Đánh giá ô nhiễm ấu trùng Sán Lá Gan nhỏ trên cá nước ngọt tại các chợ ở Hà Nội pptx

đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá n-ớc ngọt tại các chợ ở Hà Nội Nguyễn Văn Đề Viện Sốt rét, KST-CT TƯ Điều tra tại 5 chợ ở Hà Nội: Chợ Đặng Trần Côn thuộc quận Đống Đa, chợ Thanh Xuân Bắc thuộc quận Thanh Xuân, chợ Thành Công thuộc quận Ba Đình, chợ Văn Điển thuộc huyện Thanh Trì và chợ Phùng Khoang Thuộc huyện Từ Liêm. Với 10 loài cá n-ớc ngọt đ-ợc xét nghiệm (Cá mè Hypophthalmichthys molitrix, Rô phi Tilapia mossambica, Cá trắm Mylopharyngodon piceus, Cá trôi Cirrhina molitorella, Cá chày Squaliobabus curriculus, Cá chép Cyprinus carpio, Cá diếc Carassius carassius, Cá chuối Ophicephalus maculatus, L-ơn Fluta alba, Cá trê Clarias fuscus: mỗi loài xét nghiệm 60 con) có 7 loài d-ơng tính ấu trùng sán lá gan nhỏ. Loài ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tại chợ Hà Nội đ-ợc xác định là loài Clonorchis sinensis bằng hình thái học và sinh học phân tử hệ gen ty thể. sinh và gây bệnh tại đó. Nhiễm sán lá gan, I. Đặt vấn đề: ng-ời bệnh bị xơ gan và có thể bị ung th- Bệnh sán lá gan nhỏ Clononorchiasis và đ-ờng mật Cholangiocarcinoma. Opisthorchiasis l-u hành ở nhiều nơi trên thế Việt Nam là một n-ớc nông nghiệp có giới với 20 triệu ng-ời mắc và nhiễm bệnh có nghề nuôi cá từ lâu đời và đặc biệt chủ yếu liên quan đến tập quán ăn gỏi cá hoặc ăn cá nuôi cá bằng n-ớc thải, thậm chí có một số ch-a nấu chín. địa ph-ơng còn nuôi cá bằng phân ng-ời và Cá là nguồn thực phẩm không thể thiếu tập quán ăn gỏi cá phổ biến ở nhiều nơi, là đối với con ng-ời. Hiện nay thực phẩm bị ô yếu tố thuận lợi cho bệnh sán lá gan l-u hành nhiễm đang ở mức báo động, trong đó có cá. và gây ảnh h-ởng lớn đối với sức khoẻ và trở Ô nhiễm cá chủ yếu gồm 3 nhóm nguyên nên gánh nặng cho gia đình và xã hội. Hiện nhân, đó là: nhóm hoá chất bảo quản cá, các nay tại Việt Nam đã xác định ít nhất có 18 tỉnh độc chất từ cá sinh ra (cá nóc, mật cá trắm ) có bệnh sán lá gan nhỏ l-u hành, có nơi tỷ lệ và các hoá chất trong môi tr-ờng nuôi cá, đặc nhiễm 37% nh- Nam Định, Phú Yên [2,5]. Tại biệt là cá nuôi bằng n-ớc thải; nhóm vi các địa ph-ơng này hầu hết cá nuôi ở ao đều trùng/siêu vi trùng và độc chất của chúng nhiễm ấu trùng sán lá gan, có loài nhiễm tới xâm nhập vào cá; nhóm ký sinh trùng, trong 90%. Vậy, những địa ph-ơng khác, kể cả Hà đó có sán lá và một số giun truyền qua cá. Cá Nội, tình hình cá nhiễm ấu trùng sán lá gan là vật chủ trung gian của nhiều loài giun sán nhỏ ra sao? để có góp phần đ-a ra giải pháp gây bệnh cho ng-ời (Fish born helminthes) trong vệ sinh an toàn thực phẩm, việc nghiên [3]. cứu đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ Mầm bệnh giun sán truyền qua cá xâm trong cá tại chợ ở Hà Nội là hết sức cần thiết nhập vào ng-ời qua đ-ờng ăn uống một cách hiện nay, nhằm mục đích: thụ động do ăn phải cá có ấu trùng sán còn - Xác định ô nhiễm ấu trùng sán lá gan sống d-ới hình thức ăn gỏi cá hoặc ăn cá nhỏ truyền cho ng-ời trong cá n-ớc ngọt tại ch-a nấu chín kỹ. một số chợ ở Hà Nội. Khi ng-ời ăn phải ấu trùng sán lá gan - Xác định thành phần loài ấu trùng trong cá, ấu trùng theo đ-ờng mật vào gan ký sán lá gan nhỏ bằng sinh học phân tử. TCNCYH 30 (4) - 2004 + Soi tìm ấu trùng sán d-ới kính lúp hoặc II. Đối t-ợng và ph-ơng pháp kính hiển vi vật kính 10. nghiên cứu: Xác định thành phần loài bằng hình thái 1. Chọn mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu: học theo Miyazaki 1991 và Ooi 2001 [7]. - Chọn ngẫu nhiên các mẫu cá n-ớc ngọt Các ấu trùng sán đ-ợc rửa bằng n-ớc bán tại chợ ở Hà Nội đại diện cho các quận muối sinh lý và chụp ảnh qua kính hiển vi, nội thành và ngoại thành. o đồng thời l-u mẫu ở nhiệt độ 20 C. Thẩm định - Xét nghiệm kiểm tra 10 loài cá n-ớc ngọt loài bằng ph-ơng pháp sinh học phân tử hệ cho mỗi chợ và mỗi loài 60 con. gen ty thể với kỹ thuật PCR. 2. Địa điểm nghiên cứu: Tóm tắt các b-ớc của ph-ơng pháp sinh 2.1. Tại 3 chợ nội thành: học phân tử nh- sau: - Chợ Đặng Trần Côn thuộc quận Đống ! Tách chiết AND tổng số; Đa, cách trung tâm Hà Nội 5 km về phía Tây - ! Chọn mồi chung và mồi đặc hiệu; Nam. ! Thực hiện phản ứng PCR; - Chợ Thanh Xuân Bắc thuộc quận Thanh ! Dòng hoá sản phẩm; Xuân, cách trung tâm Hà Nội 9 km về phía ! Giải trình tự; Tây - Nam. ! Phân tích, xử lý theo ch-ơng trình Sinh-tin - Chợ Thành Công thuộc quận Ba Đình, học cách trung tâm Hà Nội 6 km về phía Tây - Tây-Nam. Tách chiết AND tổng số: 2.2. Tại 2 chợ ngoại thành: ADN tổng số đ-ợc tách chiết bằng bộ hoá chất Genomic-Tip Kit (QIAGEN Inc.) theo qui - Chợ Văn Điển thuộc huyện Thanh Trì, trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn nh- sau: cách trung tâm Hà Nội 15 km về phía Nam. mẫu vật bảo quản trong cồn 70% đ-ợc lấy ra - Chợ Phùng Khoang thuộc huyện Từ và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân Liêm, cách trung tâm Hà Nội 10 km về phía không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS. Mẫu Tây - Nam. vật đ-ợc nghiền kỹ và xử lý với các dung môi 3. Ph-ơng pháp nghiên cứu: của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN Xét nghiệm tìm ấu trùng sán lá gan nhỏ theo qui trình tách chiết. Hàm l-ợng ADN sử trên cá theo ph-ơng pháp tiêu cơ nhân tạo dụng cho mỗi phản ứng PCR (50 microlit) là bằng pepsin axit. khoảng 150 nanogam. Dung dịch tiêu cơ nhân tạo: Thiết kế và tổng hợp mồi PCR: - Pepsin 7 gr; Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) là gen ty thể đ-ợc chọn làm đích nghiên cứu. Cặp - HCL 11ml; mồi (primer) dùng trong nhân bản ADN đích - N-ớc muối sinh lý 8,5%: 1000ml. bằng phản ứng PCR (polymerase chain Quy trình xử lý mẫu: reaction), đ-ợc thiết kế trên cơ sở các trình tự + Cá đ-ợc lọc bỏ bớt các phần x-ơng và bảo tồn của gen cox1 có trong Ngân hàng vây. Gen, bao gồm mồi xuôi: JB3F: 5'TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT3',và + Đ-ợc nghiền nhỏ trong cối xay thịt. + Ngâm vào dung dịch tiêu cơ ít nhất 4 giờ. + Lọc bã và làm lắng cặn mồi ng-ợc: JB4.5R: 5TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG3'. Các trình tự t-ơng ứng với đoạn ADN nghiên TCNCYH 30 (4) - 2004 62 cứu từ một số quần thể thuộc họ lạc theo ph-ơng pháp kháng sinh và chỉ thị Opisthorchiidae và giống Paragonimus đã màu (SAMBROOK và RUSSELL, 2001). đ-ợc công bố (Blair và cs, 1997 LE và cs, ADN của plasmid có chứa PCR đ-ợc tách 2002) và đăng ký tại Ngân hàng Gen chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid (http://www.ncbi.nim.nih.gov) đ-ợc sử dụng Extraction Kit (QIAGEN Inc.). Chuỗi ADN để so sánh đối chiếu. đ-ợc giải trình tự trên máy giải trình tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) và thực hiện Chạy PCR, giải trình tự và chọn chuỗi so với số l-ợng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm sánh: thu đ-ợc kết quả chính xác. Sắp xếp, đối ADN đích đã đ-ợc nhân bản bằng PCR chiếu trình tự t-ơng ứng của đoạn gen bằng tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix hệ ch-ơng trình máy tính AsemblyLIGN 1.9 Kit (Promega). Chu trình nhiệt của PCR trên và Mac Vector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) Trình tự axit amin đ-ợc dịch mã theo bảng mã 0 gồm các b-ớc nh- sau: 94 C - 5 phút trong 1 di truyền mt-DNA số 21 của sán dẹt 0 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94 C - 1 phút, (platyhelminth mtDNA genetic code) giới 00 50 C - 1 phút và 72 C - 1 phút; chu kỳ cuối kéo thiệu trong Ngân hàng Gen. 0 dài 10 phút ở 72 C. Sản phẩm PCR đ-ợc tinh Các chuỗi cox1 của Clonorchis sp của chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Việt Nam sẽ đ-ợc so sánh với các loài của Purification Kit (QIAGEN Inc.) và đ-ợc dòng Trung Quốc và Hàn Quốc. hoá vào vector pCR2.1 của bộ hoá chất TA- cloning Kit (Invitrogen Inc.). Vector pCR2.1 III. Kết quả nghiên cứu tiếp nhận sản phẩm PCR đ-ợc chuyển nạp 1. Xét nghiệm cá tại 5 chợ ở Hà Nội vào dòng tế bào IVNaF' và chọn lọc khuẩn Chợ Thành Công Chợ Đặng Trần Côn Chợ Thanh Xuân Chợ Văn Điển Chợ Phùng Khoang Tổng S T T Tên chợ Tên loài cá Số XN (+) Số XN (+) Số XN (+) Số XN (+) Số XN (+) Số XN (+) 1. Cá mè Hypophthalmichthys molitrix 10 0 10 0 10 0 15 0 15 0 60 0 2. Rô phi Tilapia mossambica 10 0 10 0 10 0 15 1 (6.7%) 15 0 60 1 (1,7%) 3. Cá trắm Mylopharyngodon piceus 10 1 (10 %) 10 2 (20%) 10 0 15 3 (20%) 15 2 (13,3%) 60 8 (13,3%) 4. Cá trôi Cirrhina molitorella 10 0 10 0 10 0 15 1 (6,7%) 15 0 60 1 (1,7%) 5. Cá chày Squaliobabus curriculus 10 0 10 0 10 0 15 0 15 0 60 0 6. Cá chép Cyprinus carpio 10 0 10 0 10 0 15 1 (6,7%) 15 1 (6,7%) 60 2 (3,3%) 7. Cá diếc Carassius carassius 10 0 10 1 (10%) 10 6 (60%) 15 2 (13,3%) 15 4 (26,7%) 60 13 (21,7%) 8. Cá quả Ophicephalus maculatus 10 0 10 1 (10%) 10 0 15 1 (6,7%) 15 0 60 2 (3,3%) 9. L-ơn Fluta alba 10 0 10 0 10 0 15 0 15 0 60 0 10. Cá trê Clarias fuscus 10 0 10 0 10 0 15 2 (13,3%) 15 2 (13,3%) 60 4 (6,7%) Tổng số 100 1(1%) 100 4(4%) 100 6(6%) 150 11 (7,3%) 150 9 (6%) 600 31 (5,2%) Ghi chú: Số (+) là mẫu có ấu trùng sán lá gan nhỏ. TCNCYH 30 (4) - 2004 Bảng 1: Kết quả xét nghiệm tìm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên 10 loài cá n-ớc ngọt 63 Nhận xét: Trong số 10 loài cá ở chợ Hà Nội đ-ợc xét nghiệm, có 7 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ với tỷ lệ 1,7 - 21,7%, trung bình 5,2%. Tất cả 5 chợ đ-ợc điều tra đều có cá nhiễm ấu trùng sán lá gan, trong đó chợ Văn Điển có tới 7 loài cá nhiễm ấu trùng. Nh- vậy, tại Hà Nội cũng có thể bị nhiễm sán lá gan, nếu ăn cá ch-a nấu chín. Hình 1: ấu trùng (Metacercaria) sán lá gan nhỏ trong cá 2. Thẩm định thành phần loài sán lá gan nhỏ bằng sinh học phân tử: Giải trình trình tự nucleotit và axit amin của ấu trùng sán lá gan trên cá NUCLEOTIT CsNgTH :TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGT : 113 CsNgND : : 113 CsHNmeta : T G : 113 Cs(CN) : C : 113 Cs(Kor) : C : 113 120 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 CsNgTH : GTTGGCTATGTTTGCTATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTTACTATGATTA : 226 CsNgND : : 226 CsHNmeta : : 226 Cs(CN) : : 226 Cs(Kor) : : 226 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320 * CsNgTH : TAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTT GCTGGAACTCGGGAGCGTCTATGAGATCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTT : 336 CsNgND : : 336 CsHNmeta : : 336 Cs(CN) : : 336 Cs(Kor) : : 336 * 360 * 380 * 400 * 420 * 440 CsNgTH : TTCACTATAGGCGGGGTTACTGGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTATGTTCTATCTTT : 443 CsNgND : : 443 CsHNmeta : T : 443 Cs(CN) : T : 443 Cs(Kor) : T : 443 TCNCYH 30 (4) - 2004 64 AXIT AMIN * 20 * 40 * 60 * 80 CsNgTH : FFGHPEVYVLILPGFGMISHICTTLTGNDSLFGYGGLVLAMFAIVCLGSVVWAHHMFTVGLDLGTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFS : 86 CsNgND : : 86 CsHNmeta : : 86 Cs(CN) : : 86 Cs(Kor) : : 86 * 100 * 120 * 140 CsNgTH : WLYML-AGTRERLWDPIMWWIIGFVVLFTIGGVTGIVLSASVIDALFHDTWFVIAHFHYVLS : 147 CsNgND : : 147 CsHNmeta : : 147 Cs(CN) : : 147 Cs(Kor) : : 147 Các mẫu ấu trùng sán lá gan trên cá tại Các bệnh nhân sán lá gan từ các tỉnh về các chợ ở Hà Nội đ-ợc thẩm định bằng sinh Hà Nội điều trị đã thải ra môi tr-ờng với khối học phân tử (kỹ thuật PCR với hệ gen ty thể) l-ợng trứng sán đáng kể, làm ô nhiễm nguồn là loài Clonorchis sinensis, hệ số t-ơng đồng n-ớc thải mà việc nuôi cá bằng n-ớc thải là về nucleotid là 98,9 % và axit amin là 100% phổ biến ở Hà Nội. Đó là khả năng ô nhiễm cá so với loài Clonorchis sinensis của Trung bởi mầm bệnh giun sán ngay tại Hà Nội. Bên Quốc và Triều Tiên; so với Clonorchis cạnh đó, nguồn thực phẩm trong đó có cá sinensis trên ng-ời tại Thanh Hoá và Nam n-ớc ngọt đ-ợc mang từ các nơi về Hà Nội Định thì hệ số t-ơng đồng về nucleotit của không thể kiểm soát đ-ợc [3]. mẫu nghiên cứu là 99,3% và t-ơng đồng về Các ấu trùng sán lá gan nhỏ thu thập từ axit amin là 100%. các mẫu cá n-ớc ngọt tại chợ Hà Nội đ-ợc xác định là loài Clonorchis sinensis. T-ơng tự IV. Bàn luận: nh- thành phần loài sán lá gan nhỏ ở đồng 1. Sự ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ bằng Bắc Bộ đã đ-ợc xác định tr-ớc đây (sán trên cá n-ớc ngọt: tr-ởng thành thu thập trên bệnh nhân và ấu trùng thu thập trên cá tại vùng l-u hành bệnh) Tại 5 chợ ở Hà Nội, với 600 cá n-ớc ngọt [4,6]. Nh- vậy, chúng ta có thể điều tra ấu đ-ợc xét nghiệm bao gồm 10 loài, có 7 loài trùng sán lá gan trên cá để h-ớng tới xác định d-ơng tính ấu trùng sán lá gan nhỏ: cá diếc vùng có bệnh l-u hành. 13/60 (21,7%), cá trắm 8/60 (13,3%), cá trê 4/60 (6,7%), cá chép 2/60 (3,3%), cá quả 2/60 (3,3%), cá rô phi 1/60 (1,7%) và cá trôi V. Kết luận 1/60 (1,7%). Theo điều tra tr-ớc đây (1976 - 2000) tại vùng l-u hành bệnh sán lá gan nh- 1. Tại chợ ở Hà Nội, có 7/10 loài cá n-ớc Nam Định, có 7 trong 10 loài cá đ-ợc xác ngọt nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ: cá diếc định nhiễm ấu trùng sán lá gan, đặc biệt tỷ lệ 13/60 (21,7%), cá trắm 8/60 (13,3%), cá trê cá mè nhiễm ấu trùng sán lá gan 44 - 92% 4/60 (6,7%), cá chép 2/60 (3,3%), cá quả [1,2]. Nh- vậy, tại Hà Nội, nếu ăn cá ch-a nấu 2/60 (3,3%), cá rô phi 1/60 (1,7%) và cá trôi chín cũng sẽ có nguy cơ mắc bệnh sán lá 1/60 (1,7%). gan. Hiện nay, các nhà hàng phổ biến các 2. ấu trùng sán lá gan trên cá ở Hà Nội món lẩu cá, cá rán ch-a kỹ, cá hấp ch-a kỹ, đ-ợc thẩm định loài bằng kỹ thuật PCR với hệ thậm chí cả gỏi cá nên nguy cơ nhiễm sán lá gen ty thể là Clonorchis sinensis. gan có thể xẩy ra ngay tại Hà Nội. TCNCYH 30 (4) - 2004 Hình 2: Kết quả thẩm định bằng sinh học phân tử 65 sinh học phân tử hệ gen ty thể. Tạp chí Y học TàI liệu tham khảo Thực hành, Số 477/2004. Trang 57 - 625. 1. Lê Văn Châu, Kiều Tùng Lâm, Nguyễn 5. Nguyen Van De, KD Murrell, Le Dinh Văn Đề, Đặng Thanh Sơn, Đinh Thị Mai, Cong, Phung Dac Cam, Le Van Chau, Thạch Thị Sự: Xác định vật chủ dự trữ mầm Nguyen Duy Toan A. Dalsgaard. The Food - bệnh và vật chủ trung gian sán lá gan. Kỷ yếu borne Trematode zoonoses of Vietnam. The công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét current status of parasitic deaseases in KST - CT - TƯ. Tập 2 - 1991-1996. Trang 63 - Vietnam. Southeast asian Journal of Tropical 68. Medicine and Public Health. Volume 34 2. Nguyễn Văn Đề, Kiều Tùng Lâm, Lê Supplement 1, 2003: 12 - 34. Văn Châu, Lê Đình Công, Đặng Thanh Sơn, 6. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Văn Đề, Hà Viết Viên, Nguyễn Thị Tân và ctv: Nghiên Nguyễn Bích Nga, Đặng Thanh Sơn, Lê Đình cứu bệnh sán lá và sán dây. Thông tin phòng Công: Giám định loài sán lá gan bé Clo ở Việt chống Sốt rét và các bệnh ký sinh trùng. Số Nam bằng sinh học phân tử hệ gen ty thể. 2,1998. Trang 29 - 33. Tạp chí Phòng chống Sốt rét và KST. Số 3. Nguyễn Văn Đề: Mầm bệnh ký sinh 4/2002. Trang 30 - 35. trùng trong thực phẩm ở Việt Nam. Tạp chí 7. Ooi HK, Chen CI, Lin SC, Tung KC, Thông tin Y - D-ợc. Số 9/2003. Trang 11 -15 Wang JS, Kamiya M.: Metacercariae in 4. Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà: Giám fishes of Sun Moon Lake which is an định Metacercaria loài sán lá gan bé endemic area for Clonorchis sinensis in Clonorchis sinensis ký sinh trên cá n-ớc ngọt Taiwan. Southeast Asian J Trop Med Hyg ở Hà Nội và Nam Định bằng ph-ơng pháp Publ Hlth. 1997. 28 (Suppl 1): 222 - 223 Summary Study on Clonorchis sinensis metacercaria INfection water fish in Hanoi MARKEtS On 10 fresh water fish species (Hypophthalmichthys molitrix, Tilapia mossambica, Mylopharyngodon piceus, Cirrhina molitorella, Squaliobabus curriculus, Cyprinus carpio, Carassius carassius, Ophicephalus maculatus, Fluta alba, Clarias fuscus) from 5 markets in Hanoi City ( the Dang Tran Con market in Dong Da district, the North Thanh Xuan market in Thanh Xuan district, the Thanh Cong market in Ba Dinh district, the Van Dien market in Thanh Tri district and the Phung Khoang market in Tu Liem district) were examined to find Clonorchis metacercaria. The results showed that 7 of 10 species were infected. The Clonorchis sp metacercaria samples were identified as Clonorchis sinensis by morphology and molecular methods with mitochondrial genome. TCNCYH 30 (4) - 2004 66 . đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá n-ớc ngọt tại các chợ ở Hà Nội Nguyễn Văn Đề Viện Sốt rét, KST-CT TƯ Điều tra tại 5 chợ ở Hà Nội: Chợ. 147 Cs(Kor) : : 147 Các mẫu ấu trùng sán lá gan trên cá tại Các bệnh nhân sán lá gan từ các tỉnh về các chợ ở Hà Nội đ-ợc thẩm định bằng sinh Hà Nội điều trị