Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPNDEMS ở tôm

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐIỆN DI PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY HỘI CHỨNG AHPND/EMS Ở TÔM CHỦ NHIỆM NDNC (Ký tên) PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương ThS Đoàn Thị Quỳnh Hương CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) TĨM TẮT ĐỀ TÀI Hội chứng tơm chết sớm - EMS (Early Mortality Syndrome) bệnh hoại tử gan tụy cấp – AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) xuất tơm nhanh chóng lan rộng ảnh hưởng lớn đến phát triển ngành thủy sản nhiều quốc gia, có Việt Nam Để góp phần giảm thiểu tác hại dịch bệnh, nghiên cứu tiến hành nhằm xây dựng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây bệnh AHPND tôm với độ nhạy độ đặc hiệu cao Khi áp dụng mẫu thực tế, phương pháp PCR định tính cho thấy có tương đồng cao phương pháp PCR với phương pháp phát AHPND khác có Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp, AHPND/EMS, PCR điện di, ABSTRACT Early Mortality Syndrome – EMS or Acute Hepatopancreatic Necrosis DiseaseAHPND has appeared on shrimp in recent years, which spreads quickly and causes serious effects on the development of aquaculture industry in many countries, including Vietnam To reduce the effects of this disease, two sensitive and specific PCR methods namely electrophoresis PCR were developed to detect pathogens causing AHPND on shrimp When being applied in experimental samples, it was shown that PCR method produced highly similar results to other available AHPND detection methods Key word: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND/EMS, electrophoresis PCR i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Tóm tắt đề tài i Mục lục ii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách bảng, đồ thị v Danh mục hình vii THƠNG TIN ĐỀ TÀI ix MỞ ĐẦU x Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni tơm Việt Nam 1.2 Hội chứng tôm chết sớm - hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND) 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu Chương – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hộichứng AHPND/EMS tôm 2.2 Nội dung 2: Xác định thông số kỹ thuật qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm 12 2.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS mẫu tôm bệnh 13 Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình PCR điện di phát tác nhân gây 16 hội chứng EMS/AHPND tôm 3.1.1 Kiểm tra cặp mồi phát EMS theo cơng trình Tim Flegel 16 3.1.2 Thiết kế chứng nội IC – Internal Control 22 3.1.3 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 23 3.2 Nội dung 2: Xác định thơng số kỹ thuật qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm ii 25 3.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS mẫu tôm bệnh 33 Chương - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT EMS AHPND OIE THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Early Mortality Syndrome - Hội chứng tôm chết sớm Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - Chứng hoại tử gan - tụy cấp World Organisation for Animal Health - Tổ chức chăm sóc sức khỏe thú y quốc tế IC Internal Control - Chứng nội LOD Limit of Detection - Giới hạn phát FDA Food and Drug Administration iv DANH SÁCH BẢNG, ĐỒ THỊ Số Tên bảng Trang 1.1 Tổng hợp diện tích ni nước 10 tháng đầu năm 2014 1.2 Các tỉnh trọng điểm nuôi tôm Đồng Sông Cửu Long năm 2014 Trình tự cặp mồi phát EMS theo cơng trình Tim Flegel Trình tự Amplicon chứng dương 2.3 Thành phần và nồng ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai 10 2.5 Thành phần và nồng ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+ 10 2.6 Chu trình nhiệt củaphản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+ 11 2.7 Thành phần và nồng ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ nhạy 11 2.1 2.2 phản ứng AP3 có IC khơng có IC 2.8 Thành phần và nồng ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ đặc hiệu 12 phản ứng AP3 có cặp mồi chứng nội IC 2.9 Các mẫu dùng kiểm tra độ đặc hiệu 13 3.1 Thông số lý thuyết cặp mồi AP1R – AP1F, AP2R – AP2F, AP3R – AP3F 16 3.2 Tổng hợp kết kiểm tra hoạt động thực tế cặp mồi AP1, AP2, AP3 20 3.3 Kết đánh giá độ nhạy phân tích – LOD50 qui trình PCR điện di 25 phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm 3.4 Kết đánh giá độ đặc hiệu phân tích qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm 28 3.5 Kết đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác 29 v nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 1) 3.6 Kết đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác 30 nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 2) 3.7 Kết đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác 31 nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 3) 3.8 Kết đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác 32 nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 4) 3.9 Kết so sánh phương pháp phát AHPND/EMS PCR sử dụng cặp mồi AP3 với Kit IQ 2000 phương pháp soi gan vi 34 DANH SÁCH HÌNH Số Tên hình ảnh Trang 1.1 Bản đồ thể tỉnh trọng điểm nuôi tôm Việt Nam 1.2 Bản đồ dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm năm 2012, 2013 tháng đầu năm 2014 Việt Nam 1.3 Cấu trúc mô gan tụy tôm phân tích kỹ thuật mơ bệnh học 1.4 Dấu hiệu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy 3.1 Kết BLAST cặp mồi AP1 NCBI 17 3.2 Kết BLAST cặp mồi AP2 NCBI 17 3.3 Kết BLAST cặp mồi AP3 NCBI 18 3.4 Kết kiểm tra hoạt động thực tế cặp mồi AP1 19 3.5 Kết kiểm tra hoạt động thực tế cặp mồi AP2 19 3.6 Kết kiểm tra hoạt động thực tế cặp mồi AP3 20 3.7 Kết gióng cột trình tự sản phẩm PCR với trình tự chuẩn 22 3.8 Kết khảo sát nhiệt độ lai cặp mồi AP3 23 3.9 Kết khảo sát nồng độ Mg2+ cặp mồi AP3 24 3.10 Kết so sánh phản ứng có IC khơng có IC cặp mồi AP3 24 3.11 Kết khảo sát độ đặc hiệu phản ứng PCR có cặp mồi chứng nội IC 25 3.12 Kết điện di đánh giá độ đặc hiệu phân tích qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm 29 3.13 Kết điện di đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 1) 30 3.14 Kết điện di đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát 31 vii tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 2) 3.15 Kết điện di đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 3) 32 3.16 Kết điện di đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 4) 33 3.17 Hình điện di kết khảo sát mẫu tôm thực địa phương pháp PCR với cặp mồi AP3 tối ưu 36 viii Mẫu ST-B3 pha loãng 1000 lần (Giếng 9-12) + + + + 4/4 + + + + 848bp 333bp Hình 3.16 Kết điện di đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 4) Các kết thu từ thí nghiệm cho thấy kết lần lặp lại Phản ứng có thành phần ổn định hoạt động tốt 3.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS mẫu tôm bệnh Nhằm bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS, 32 mẫu tơm Sóc Trăng, Cà Mau thu thập cố định cồn với kết tế bào học kết PCR kit IQ2000 Sau tiến hành phương pháp PCR bao gồm tách chiết DNA, thực phản ứng PCR điện di thu nhận kết trình bày Bảng 3.9 34 Bảng 3.9 Kết so sánh phương pháp phát AHPND/EMS PCR sử dụng cặp mồi AP3 với Kit IQ 2000 phương pháp soi gan TÊN KQ SOI IQ MẪU GAN 2000 ST-L1 STT AP1 AP2 AP3 Lành - - - ST-N1 Yếu - - - ST-N2 Yếu - - - ST-N3 Yếu - - + mờ ST-B1 Bệnh - - - ST-B2 Bệnh - - + ST-B3 Bệnh + + + ST-B4 Bệnh - - - ST-B5 Bệnh - - - 10 ST-B6 Bệnh - - + 11 ST-B7 Bệnh - - - 12 ST-B8 Bệnh - - - 13 IQ-B1 + + + + 14 IQ-B2 + + + + 15 IQ-B3 + + + + 16 IQ-B4 + + + + 17 IQ-B5 + + - + 35 Ghi Chỉ dương AP3 Chỉ dương AP3 Chỉ dương AP3 18 ST-N4 Yếu - - - 19 ST-N5 Yếu - - - 20 ST-B9 Bệnh - - - 21 ST-B10 Bệnh - - - 22 ST-B11 Bệnh - - - 23 ST-B12 Bệnh - - - 24 ST-B13 Bệnh + + + 25 ST-B14 Bệnh - - + 26 ST-B15 Bệnh + + + 27 ST-B16 Bệnh - - - 28 ST-B17 Bệnh - - + 29 ST-B18 Bệnh - - - 30 ST-B19 Bệnh - - - 31 ST-B20 Bệnh - - - 32 ST-B21 Bệnh - - - TỔNG (+) 8/32 7/32 13/32 TỶ LỆ (+) 25% 36 21,8% 40,6% Chỉ dương AP3 Chỉ dương AP3 848bp 333bp 848bp 333bp Hình 3.17 Hình điện di kết khảo sát mẫu tôm thực địa phương pháp PCR với cặp mồi AP3 tối ưu Phản ứng PCR có lúc sản phẩm phát 848 bp chứng nội khuếch đại DNA tôm 333 bp phát trình tự đặc hiệu tác nhân gây bệnh AHPND/EMS Các chứng nội thể kiểm soát hoạt động phản ứng PCR, với phản ứng âm tính với AHPND/EMS có xuất vạch 848 bp chứng nội, chứng tỏ phản ứng hoạt động tốt Một số phản ứng dương tính xuất lúc vạch 848 333 bp, kết tương ứng với kết phản ứng khơng có chứng nội, chứng tỏ chứng nội không ảnh hưởng đến khả khuếch đại gen mục tiêu Các mẫu B14, IB1, IB2, IB3, IB4, IB5 dương tính với AHPND/EMS với vạch 333 bp khơng có vạch 848, biểu mẫu có nồng độ nhiễm AHPND cao, cạnh tranh với chứng nội, chứng nội thiết kế để cạnh tranh với gen mục tiêu Ngoài mẫu L1 N1 không xuất vạch kết quả, kể khơng có chứng nội, kết khơng có giá trị đọc kết khơng thể xác định phản ứng có hoạt động hay khơng Nguyên nhân mẫu thường DNA mẫu có chất ức chế nồng độ cao gây ức chế phản ứng Các mẫu pha lỗng thực lại phản ứng, kết trình bày Bảng 3.9 Theo kết Bảng 3.9 cho thấy có 13 mẫu tơm dương tính AHPND với phương pháp PCR điện di, chiếm tỷ lệ 40,6% Trong tổng số 32 mẫu tơm thu thập được, có mẫu tơm có kết soi gan bình thường khơng cho tín hiệu dương tính, mẫu dương tính với AHPND tổng số mẫu có kết tế bào học gan yếu Bên cạnh đó, tổng số 21 mẫu tơm 37 bệnh có kết soi gan bất thường, phương pháp AP3 điện di phát mẫu tơm có độc tố AHPND Các mẫu tơm có bất thường hình thái tế bào gan âm tính với phương pháp PCR mẫu tơm có gan yếu ngun nhân khác độ khống, độ chua, ao ni tơm không phù hợp, tôm bị phá hủy gan tụy sử dụng kháng sinh liều xâm nhiễm vi khuẩn, virus gây bệnh gan tụy khác Thêm nữa, mẫu tơm dương tính với kit IQ2000 cho kết dương tính với phương pháp PCR xây dựng Kết cho thấy phương pháp PCR xây dựng cho kết phù hợp với kết tế bào học, kết PCR điện di kit IQ2000 Phương pháp PCR có ưu điểm theo tiêu chí thời gian nhanh so với pp thông thường - 3h để xác đinh tác nhân gây bệnh; độ xác cao dùng cặp mồi đặc hiệu cho gen tác nhân gây bệnh cần xác định; tính kinh tế với việc phát bệnh nhanh xác tác nhân gây bệnh giai đoạn sớm giúp ngăn ngừa, giảm thiệt hại kinh tế cho người nơng dân; tính phổ cập việc trang bị thiết bị chạy PCR phịng thí nghiệm khơng cịn q tốn chi phí 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài hoàn thành mục tiêu “Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tơm” Phương pháp PCR điện di có độ đặc hiệu độ nhạy LOD50 269 copy/ phản ứng, cho kết tương đồng phù hợp với kết tế bào học kết kit IQ 2000 Phương pháp PCR cho kết phát xác tác nhân gây AHPND/EMS tơm thời gian vòng Thành phần Mix PCR: 2,5 µl h-Taq buffer 10X, 0,5 µl dNTP 10mM, µl MgCl2 25 mM, 0,5 µl Primer AP3-F/R 25µM, 0,25 µl Primer IC (WSSV-IC-143F/145R) 10µM, 0,4 µl h-Taq enzyme, 13,85 µl H2O Bổ sung 5µl dịch DNA mẫu thực chương trình 950C 15 phút; 40 chu kỳ 950C 20 giây - 530C 30 giây - 720C 30 giây; 720C phút Các thông số kỹ thuật quy trình là: Độ nhạy phân tích – LOD50 : 269,5 copies/phản ứng, khoảng tin cậy (CI=95%): 158,9457,3 copies/phản ứng ; Độ đặc hiệu phân tích: Cho kết âm tính với mẫu chứa: Escherichia coli O157, Shigella dysenteriae , Salmonella typhi, Vibrio cholera, chủng Vibrio parahaemolyticus không gây AHPND, IHHNV, WSSV, EHP, HePV, NHPB, MBV Độ lặp lại: độ lặp lại 100% Độ ổn định: 1250 copies/phản ứng 4.2 Kiến nghị Tuy nhiên phương pháp cịn có giới hạn ổn định mức 1250 copy/ phản ứng, giới hạn nằm đặc tính cặp mồi AP3 sử dụng, tương tự Flegel công bố Để cải thiện độ nhạy nghiên cứu nên tiến hành tối ưu điều kiện phản ứng phát triển thêm phương pháp real-time PCR để có khả cải thiện độ nhạy phương pháp 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO FAO (2013) Report of the FAO/MARD Technical Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) or Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) of Cultured Shrimp (under TCP/VIE/3304) Hanoi, Viet Nam, 25–27 June 2013 FAO Fisheries and Aquaculture Report No 1053, FAO, Rome, Italy, 54 pp Flegel, T.W (2014), New and Improved PCR Detection Method for EMS/AHPND Flegel, T.W., Lo, C.F (2013), Announcement regarding free release of primers for specific detection of bacterial isolates that cause acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) Han, J.E., Tang, K.F.J., Lightner, D.V., Tran, L (2015), Photorhabdus insect related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acutehepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp, Dis Aquat Org., 113, pp 33–40 Kondo, H., Hirono, I (2014), Draft genome sequences of six strains of V.parahaemolyticus isolated from early mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease shrimp in Thailand Lightner, D.V., Redman, R.M., Pantoja, C.R., Noble, B.L., and Tran, L.H (2012), Early mortality syndrome affects shrimp in Asia Global Aquaculture Advocate, 212:40 Nunan, L., Lightner, D., Pantoja, C., and Jimenez, C.S (2014), Detection of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Mexico Tran, L., Hoang, P., Nguyen, T., and Lightner, D.V (2013), Study to determine the infection route of the agent of the acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPNS) or early mortality syndrome (EMS) Tran, L., Nunan, L., Redman, R.M., Mohney, L.L., Pantoja, C.R., Fitzsimmons, K., and Lightner, D.V (2013), Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp Diseases of Aquatic Organisms 105, pp 45-55 40 PHỤ LỤC 41 42 Kết gióng cột mẫu với trình tự mục tiêu (target) * Mẫu ST-B3 | | | | | | | | | | | | 15 25 35 45 55 ST-B3 F ~~~~~~~~~~ ~ATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C~~TATTCTC ~ACGATTGGA ST-B3 R ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~N C~~TCATTTC TACGATTGGA Target ~~~~~~~~~~ ~ATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C~~TATTCTC ~ACGATTGGA | | | | | | | | | | | | 65 75 85 95 105 115 ST-B3 F CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA~~GA AGTA~~~~GA CAGCAAACAT ~ACACCTATC ST-B3 R CTGTCGA~CC AAACGGAGGC GTCACA~~GA AGTA~~~~GA CAGCAAACAT ~ACACCTATC Target CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA~~GA AGTA~~~~GA CAGCAAACAT ~ACACCTATC | | | | | | | | | | | | 125 135 145 155 165 175 ST-B3 F ATCCCG~GAA GTCGGTCGTA GTGTAG~~AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC ST-B3 R ATCCCGGAA~ GTCGGTCGTA GTGTAG~~AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC Target ATCCCG~GAA GTCGGTCGTA GTGTAG~~AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC | | | | | | | | | | | | 185 195 205 215 225 235 ST-B3 F AT~TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA ST-B3 R AT~TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA Target AT~TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA | | | | | | | | | | | | 245 255 265 275 285 295 ST-B3 F TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC~CATT TACAA~~CGC CCTGATAATG CATTCTATCA ST-B3 R TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC~CATT TACAA~~CGC CCTGATAATG CATTCTATCA Target TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC~CATT TACAA~~CGC CCTGATAATG CATTCTATCA | | | | | | | | | | | | 305 315 325 335 345 355 ST-B3 F TCAGCGTATT GT~GTAAT~A ACAATG~CGC T~GNCG~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ST-B3 R TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA Target TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA | | | 365 375 ST-B3 F ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ ST-B3 R CA~~~~~~~~ ~~~~~~~~ Target C~~~~~~~~~ ~~~~~~~~ 43 Mẫu IQ1 | | | | | | | | | | | | 15 25 35 45 55 IQ1 F -TTGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA IQ1 R -TTGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA Target -ATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA | | | | | | | | | | | | 65 75 85 95 105 115 IQ1 F CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC IQ1 R CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC Target CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC | | | | | | | | | | | | 125 135 145 155 165 175 IQ1 F ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAGACA- -TTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC IQ1 R ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC Target ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAGACA- -TTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC | | | | | | | | | | | | 185 195 205 215 225 235 IQ1 F AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA IQ1 R AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA Target AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA | | | | | | | | | | | | 245 255 265 275 285 295 IQ1 F TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA IQ1 R TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA Target TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA | | | | | | | | | | | | 305 315 325 335 345 355 IQ1 F TCAGCGTATT GT-GTAAT-A ACAATG-CGA T-GNNN -IQ1 R TCAGCGTATT GT-GTAATAA -CAATG-CGA T-GNNN -Target TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA | | | 44 IQ1 F IQ1 R Target 365 375 - -C - Mẫu IQ5 | | | | | | | | | | | | 15 25 35 45 55 IQ5 F -N N NCATTTC TACGATTGGA IQ5 R -ATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA Target -ATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA | | | | | | | | | | | | 65 75 85 95 105 115 IQ5 F CTGTCGA-CC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC IQ5 R CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC Target CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC | | | | | | | | | | | | 125 135 145 155 165 175 IQ5 F ATCCCGGAA- GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC IQ5 R ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC Target ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC | | | | | | | | | | | | 185 195 205 215 225 235 IQ5 F AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA IQ5 R AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA Target AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA | | | | | | | | | | | | 245 255 265 275 285 295 IQ5 F TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA IQ5 R TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA Target TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA | | | | | | | | | | | | 305 315 325 335 345 355 45 IQ5 F TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA IQ5 R TCAGCGTATT GT-GTAATAA -CAATG-CGC T-NNNG -Target TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA | | | 365 375 IQ5 F CA -IQ5 R -Target C - Mẫu ST-B13 | | | | | | | | | | | | 15 25 35 45 55 ST-B13 F -N N NN AAT TCTC CGAT ST-B13 R -ATGAG TAACAATATA AAACATGAAA CTGAC TAT TCTCACGAT Target -ATGAG TAACAATATA AAACATGAAA CTGAC TAT TCTC-ACGAT | | | | | | | | | | | | 65 75 85 95 105 115 ST-B13 F TGGACTGTCG A-CCAAACGG AGGCGTCACA GAAGTA GACAGCAA ACAT-ACACC ST-B13 R TGGACTGTCG AACCAAACGG AGGCGTCACA GAAGTA GACAGCAA ACAT-ACACC Target TGGACTGTCG AACCAAACGG AGGCGTCACA GAAGTA GACAGCAA ACAT-ACACC | | | | | | | | | | | | 125 135 145 155 165 175 ST-B13 F TATCATCCCG GAA-GTCGGT CGTAGTGTAG ACATTGAG AATACGGGAC GTGGGGAGCT ST-B13 R TATCATCCCG -GAAGTCGGT CGTAGTGTAG ACATTGAG AATACGGGAC GTGGGGAGCT Target TATCATCCCG -GAAGTCGGT CGTAGTGTAG ACATTGAG AATACGGGAC GTGGGGAGCT | | | | | | | | | | | | 185 195 205 215 225 235 ST-B13 F TACCAT-TCA ATACCAATGG GGTGCGCCAT TTATGGCTGG CGGCTGGAAA GTGGCTAAAT ST-B13 R TACCAT-TCA ATACCAATGG GGTGCGCCAT TTATGGCTGG CGGCTGGAAA GTGGCTAAAT Target TACCAT-TCA ATACCAATGG GGTGCGCCAT TTATGGCTGG CGGCTGGAAA GTGGCTAAAT | | | | | | | | | | | | 245 255 265 275 285 295 ST-B13 F CACATGTGGT ACAACGTGAT GAAACTTAC- CATTTACAA- -CGCCCTGAT AATGCATTCT ST-B13 R CACATGTGGT ACAACGTGAT GAAACTTAC- CATTTACAA- -CGCCCTGAT AATGCATTCT 46 Target CACATGTGGT ACAACGTGAT GAAACTTAC- CATTTACAA- -CGCCCTGAT AATGCATTCT | | | | | | | | | | | | 305 315 325 335 345 355 ST-B13 F ATCATCAGCG TATTGTTGTA ATTAACAATG GCGCTAGTCG TGGTTTCTGT ACAATCTATT ST-B13 R ATCATCAGCG TATTGT-GTA ATAA-CAATG -CGCG-NNN- -Target ATCATCAGCG TATTGTTGTA ATTAACAATG GCGCTAGTCG TGGTTTCTGT ACAATCTATT | | | | 365 375 ST-B13 F ACCACA -ST-B13 R -Target ACCAC - Mẫu ST-B15 | | | | | | | | | | | | 15 25 35 45 55 ST-B15 F -N N NNAATTC TACGATTGGA ST-B15 R TATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA Target -ATGAGTAAC AATATAAAAC ATGAAACTGA C TATTCTC ACGATTGGA | | | | | | | | | | | | 65 75 85 95 105 115 ST-B15 F CTGTCGA-CC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC ST-B15 R CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC Target CTGTCGAACC AAACGGAGGC GTCACA GA AGTA GA CAGCAAACAT ACACCTATC | | | | | | | | | | | | 125 135 145 155 165 175 ST-B15 F ATCCCGGAA- GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC ST-B15 R ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC Target ATCCCG-GAA GTCGGTCGTA GTGTAG AC ATTGAGAATA CGGGACGTGG GGAGCTTACC | | | | | | | | | | | | 185 195 205 215 225 235 ST-B15 F AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA ST-B15 R AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA Target AT-TCAATAC CAATGGGGTG CGCCATTTAT GGCTGGCGGC TGGAAAGTGG CTAAATCACA | | | | | | | | | | | | 47 245 255 265 275 285 295 ST-B15 F TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA ST-B15 R TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA Target TGTGGTACAA CGTGATGAAA CTTAC-CATT TACAA CGC CCTGATAATG CATTCTATCA | | | | | | | | | | | | 305 315 325 335 345 355 ST-B15 F TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA ST-B15 R TCAGCGTATT GT-GTAATAA -CAATG-CGC T-GGNN -Target TCAGCGTATT GTTGTAATTA ACAATGGCGC TAGTCGTGGT TTCTGTACAA TCTATTACCA | | | 365 375 ST-B15 F CAA - -ST-B15 R -Target C - 48 ... thơng số kỹ thuật qui trình PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm ii 25 3.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS... PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 1) 30 3.14 Kết điện di đánh giá độ lặp lại qui trình PCR điện di phát 31 vii tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS tôm (lần 2) 3.15 Kết điện. .. đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS mẫu tôm bệnh Nhằm bước đầu đánh giá hiệu sử dụng phương pháp PCR điện di phát tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS,