiency is one of the most frequent hereditary enzymopathy in human, affecting more than 400 millions people worldwide Over 100 mutations, most of which are single nucleotide substitution have been reported Up to now investigation on the variants of mutation of Vietnamese have just been carried out

In this study, 119 G6PD deficient individuals of 2871 people belong to Kinh, Muong, Racley and Tay ethnic groups living around Hanoi, and Hoabinh, Khanhhoa provinces were dectected

37 DNA samples of the G6PD deficient individuals [32 cases] and normal people [5 cases] have been analysed 7 mutation variants of 30 G6PD deficient individuals have been identified, including Viangchan, Chatham, Chinese-5, Union, Canton, Kaiping and Silent The G6PD Union and Chinese-5 were only found in the Muong ethnic, in which G6PD Union was the most predominant mutation of this ethnic [8/18 cases] In addition, there were three Muong-families, two of which G6PD mutations in both the father and the mother were found In the family left, we identified Canton mutation in both the mother and the son